Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie
Summary
Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.
Abstract
Zeitraffer-Bildgebung ist eine Technik, die für die direkte Beobachtung des Prozesses der Morphogenese ermöglicht, oder die Erzeugung der Form. Durch ihre optische Klarheit und Zugänglichkeit für genetische Manipulation hat der Zebrafisch-Embryos zu einem beliebten Modellorganismus, mit der Zeitraffer-Analyse der Morphogenese in lebenden Embryonen durchzuführen. Konfokale Bildgebung eines lebenden Zebrafischembryo erfordert, dass ein Gewebe von Interesse ist, die dauerhaft mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist, wie einem Transgen oder Farbstoff injiziert. Der Prozess verlangt, dass der Embryo wird betäubt und an Ort und Stelle in einer Weise, dass eine gesunde Entwicklung normal verläuft statt. Parameter für die Bildgebung muss auf für dreidimensionale Wachstum Rechnung zu tragen und die Anforderungen der einzelnen Zellen zu lösen, während sich schnelle Schnappschüsse der Entwicklung auszugleichen. Unsere Ergebnisse zeigen die Fähigkeit, langfristige In-vivo-Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zebrafisch-Embryonen durchzuführen und abwechslungsreiches Gewebe Verhaltensweisen erkennendie Schädel Neuralleiste, die kraniofaziale Anomalien verursachen. Entwicklungsverzögerungen, die durch Anästhesie und Montage verursacht werden, sind minimal, und Embryonen sind unversehrt durch den Prozess. Time-lapse abgebildet Embryonen zu flüssigen Medium bei später Punkte in der Entwicklung zurückgebracht werden und anschließend abgebildet oder fixiert. Mit einer zunehmenden Fülle von transgenen Zebrafischlinien und gut charakterisierten Schicksal Mapping-und Transplantationstechniken, Imaging ist eine beliebige Gewebe möglich. Als solche Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung kombiniert kraftvoll mit Zebrafisch-genetischer Methoden, einschließlich der Analyse von Mutanten und mikroinjizierten Embryonen.
Introduction
Kraniofazialen Morphogenese ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, die koordinierte Wechselwirkungen zwischen mehreren Zelltypen erfordert. Die Mehrheit der kraniofazialen Skelett aus Neuralleistenzellen stammen, müssen von denen viele aus dem dorsalen Neuralrohr in transienten Strukturen genannt Pharyngealbögen 1 migrieren. Wie bei vielen Geweben ist Morphogenese des kraniofazialen Skeletts komplizierter, als durch statische Bilder von Embryonen in bestimmten Entwicklungszeitpunkten zu verstehen. Obwohl es zeitaufwendig durchzuführen, stellt in vivo Zeitraffermikroskopie einen kontinuierlichen Blick auf Zellen und Gewebe eines sich entwickelnden Embryos. Jedes Bild in einem Zeitraffer-Serie verleiht Kontext zu den anderen, und hilft, einen Ermittler bewegen sich abzuleiten, warum ein Phänomen tritt nicht abzuleiten, was zu dieser Zeit auftreten.
In-vivo-Bildgebung ist somit ein leistungsfähiges Werkzeug für die experimentelle deskriptive Ansätze zurdekonstruieren die Wege, die Morphogenese zu führen. Der Zebrafisch Danio rerio ist eine beliebte genetische Modell für die Wirbel embryonalen Entwicklung und ist besonders gut für die in vivo-Abbildung von Morphogenese geeignet. Moderne, bequeme Methoden zur Transgenese und genomische Modifikation schnell voran die Anzahl der Werkzeuge zur Verfügung, Zebrafisch-Forscher. Diese Tools verbessern bereits robuste Methoden zur genetischen Manipulation und Mikroskopie. In-vivo-Bildgebung von fast jedem Gewebe in fast jeder gewünschten genetischen Zusammenhang ist näher an der Realität als Phantasie.
Morphogenetischen Bewegungen der Schlundbögen werden durch Signal Wechselwirkungen zwischen der Neuralleiste und dem benachbarten Epithelien, sowohl Ektoderm und Entoderm geführt. Es gibt zahlreiche Signalmoleküle durch die Epithelien exprimiert, die notwendig sind, um die Morphogenese der Gesichtsschädelskelettelemente fahren. Unter diesen Signalmoleküle, Sonic Hedgehog (Shh) ist von entscheidender Bedeutung foder kraniofazialen Entwicklung 8.2. Shh wird sowohl durch die orale Ektoderm und Entoderm Rachen 2,6,9,10 ausgedrückt. Die Expression von Shh im Endoderm regelt morphogenetischen Bewegungen der Bögen 10, Strukturierung Neuralleiste in den Bögen 10, und das Wachstum des Gesichtsschädelskelett 11.
BMP-Signal ist auch für die kraniofaziale Entwicklung 12 von entscheidender Bedeutung und kann Morphogenese der Schlundbögen ändern. Bmp Signalweg reguliert dorsalen / ventralen Musterbildung im Wappen der Schlundbögen 13,14. Störung der Smad5 im Zebrafisch führt zu schweren Gaumendefekte und ein Ausfall des Meckel-Knorpel, angemessen an der Mittellinie 15 zu verschmelzen. Darüber hinaus sind die Mutanten und Fusions Reduktionen in den ventralen Knorpelelemente mit der 2., 3., 4. und manchmal Pharyngealbogen Elemente an der Mittellinie 15 verschmolzen zeigen auch. Diese Fusionen stark vermuten, dass BMP-Signal leitet die Morphogenese dieser Rachen-Elemente.
PDGF-Signalisierung ist für kraniofaziale Entwicklung notwendig, hat unbekannte Rollen in Pharyngealbogen Morphogenese aber. Sowohl Maus und Zebrafisch-Mutanten PDGFRA haben tiefgreifende Mittelgesichts clefting 16-18. Zumindest in dieser Zebrafisch Mittelgesichtsspaltbildung ist aufgrund eines Fehlers der richtigen Neuralleiste Zellmigration 16. Neuralleistenzellen weiterhin PDGFRA äußern, nachdem sie die Schlundbögen eingetragen. Zusätzlich werden PDGF-Liganden durch Gesichts Epithelien exprimiert und in den Kiemenbögen 16,19,20, damit PDGF-Signal könnte auch in der Morphogenese der Schlundbögen nach der Migration eine Rolle spielen. Allerdings Analysen der Morphogenese der Schlundbögen in PDGFRA Mutanten wurden nicht durchgeführt.
In vivo-Konfokalmikroskopie pharyngul Hier zeigen wir,a-Phase transgenen Zebrafisch und beschreiben Sie die Morphogenese der Schlundbögen innerhalb dieses Zeitraums. Wir zeigen weiter, Gewebe Verhaltensweisen, die durch Mutationen, die die Bmp, PDGF, Shh und Signalwege zu stören betroffen sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zeitraffer-konfokale Mikroskopie ist ein mächtiges Werkzeug für die Analyse der Entwicklung. Hier zeigen wir, Nützlichkeit der Methode bei der Untersuchung Pharyngealbogen Morphogenese in Zebrafisch-Mutante, die für wichtige Signalwege, die mit einem transgenen Neuralleistenzellen Etiketten sind. Neben Gewebe-Ebene analysiert, Zeitraffer Analysen sind auch auf zellulärer Ebene zu einem 28-Analysen. Viele verbreitete Zebrafisch Verfahren können auch in Zeitraffer-Mikroskopie Experimente, einschließlich …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Melissa Griffin und Jenna Rozacky für ihre Fisch-Experte Pflege. PDM Dank für EGN schriftlich Unterstützung, Großzügigkeit und Geduld. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCR R01DE020884 zu JKE unterstützt.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Riferimenti
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