Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии
Summary
Конфокальной микроскопии Покадровый является мощным средством полезно для характеристики эмбрионального развития. Здесь мы описываем методологию и охарактеризовать черепно-лицевой морфогенез в дикого типа, а также PDGFRA, smad5 и SMO мутантные эмбрионы.
Abstract
Покадровой обработки изображений является метод, который позволяет для прямого наблюдения процесса формообразования, или генерация формы. Благодаря своей оптической прозрачности и аменабельности к генетической манипуляции, данио эмбрионов стал популярным модельным организмом, с которой для выполнения покадровой анализ формообразования в живых эмбрионов. Конфокальной визуализации живого данио эмбриона требует, чтобы ткань интерес упорно метили флуоресцентным маркером, таким как трансгена или вводили краситель. Процесс требует, чтобы эмбрион находится под наркозом и удерживается на месте таким образом, что здоровое развитие протекает нормально. Параметры для визуализации необходимо установить для учета для трехмерного роста и сбалансировать требования решении отдельных клеток при получении быстрые снимки развития. Наши результаты демонстрируют способность выполнять долгосрочный в естественных изображений флуоресцентных меченных эмбрионов данио и обнаруживать различные поведения тканей вчерепная нервного гребня, которые вызывают черепно-лицевые аномалии. Развивающие задержки, вызванные анестезией и монтажа минимальны, и эмбрионы невредимым процессом. Покадровый отображаемого эмбрионы могут быть возвращены в жидкой среде, а затем отображены или фиксированной на более поздних точек в развитии. С увеличением обилия трансгенных данио линий и хорошо характеризуется отображением судьбы и методов трансплантации, визуализации любого желаемого ткани можно. Таким образом, покадровой в естественных изображений сочетает мощно с данио генетических методов, в том числе анализа мутантных и микроинъекции эмбрионы.
Introduction
Черепно-лицевой морфогенез является сложным многоэтапным процессом, который требует скоординированных взаимодействий между несколькими типами клеток. Большинство черепно-скелета происходит от клеток нервного гребня, многие из которых должен мигрировать из дорсальной части нервной трубки в переходных структурах, называемых глоточных арки 1. Как и во многих тканях, морфогенез черепно-лицевой скелет является более сложным, чем можно понять, статических изображений эмбрионов в конкретных развития времени. Хотя это занимает много времени для выполнения, в естественных условиях покадровой микроскопии обеспечивает непрерывный взгляд на клетки развивающегося эмбриона и тканей. Каждое изображение в серии покадровой придает контекст с другими, и помогает следователь движение к выведению почему явление происходит, а не выводя то, что происходит в это время.
В естественных изображений, таким образом, мощным описательный инструмент для экспериментальных подходов кдеконструировать пути, которые ведут морфогенез. Данио рерио Данио является популярным генетическая модель позвоночных эмбрионального развития, и особенно хорошо подходит для работы с изображениями в естественных морфогенеза. Современные, удобные методы трансгенеза и геномной модификации быстро развиваются количество инструментов, доступных для рыбок данио исследователей. Эти инструменты повышения уже надежные методы для генетических манипуляций и микроскопии. В естественных изображений практически любого ткани практически в любой желаемой генетической контексте ближе к реальности, чем фантазии.
Морфогенетические движения фарингеальных дуг руководствуются взаимодействия между нервного гребня и прилегающей эпителия, как эктодермы и энтодермы сигнализации. Есть множество сигнальных молекул, выраженные эпителия, которые необходимы для управления морфогенез черепно-лицевых скелетных элементов. Среди этих сигнальных молекул, Еж Соник (Тсс) является критически важным еили черепно-лицевого развития 2-8. Тсс выражается как в устной эктодермы и глотки энтодермы 2,6,9,10. Экспрессия Shh в энтодерме регулирует морфогенетические движения арок 10, структурирование нервного гребня в арках 10, и роста черепно-лицевой скелет 11.
Сигнализации Bmp также критически важно для черепно-лицевого развития 12 и может изменить морфогенез фарингеальных дуг. Сигнализации Bmp регулирует спинной / вентральной паттерна гребня внутри фарингеальных дуг 13,14. Срыв smad5 у рыбок данио вызывает серьезные дефекты небные и отказ хрящей в Меккеля на предохранитель соответствующим по срединной линии 15. Кроме того, мутанты также отображать сокращения и слияния в вентральной элементов хряща, с 2-го, 3-го, а иногда и 4-й глотки арки элементов, слитых на средней линии 15. Эти гибриды настоятельно рекомендую, что передача сигналов Bmp направляет морфогенез этих глотки элементов.
Сигнализации PDGF необходимо для черепно-лицевого развития, но имеет неизвестные роли в глотки арки формообразования. Оба мышей и рыбок данио мутанты PDGFRA имеют глубокое средней зоны лица clefting 16-18. По крайней мере, у рыбок данио это средней зоны лица clefting является из-за сбоя надлежащего миграции клеток нервного гребня 16. Клетки нервного гребня продолжают выражать PDGFRA после того как они вошли в глотки арки. Кроме того, PDGF лиганды выражаются лица эпителия и в фарингеальных дуг 16,19,20, таким образом сигнализации PDGF может также играть роль в морфогенезе фарингеальных дуг следующих миграции. Тем не менее, анализ морфогенеза фарингеальных дуг в PDGFRA мутантов не были выполнены.
Здесь мы демонстрируем в естественных условиях конфокальной микроскопии pharyngulстадии трансгенных данио и описать морфогенез фарингеальных дуг в течение этого периода. Мы также продемонстрировать, ткани поведения, которые страдают от мутаций, которые нарушают BMP, PDGF и Тсс сигнальные пути.
Protocol
Representative Results
Discussion
Покадровый конфокальной микроскопии является мощным инструментом для анализа развития. Здесь мы демонстрируем полезность метода в изучении глотки арки морфогенез у рыбок данио, которые мутант для важных сигнальных использованием трансгенных что помечает клетки нервного гребня. В д?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мелисса Гриффин и Дженна Rozacky для их квалифицированного ухода рыбы. ДПМ благодаря EGN для написания помощь, щедрость и терпение. Эта работа была поддержана NIH / NIDCR R01DE020884 чтобы JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Riferimenti
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
