4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석
Summary
시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.
Abstract
시간 경과 영상은 형태 형성의 과정을 직접 관찰 할 수있는 기술, 또는 모양의 세대입니다. 때문에 광학적 선명도와 유전자 조작에 복종 할 의무에, 제브라 피쉬 배아는 살아있는 배아에서 형태 형성의 시간 경과 분석을 수행 할 수있는 인기 모델 생물이되고있다. 라이브 제브라 피쉬 배아의 공 촛점 이미징은 그 조직이 지속적으로 같은 유전자 또는 주입 염료로, 형광 마커로 표시되어 있어야합니다. 프로세스는 배아 마취 건강한 발달이 정상적으로 진행되는 방식으로 제 위치에 유지되는 것을 요구한다. 이미징을위한 매개 변수에는 다음과 같은 세 가지 차원의 성장을 고려하여 개발의 빠른 스냅 샷을 가져 오는 동안 개별 셀 해결의 요구에 균형을 설정해야합니다. 우리의 결과는 형광 표지 된 제브라 피쉬 배아의 생체 촬상있는 장기를 수행하고있는 다양한 조직 행동을 검출하는 능력을 입증두개 안면 기형을 일으키는 원인이되는 뇌 신경 능선. 마취 및 장착으로 인한 개발 지연을 최소화하고, 배아는 프로세스에 의해 무사히입니다. 시간 경과 이미징 배아는 개발 이후 지점에서 액체 배지로 돌아 왔고, 이후 몇 군데 또는 고정 할 수 있습니다. 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 잘 특성화 운명 매핑 및 이식 기술, 영상의 증가 풍부한 원하는 조직이 가능합니다. 따라서, 생체 내 이미징의 시간 경과가 돌연변이 및 미세 주입 배아의 분석을 포함하여 제브라 피쉬의 유전 적 방법으로 강력하게 결합한다.
Introduction
두개 안면 형태 형성은 여러 세포 유형 간의 상호 협조를 필요로 복잡한 다단계 과정이다. 두개 안면 골격의 대부분은 신경 능선 세포에서 파생되는 많은 인두 아치 1이라는 일시적인 구조로 지느러미 신경 튜브에서 마이그레이션해야합니다. 많은 조직과 같이, 두개 안면 골격 형태 형성의 발달은 특정 시점에서 배아의 정적 이미지에 의해 이해 될 수있는 것보다 더 복잡하다. 그것은 시간이 많이 걸리는 수행 할 수 있지만, 생체 시간 경과 현미경은 배아의 세포와 조직에서 연속보기를 제공합니다. 시간 경과 시리즈의 각 이미지는 다른 사람에게 컨텍스트를 준다, 그리고 현상이 발생하는 이유를 추론보다는 그 시간에 발생하는 것을 추론을 향한 구도자 이동하는 데 도움이됩니다.
생체 내 이미징에 따라서에 실험적인 접근을위한 강력한 설명 도구입니다형태 형성을 안내 경로를 해체. 제브라 다니오의 rerio는 척추 동물의 배아 발달의 인기 유전 모델이며, 특히 형태 형성의 생체 내 이미징에 적합합니다. 현대, 형질 전환 게놈 수정을위한 편리한 방법은 빠르게 제브라 피쉬 연구원에 사용할 수있는 도구의 수를 진행하고 있습니다. 이 도구는 유전자 조작과 현미경 이미 강력한 방법을 향상시킬 수 있습니다. 거의 모든 원하는 유전 적 맥락에서 거의 모든 조직의 생체 내 이미징은 환상보다 현실에 더 가깝다.
인두 아치의 형태 형성 운동은 신경 능선과 인접한 상피, 외배엽 모두 내배엽 사이의 상호 작용을 신호에 의해 유도된다. 두개 안면 골격 요소의 형태 형성을 구동하는 데 필요한 상피 세포에 의해 표현 된 다양한 신호 분자가있다. 이러한 신호 분자 중, 소닉 더 헤지 호그 (쉬) 매우 중요 F입니다또는 두개 안면 개발 2-8. 쉿은 구강 외배엽 및 인두 내배엽 2,6,9,10 모두에 의해 표현된다. 내배엽에서 쉬의 표정은 아치 (10), 아치 (10) 내의 신경 문장의 패턴, 그리고 두개 안면 골격 (11)의 성장의 형태 형성의 움직임을 조절한다.
BMP 신호는 두개 안면 개발 (12)에 대한 매우 중요합니다 및 인두 아치의 형태 형성을 변경할 수 있습니다. BMP 신호는 인두 아치 13, 14 내 문장의 지느러미 / 복부 패턴을 조절한다. 제브라 피쉬의 smad5의 중단은 심각한 구개 결함과 중간 선 (15)에 적절하게 융합하는 메켈의 연골의 오류가 발생합니다. 또한 돌연변이는 또한 2 차, 3 차 및 중앙선에 15 융합 때때로 제 4 인두 아치 요소 복측 연골 성분의 감소 및 융합을 표시. 이러한 융합은 강력하게 된 BMP 신호 전달이 인두 요소의 형태 형성을 지시하는 것이 좋습니다.
PDGF 신호는 두개 안면 발전을 위해 필요하지만, 인두 아치 형태 형성에 알 수없는 역할을 가지고 있습니다. 마우스와 제브라 피쉬 PDGFRA 돌연변이는 모두 깊은 midfacial clefting 16-18있다. 적어도 제브라 피쉬이 midfacial clefting 적절한 신경 능선 세포의 이동 (16)의 실패에 기인한다. 신경 능선 세포들은 인두 아치를 입력 한 후 PDGFRA을 표현하기 위해 계속합니다. 또한, PDGF 리간드는 얼굴 상피 세포에 의해 표현되고, 인두 아치 16,19,20에서, 따라서 PDGF 신호는 마이그레이션 다음 인두 아치의 형태 형성에 중요한 역할을 할 수있다. 그러나, PDGFRA 돌연변이의 인두 아치 수행되지 않은의 형태 형성의 분석.
여기, 우리는 pharyngul의 생체 공 초점 현미경에 보여단 형질 전환 제브라 피쉬와이 기간 내에 인두 아치의 형태 형성을 설명합니다. 우리는 더 BMP, PDGF, 그리고 쉬의 신호 전달 경로를 방해 돌연변이에 의해 영향을받는 조직의 행동을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시간 경과 공 초점 현미경 개발의 분석을위한 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 신경 능선 세포 레이블 유전자 변형을 사용하여 중요한 신호 전달 경로에 대한 돌연변이 있습니다 제브라 피쉬에서 인두 아치 형태 형성을 연구하는 방법의 유용성을 보여줍니다. 조직 수준뿐만 아니라 시간 경과 분석도 휴대 규모 28에서 분석에 적용, 분석한다. 대부분의 널리 사용되는 제브라 피쉬의 방법?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 전문적인 물고기 케어 멜리사 그리핀과 제나 Rozacky 감사합니다. PDM 감사 EGN 지원, 관용과 인내를 작성. 이 작품은 JKE에 NIH / NIDCR R01DE020884에 의해 지원되었다.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Riferimenti
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