Abstract
라이신 메틸화는 신흥 포스트 번역 수정하고이 세포 개발 및 많은 질병에서 중요한 역할을 담당 곳에는 여러 히스톤과 비 히스톤 단백질에 발견되었습니다. 약 5,000 라이신 메틸화 단백질 라이신 methyltransferases의 몇 수십 설정되어 다른 단백질에 확인되었다. 이제이 하나 또는 두 개의 기판이 효소의 여러 가지에 대해 확인 된 그러나까지, 각 PKMT 여러 단백질의 메틸하는 것이 좋습니다. 이 문제에 접근하기 위해, 우리가 도입 펩타이드 어레이 기반의 기질 특이성은 PKMTs 분석. 펩타이드 배열은 서로 다른 시퀀스가 여러 기판의 메틸화가 하나의 어레이 테스트 할 수 있기 때문에 PKMTs의 특이성을 특성화 할 수있는 강력한 도구입니다. 우리는 Intavis SPOT 신디사이저를 사용하여 셀룰로오스 막에 펩타이드 배열을 합성 및 다양한 PKMTs의 특이성을 분석 하였다. 이들 효소의 여러 위해, 결과에 기초하여, 신규 Substrates를 식별 할 수 있습니다. 예를 들어, 펩타이드 어레이를 사용함으로써 NSD1 위해, 우리는 H4의 K44 대신보고를 H4K20의 메틸과 더불어 H1.5K168은 이미 공지 H3K36 위에 매우 바람직한 기판 인 것으로 나타났다. 따라서, 펩타이드 배열은 생화학 PKMTs의 특성을 할 수있는 강력한 도구입니다.
Introduction
지난 20 년 동안, 여러 보고서는 세포 개발 및 암 등 여러 질병,하지만 최근에 단백질 리신 메틸화는 또 다른 중요한 PTM로 떠오르고있다에서 번역 후 변형 (PTM)의 중요성을 보여 주었다. 초기 히스톤 메틸화 라이신 필수적인 염색질 마크 것으로 확인되었지만, 이후의 작업은 여러 비 - 히스톤 단백질 1-4 리신 메틸화 하였다. 리신 잔기의 ε - 아미노기에 S-L 아데노 실 메티오닌의 메틸 기의 순차적 인 전송은 인간 게놈에서 60 개 이상의 단백질을 포함 리신 단백질 Methyltransferases (PKMTs)라는 효소 패밀리에 의하여 촉매된다. PKMTs 처음 특정 라이신 잔기 메틸화 나중에보고들은 또한 비 - 히스톤 단백질 5 메틸화 수 있다고 입증 히스톤 변형 효소로 발견되었다. 지금까지 약 5,000 라이신 메틸화 다른 단백질 6에 확인 된
펩타이드 어레이 널리 항체, 펩티드 변형 효소 단백질 - 단백질 상호 작용 부위 (항체 - 항원, 수용체 - 리간드) 7-9의 맵핑의 생화학 적 분석을위한 도구를 사용한다. 펩타이드 수백는 SUC에 필요한시간 응용 프로그램. 다른 방법들이 매우 일반적으로 사용되는 수지를 합성 펩타이드 중, 펩티드 합성에 사용할 수 있지만, 스루풋에 한계를 가지고 있으며, 이것은 상대적으로 고가이다. 이러한 문제는 프랭크와 동료 (10)에 의해 SPOT 합성 방법의 도입으로 해결이되었습니다. SPOT 합성법 병렬 수백 펩티드의 합성이 가능하며 평균 그것은 합성 수지에 비해 저렴하다. 셀룰로오스 막에 합성 된 펩타이드는 막에서 절단 및 솔루션 분석에서 무료 펩타이드로 사용 또는 펩티드 마이크로 어레이 10-13을 준비 할 수있는 다양한 응용 프로그램 또는 펩티드 직접 사용할 수 있습니다.
SPOT 합성은 고체 지지체로서 셀룰로오스 멤브레인을 사용하며, 표준의 Fmoc- 화학을 채용 10-13 고상 펩티드 합성의 변형이다. 따라서, 펩타이드의 합성은 C 말단에서 시작 향해 진행리보솜에서 합성 생물학적 대조적 N 말단. 셀룰로오스 막은 먼저 활성화 아미노산 (도. 1)의 부착을 위해 관능 화된다. SPOT 방법은 자동 피펫 팅 장치를 이용하여 막에 정의 명소 용매 액적 활성 아미노산의 순차 전달에 기초한다. 액체의 방울은 나중에 펩타이드 합성 화학 반응을위한 오픈 반응기 역할을하는 원형 젖은 자리를 형성하는 다공성 막에 분배된다. 스폿 사이즈가 분배 용적과 멤브레인의 흡수력에 의해 결정되고, 예컨대 스폿의 배수로는 어레이로 배열된다. 합성 스케일 스폿 사이즈와 막의 적재량과 상관을 갖게 할 수있다. 스폿 및 배열 밀도 사이의 거리는 스팟의 크기를 변경함으로써 관리된다. 셀룰로오스 멤브레인 펩티드 합성 고상 같은 여러 가지 장점을 가지고, 그것은 Chemic의 행 저렴 관대수용액에서 안정하고 취급이 용이 한 펩타이드 합성에 사용 ALS. 또한, 친수성 성질은 여러 생물학적 분석 시스템들에도 적합하다. SPOT 합성은 수동으로 수행하거나 필요한 펩티드의 수에 따라 (펩티드에 대한 1000) 자동화 될 수있다. Intavis (쾰른, 독일)에서 완전 자동화 SPOT 합성기는 우리의 응용 프로그램에 사용됩니다. 그것은 다른 양의 서로 다른 길이의 펩티드의 합성을 허용합니다. 또한 단계적 합성 (14,15)에 의해 제조 될 수있는 선형 펩티드는 규칙적 42 아미노산 펩타이드의 첨가에, 15 ~ 20 개의 아미노산 길이로 합성된다. 그러나, 아미노산의 수를 증가시키는 것은 펩티드의 품질에 영향을 전체 결합 수율의 감소를 이끈다. 이 때문에 스폿 당 펩티드의 낮은 양 때문에, 제품은 종종 정제하기 어려운 개별 펩티드의 품질을 용이하게 평가할 수 없다. 따라서 결과의 SPOT pept로부터 얻어진IDE 어레이 정제 펩티드 합성 또는 원하는 펩티드 서열을 함유하는 단백질을 합성 기준에 따라 분석 될 수있는보다 큰 규모의 표준 방법에 의해 합성 된 펩타이드 중 하나를 확인해야한다. 아직도, 우리는 매우 신뢰할 수 SPOT 합성을 발견하고 재현 할 수 일반적으로 발생합니다. SPOT 합성은 펩티드 전과 또한 최종 측쇄 보호 그룹의 절단하고, 이후에 변형 될 수 있도록, 아미노산, 또한 합성에 사용할 수있는 몇 가지 시판 변성 아미노산 proteinogenic에만 제한되지 않으며 또한 혼입 허용 인산화 메틸화 또는 아세틸 아미노산 (11).
SPOT의 고정화 방법으로 합성 펩티드 라이브러리는 직접 많은 생물학적 및 생화학 적 분석에 사용될 수있다. 우리 PKMTs의 기질 특이성을 조사하기 위해 300-400 펩타이드를 포함하는 펩티드 배열을 채용. 효소 후 변형의 경우양이온, 펩티드 배열은 각 PKMT 함께 인큐베이션하고 적절한 완충액 [메틸 3 H] -AdoMet 표지. 각 기판의 메틸화는 오토 라디오 그래피를 통해 펩티드 기질에 AdoMet에서 방사성 표지 된 메틸기의 전사 효소 (도이. 3)에 따라 분석한다. 이 절차에 의해, 펩티드 배열은 동시에 두 펩티드 기질의 메틸화 연구를 허용한다. 이 방법의 한가지 중요한 이점은 모든 펩티드 메틸화 반응 속도의 선형 단계에서, 각각의 펩티드의 상대적인 메틸화가 해리 상수 (K 고양이 / K로 나눈 촉매 속도 상수에 비례 같은 것을, 대회에서 메틸화된다는 것이다 각 펩티드 기질에 대한 효소의 D). 따라서, 각각의 스폿에 혼입 된 방사능의 양을 직접 향해 특정 펩티드의 효소 활성과 관련된다. 사용펩타이드 어레이 메틸화 실험의 결과는, PKMT의 특이성 프로파일은 예견 할 수있는이 새로운 기판에 정의하고 기초 할 수있다. 펩타이드 어레이 펩타이드 수준에서 신규 기판의 메틸화 신속하고 비용 효율적 검증을 허용한다. 이를 위해, 어레이는 표적 부위에서의 라이신 대신 아라 펩타이드를 함유하는 개질뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군 펩티드와 함께 예측 된 신규 한 기판을 포함하는 것이 제조된다. 마지막으로, 신규 한 기판은 돌연변이 체와 함께 단백질되는 대상의 Ala가 라이신으로 변경되고, 메틸화 단백질 레벨에서 확인할 수있는 바와 같이 제조 될 수있다. 결과에 따라,이 후, 새롭게 기재된 단백질 기질의 메틸화의 잠재적 역할을 어드레싱 생물학적 연구에 의해 이어진다.
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Protocol
펩타이드 배열 1. 준비
- 펩타이드 시퀀스의 프로그래밍
- MultiPep 정찰기 소프트웨어를 사용하여 합성 펩티드 서열을 디자인. 단일 문자 코드의 펩티드 서열을 입력합니다.
펩타이드 1 : TARKSTGGKA - 정의 된 기판의 인식에 필요한 중요한 아미노산을 화면에 특정 명령 (.replace, A)와 알라닌 또는 아르기닌 도보 라이브러리를 생성합니다. 다음 예에서 예를 들어 첫 번째 라인은 야생형 서열이고 두번째 행에서 각 펩타이드의 아미노산이 알라닌으로 순차적으로 변경된다.
, 교체
TARKSTG
-ARKSTG
T- -RKSTG
맞대기 -KSTG
하는 표적 -STG
TARK- -TG
TARKS- -G
TARKST- - 유사한 명령 (.replace의 R을 사용합니다.모든 천연 가능한 아미노산 잔기 (결국 시스테인, 메티오닌 및 트립토판을 생략 1.1.2에 기재된 바와 같이 이들 잔기 산화하는 경향이 때로는 낮은 합성 수율 때문에), N 등)를 교체 합의 판정 펩타이드 어레이를 합성 효소에 대한 기질 서열 모티브.
참고 :도 4a에 도시 된 바와 같이, 횡축은 소정의 단백질 서열을 나타내고, 세로축은 명령 선택된 아미노산을 나타낸다. 1.1.2에 도시 된 순서와 유사하게, 종축은 아라 순차적도 첫번째 행에 지정된 시퀀스의 각 위치를 대체한다는 것을 의미한다. 4A. 마찬가지로 순차적 아르기닌 등의 아미노산과 다른 상기 제 2 행에서 각 아미노산을 대체한다. 전체 어레이 펩티드 라이브러리는 체계적 번째의 각각 구비 펩티드 기질 서열 각 잔기를 대체함으로써 합성다른 예를 자연스럽게 사용할 아미노산 잔기, 이것은 주어진 시퀀스의 각 위치에서 각각의 잔기의 영향을 이해하는데 도움이 될 것이다. - 다르게는, 공지 또는 예측 된 펩티드 기질의 메틸화 용이 양성 및 음성 메틸화 컨트롤과 함께 PKMT의 표적 펩타이드 (메틸화에 공지되거나 메틸화이어야 공지 즉 펩티드) 펩티드 라이브러리를 합성 검증 될 수있다. 수동 프로그래밍에 의해 다음과 같이 대상 라이신의 메틸화를 확인하는 알라닌 추정 대상 라이신을 교환하여 펩타이드를 합성.
야생 형 펩타이드 : STGG K PRQFL
돌연변이 펩타이드 : STGG PRQFL
참고 :이 소프트웨어는 또한 상호 작용에 필요한 중요한 아미노산을지도 할 수있는 시퀀스의 원하는 프레임 시프트와 에피토프 매핑 같은 다양한 라이브러리를 만들 수있는 고유의 스크립트를 가지고있다.
- MultiPep 정찰기 소프트웨어를 사용하여 합성 펩티드 서열을 디자인. 단일 문자 코드의 펩티드 서열을 입력합니다.
- 멤브레인의 제조, 아미노산D 시약
- 10 분 동안 DMF (N, N 디메틸 포름 아미드)의 SPOT 막 사전 팽창 한 후 기포 또는 주름없이 SPOT 합성 프레임에 젖은 막 배치합니다.
- 막 100 % 에탄올로 3 회 세척 할 것. 합성 프로그램을 시작하기 전에 적어도 10 분 동안 완전히 막을 건조.
- 이와 병행하여, 갓 NMP에 용해시킴으로써 이들을 시판의 Fmoc- 보호 된 아미노산의 농도는 0.5 M 작업을 준비하고, 표 1에 설명 된대로 활성제와 같은 염기를 준비한다.
- SPOT 신디사이저의 모든 폐액 용기가 비워하고 있는지 확인하고, DMF, 에탄올, 피 페리 딘과 용매 저수지 리필.
참고 : 이제 기계는 합성을위한 준비가되어 있습니다.
- 첫 번째 아미노산의이 보인다
- 광고가 들어오는 아미노산 카르복시기를 활성화 멤브레인 자유 아미노기와 아미드 결합을 생성하려면딩 활성제 (N, N '이소 프로필 카보 다이이 미드) 및 아미노산 유도체에 염기 용액 (하이드 록시 에틸 시아 노 아세테이트).
- 프로그램 가능한 로봇을 이용한 PEG 아미노 관능 막 활성화 아미노산 원하는 볼륨 스팟.
주 : 이에 따라, 아미노산의 C 말단이 멤브레인의 아미노기에 결합된다. - 먼저 활성화 아미노산의 더 나은 커플 링을 보장하기 위해이 단계를 세 번 반복합니다. 비결 아미노산을 제거하는 DMF로 세척 한 다음 20 분 동안 막을 부화.
- 비 자리 분야에 무료 공간의 차단
주 : 막의 아미노기 모든 펩티드의 제 C 말단 아미노산의 커플 링 후 기미와 같은 스폿 영역 내에 아미노기의 일부 사이의 아미노기는 아미노산과 결합을 형성하지 않는다.- 캐 용액으로 배양하여 이러한 자유 아미노기를 차단 (DMF 중 20 % 아세트산 무수물)5 분.
주 :이 막 대신 성장 펩티드 사슬과 상기 사이클로 아미노산의 커플 링을 방지한다.
- 캐 용액으로 배양하여 이러한 자유 아미노기를 차단 (DMF 중 20 % 아세트산 무수물)5 분.
- Fmoc 등 그룹의 제거
- 블로킹 후, DMF로 4 회 세척 막을 다음의 Fmoc- 보호 그룹을 제거하기 위해 20 분 동안 DMF 20 % 피 페리 딘과 함께 배양한다.
참고 :이 단계는 아미노 보호 Fmoc 등 그룹의 제거에 이르게 그것은 탈 보호라고합니다. - 그 후, 에탄올로 두 번 DMF와 두 번 막 세척하고 건조 할 수 있습니다.
참고 : 이제 막 다음 아미노산의 결합에 대한 준비가되어 있습니다.
- 블로킹 후, DMF로 4 회 세척 막을 다음의 Fmoc- 보호 그룹을 제거하기 위해 20 분 동안 DMF 20 % 피 페리 딘과 함께 배양한다.
- 체인 신장
주 : 각 아미노산의 첨가주기라고한다. 이 외에 제 아미노산의 결합에서, 사이클은 결합 아미노산 및 Fmoc 기의 탈 보호와 함께 시작되고 그것은 증가 PEP의 아미노기 들어오는 아미노산의 활성화 된 카르복실기의 결합에 의해 이어진다조수 체인.- 원하는 펩타이드 길이를 얻을 때까지 반복 1.3 및 1.5 단계를 반복합니다.
- 염색
참고 : 최종주기 후, 펩타이드 배열이 펩타이드의 합성에 성공을 확인하는 브로 모 페놀 블루로 염색된다. 브로 모 페놀 블루는 펩티드의 자유 아미노기와 결합한다. 펩타이드 반점은 염색 후 밝은 파란색 색상을 표시하지만, 반점의 강도는 펩타이드 서열에 따라 달라집니다. 이 얼룩은 펩티드를 얼룩하지 않기 때문에 피 페리 딘 브로 모 페놀 블루의 존재, 피 페리 딘의 완전한 제거의 확인을 할 수 있습니다. 또한, 이것은 또한 나중에 사용할 펩티드 배열을 표시 돕는다.- 마지막 합성 사이클 기의 Fmoc- 탈 보호 한 후, DMF, 100 % 에탄올로 막 세척 하였다. 완전히 청색으로 변할 때까지 그 다음, 5 분 이상 동안 브로 모 페놀 블루 (DMF 0.02 % 브로 모 페놀 블루)과 멤브레인을 치료.
- 이후, DMF 및 ETH으로 막을 세척anol 10 분 동안 건조 하였다. 이제 신디사이저에서 막 꺼내 수동 사이드 체인 탈 보호 (1.8 절)을 수행합니다. 필요한 경우, 펩티드 합성 (도. 2)의 결과를 문서화하기 막을 사진.
- 사이드 체인 탈 보호
- 측쇄 보호 그룹 및 소제 시약 (2.5 %의 물과 2.5 % 트리 이소 프로필 실란)에서 아미노산의 측쇄를 보호를 절단하기 위해 95 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)로 이루어지는 측쇄 탈 보호 혼합물의 20 ~ 25 ml로 멤브레인 치료 이 단계에서 수정. 완전히 밀폐 된 화학 물질 상자에서 막 다루고 있는지, 부드럽게 흔들어 섞으면 서 1 ~ 2 시간 동안 그것을 부화 탈 보호 혼합물의 충분한 볼륨을 가져 가라.
- 2 분마다 DCM (디클로로 메탄)의 20 ~ 25 mL로 막 여섯 번 씻고 마지막으로 두 번 100 % 에탄올로 밤새 데시 케이 터 (실리카겔).
참고 : 지금멤브레인은 실험에 사용될 수있다. 펩티드 합성의 배열 방식은도 1에 제공된다.
2. 단백질 발현 및 정제
- GST의 용해 등 PKMTs의 단백질 발현
- 표준 기술을 사용하여, GST 융합 단백질로서 표현 된 전체 길이 또는 PKMT (유전자 pGEX-6P2 등) 세균성 발현 벡터에의 촉매 도메인을 코딩하는 유전자를 복제.
- BL21 또는 BL21 코돈 플러스 E.에 삽입 원하는 PKMT와 벡터로 이동 열 충격 방법 또는 다른 방법에 의해 대장균 세포.
- 식 당일 루리아 - 베르 타니 (LB) 미디어 30㎖를 함께 예비 배양을 준비하고 연속 진탕 7-8 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 다음에, LB 미디어 L 함유 한 2 L 플라스크에 큰 배플 예비 배양 10 ㎖ 옮기고 37 ℃에서 부화 문화 도달 할 때까지 연속 진탕 배양기에서 ° C600 nm에서 광학 밀도 정의 ES.
주 : 이것은 각각의 단백질에 대해 최적화 될 수 있지만, 우리는 일상적으로 약 0.8의 OD를 600 ㎚에서 유도한다. 유도 온도가 개별적으로 각각의 단백질에 대해 최적화 될 수 있고, 어떤 단백질은 식 (22)에서 잘 보여 ° C 이상 온도에서 몇 가지. - 다음 이소 프로필 - 베타 - D-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 1 mm의 유도, 15 분 동안 온도를 유도하고 세포 시프트가 유도 배양 온도에서 10-12 시간 동안 성장하는 것을 허용한다.
- 이후 15 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확하고 마지막으로 추가의 사용을 위해 -20 ℃에서 STE 완충액 (10 mM 트리스 pH가 8.0, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA) 및 저장소 30 ml로 펠렛을 세척 하였다.
- 단백질 정제
- 세포 펠렛을 해동하고 초음파 처리 완충액 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤)의 30 ㎖에 재현 탁하고 초음파 처리에 의해 붕괴.
참고 :이 버퍼 Needs 결국 각각의 단백질을 최적화 할 수 있습니다. - 1 시간 동안 22,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리, 나중에 상등액을 수집하여 글루타티온 세파 로즈 4B 수지의 600 μl를 함유하는 컬럼을 통해 통과한다.
- 50 초음파 버퍼 ㎖의 높은 소금 버퍼 (7.5 50 mM 트리스 산도, 500 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT 5 % 글리세롤) 비특이적 결합 단백질을 제거하는 100 ㎖와 다음에 열을 씻으십시오. 40 mM의 글루타치온을 함유하는 높은 염 완충액 5 ml로 결합 단백질을 용출시켰다.
- 낮은 글리세롤 (20 mM 트리스의 pH 7.4, 100 mM의 KCl을, 0.5 mM의 DTT, 10 % 글리세롤)의 pH 7.4을 2 시간 이상하는 20 mM 트리스, 100 mM의 KCl을, 0.5 mm의 투석 버퍼의 2 L에 용출 된 단백질을 투석 DTT 70 % 글리세롤 8 시간 또는 하룻밤. 모든 정화 버퍼가 4 ° C에 있는지 확인하고 단백질 변성을 방지하기 위해 추운 방에서 단백질 정제를 수행합니다.
- 세포 펠렛을 해동하고 초음파 처리 완충액 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤)의 30 ㎖에 재현 탁하고 초음파 처리에 의해 붕괴.
3. 펩타이드 배열 메틸화
- 사전 incu펩타이드 배열의 bation
- 효소와 고가의 방사능 표지 AdoMet의 낭비를 방지하기 위해 적절한 크기의 상자 또는 비닐 봉투에 하나 펩타이드 배열 메틸화를 수행합니다. 10 분 동안 효소없이 각각의 메틸화 버퍼를 포함하는 밀봉 된 비닐 봉지에 펩티드 배열 멤브레인과 표지 [메틸 3H] -AdoMet 사전 품어. 예 전체 특이성 프로파일 펩타이드 어레이 메틸화 완충액 8ml의 사용을위한 버퍼의 부피는, 어레이의 크기에 의존한다. 각 효소의 양 및 AdoMet의 농도를 최적화 할 수 있습니다.
- 펩타이드 배열의 메틸화
- 사전 배양 버퍼를 취소하고 각각의 PKMT를 포함 메틸화 버퍼의 8 ml의에서 막 부화 및 표시 [메틸 3H] -AdoMet 1 시간 2를위한.
주 : 메틸화 반응에 필요한 효소의 양이 특정 PKMT의 활성에 의존 우리 스크리닝 실험은 50 nM의 효소 지느러미 개시 전형적Al 농도.
- 사전 배양 버퍼를 취소하고 각각의 PKMT를 포함 메틸화 버퍼의 8 ml의에서 막 부화 및 표시 [메틸 3H] -AdoMet 1 시간 2를위한.
- 펩타이드 배열의 세척
- 이후 방사성 폐기물 컨테이너 메틸화 버퍼를 폐기하고 결합 된 단백질을 제거하기 위해 5 분 동안 100 mM의 중탄산 암모늄 및 1 % SDS를 함유하는 완충액 20 ml로 5 회 펩타이드 어레이를 세척 하였다. 방사성 폐기물 용기의 세척 버퍼를 폐기하십시오.
- 방사성 신호의 검출
- 세척 후 증폭 용액 (NAMP100V) 10ml에 5 분 동안 막을 배양한다.
- 그런 다음, 유기 용매에 대한 방사성 폐기물 용기로 증폭 솔루션을 폐기 플라스틱 가방에 펩타이드 배열을 봉인하고 오토 라디오 카세트에 넣어.
- 어두운 방에 펩타이드 배열의자가 방사선 필름을 놓습니다. 신중하게 카세트를 닫고에 노출 -80 필요한 시간 C를 °. 그 다음, 결과를 분석하기 위해 필름을 개발한다. 다른 expositio와 시대의 이미지 몇 캡처n 번 강력하게 메틸화 펩타이드 기질의 포화를 방지 할 수 있습니다.
4. 데이터 처리 및 분석
- 스팟 강렬의 농도계 분석
- 기존의 스캐너에 필름을 스캔 농도계에 의해 현물 강도를 분석 할 수 있습니다. (프리웨어)이 사용 ImageJ에 또는 상용 프로그램을 수행합니다.
참고 : 우리는이 작업을 위해 Phoretix 소프트웨어를 사용합니다.
- 기존의 스캐너에 필름을 스캔 농도계에 의해 현물 강도를 분석 할 수 있습니다. (프리웨어)이 사용 ImageJ에 또는 상용 프로그램을 수행합니다.
- 정규화 및 다른 점막의 결과의 평균화
- 중으로 적어도 펩타이드 어레이 메틸화 실험을. 1.0과 같은 기준 기판에 배경 차감 및 활성을 설정하여 각 실험에 대한 강도를 정규화 스캔. 각 지점의 데이터를 평균 그들에게로 평균값과 표준 편차를보고합니다.
- 데이터 분석 및 디스플레이
- 상대 활성을 나타내도록 그레이 스케일 또는 컬러 방식을 사용하여 2 차원의 데이터를 플롯. 이 위스콘신 수행일 Excel 또는 Sigmaplot은 다음과 같이. 또한, 데이터의 품질을 분석하는 실험을 반복의 표준 편차의 분포의 플롯을 준비한다.
- 정량적 비교 기질 펩티드에서 각 잔기의 인식의 정확도를 표시하려면, 판정 계수 D (16, 17)에 의해 위치 (x)에서의 각 아미노산에 대한 I PKMT의 상대적인 우선 순위를 계산한다 :
D의 X, I = <V의 J ≠ 전> / V I - 1
V (I)이 위치 (x)와 AT 아미노산 I 운반 펩타이드 변이체의 메틸화 비율 임 <브이 j는 ≠ 난> 포함한 위치 x에서 다른 아미노산 J ≠ I 들고 19 개의 펩티드의 메틸화의 평균 속도 (인 야생형 서열).
참고 :이에 의해 정의 된 차별 요소는 배경 수준에 따라 달라집니다. 하나만 잔류 3 %의 배경, 차별 특정 위치에서 승인되면32.3의 인자를 얻을 수있다. 위치에서 어떤 환경 설정은 0의 차별 요인을 초래하지 않습니다.
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Representative Results
이 방법에 의해 펩티드 5,16-19 어레이 성공적 생화학 PKMTs의 특이성을 특성화하는 데 사용하고, PKMT 여러 신규 한 히스톤 및 비 히스톤 기질의 동정을 행 하였다. PKMT (또는 효소)의 올바른 기판 스펙트럼을 정의하는 분자 메커니즘과 세포 기능의 이해를 향한 중요한 단계입니다.
펩티드 SPOT 어레이 메틸화 방법의 적용 예로서, 우리는 (19)의 NSD1 PKMT 특이성 분석 결과를 설명한다. 우리의 작업에 이전,이 효소는 K36에서 히스톤 H3와 히스톤 H4 K20에서뿐만 아니라 K218과 K221.도에서 NF-kB의 가족 전사 인자 P65 포함 메틸 레이트 여러 기판에 설명했다. 도 4a와 NSD1 펩타이드 어레이의 메틸화 반응의 예를 도시한다. 이 실험 H3에 기초하여 큰 펩티드 배열 (31-49) 서열은 그 모든 가능한 합성 하였다 포함원래 시퀀스의 단일 아미노산 변화는 상호 작용 및 NSD1 메틸화 각 아미노산의 중요성을 테스트한다. 총 380 펩티드 합성 하였다 (20 가능한 아미노산 잔기 (18) 플러스 각 행의 하나의 원래 H3 서열을 X). 횡축은 펩티드 서열을 나타내고, 수직 방향에 상당하는 펩티드에서 변경되는 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, 행 17 열 4의 자리는 야생형 순서 (그림. 4A)에 존재하는 대신 글리신의 세 번째 위치에 트레오닌이 포함되어 있습니다. 이러한 방식으로, 점 돌연변이 펩타이드 기질에서의 각 위치에서 각각의 고유의 아미노산에 대한 NSD1의 기호를 테스트하기 위해 생성된다. NSD1과 메틸화는 특별히 H3K36에 작용하고 34-38 타겟 리신의 양측에 선호도를 갖는 것으로 나타났다.
도 4b는 세 펩타이드 어레이 메틸화 통합을 나타낸다NSD1 실험. 정량적 인 정보는 개개의 펩타이드 어레이로부터 취득하고, 결과는 표준화되었고 전술 한 바와 같이 평균화. 개개의 평균 표준 편차는 데이터가 높은 재현성 것을 보여준다. 전체 펩타이드의 약 85 %는 20 %보다 작고 펩티드 기질의 97 % 이상이 표준 편차 (도. 4C) 표준 편차를 30 % 이하로 작게 보여 나타낸다. 또한, 우리는 또한 정밀 검사 위치에서 각 아미노산의 기여를 결정하는 식별 인자를 계산. 그것이 제공하는 바와 같이, 펩타이드의 정량 설명 독출 특정 위치 (도. 5A)에서 아미노산의 선호도. 우리의 데이터는 NSD1가 (F> Y> G) (위치 0으로 K36을 고려) -2 위치에서 방향족 잔류 물을 좋아 보여; 소수성 잔기 -1 (I> L> V); 이 소수성 또는 방향족 잔기를 용인 할 수 없다 +1 (R> QKNM)에서 기본 잔류; 및 유압+2에서 rophobic 잔류 물 (V> IA> P). 다른 사이트에 (같은 -3, +3, 또는 +6), NSD1 몇 가지 아미노산을 선호하지만 강한 잔류 특정 판독은 검출되지 않았다.
이 프로파일에 기초하여, 잠재적 인 신규 펩티드 Scansite 기판 (20) (도. 5B)를 사용하여 같은 데이터베이스 검색에 의해 발견 될 수있다. 이 펩티드는 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함하여 SPOT 배열에 준비 NSD1 배양 및 방사능 펩타이드 수준 (그림. 5C)에서 메틸화되어 그 중 일부를 식별 할 수 AdoMet을 표시했다. 속행 같이, 펩티드 배열은 메틸화 예측 위치에서 발생을 확인하기 위하여 타겟 리신이 알라닌으로 치환 된 변이체 펩티드를 포함하는 제조 할 수있다. 그리고, 표적 단백질 또는 표적 리신을 함유하는 그 중 하위 재조합 제조 할 수 있고, 또한 메틸화 단백질 수준에서 시험 하였다. 마지막으로, 결과에 따라, 내가 실험을 할 수 추적 메틸화는 생물학적하는 역할이이 세포에서 발생하는 경우 nvestigate.
그림 1 :. 셀룰로오스 막에 SPOT 방식에 의한 펩타이드 합성의 계획 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 펩타이드의 합성을 확인 브로 모 페놀 블루로 염색 펩타이드 배열의 예 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 펩타이드 배열 메틸화 실험의 계획; 펩타이드 배열은 PKMT와 함께 배양 메틸화 적절한 버퍼에 [메틸 3 H] -AdoMet 표시했다. 그 후 각 지점에 전송 방사능이자가 방사선에 의해 검출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
.도 4 : NSD1 PKMT A) H3 주형으로서 (31-49) 시퀀스를 사용 NSD1 대한 기질 특이성 펩타이드 어레이의 예와 결과를 수득 하였다. 횡축은 H3 서열을 나타내고, 세로축은 대응하는 행이 돌연변이되는 아미노산을 나타낸다. 첫 번째 행과 펩티드를 포함원래 시퀀스. B) NSD1 3 독립 펩타이드 어레이 메틸화 실험 결과의 통합은, 데이터 Kudithipudi 외로부터 재생 패널 B.에 도시 평균 메틸화 데이터에 대한 표준 오차의 정규화. C) 분배 후 세 실험의 결과를 평균화 알. (2014) 일부 수정 (19)와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 :. PKMT 신규 기판의 발견) 다음에 대상 라이신 위치에서 아미노산 잔기의 인식 NSD1 차별 인자 (K36이 실험에서) 여기서 도시. 데이터는 NSD1가 -2 페이지에서 방향족 잔류 물을 좋아 보여osition는 (위치 0으로 K36을 고려). 소수성 잔류 물은 세부 사항에 특유의 차이에도 불구하고, -1이 위치에 인식하고 있습니다. 한 사이트에서 기본 잔류 물 및 아미드가 바람직하다. 다른 사이트에서 일부 약한 환경,하지만 강한 잔류 특정 판독 검출되었다. B를 Scansite에서 예를 들어 검색) 스크린 샷, NSD1. C) 펩타이드 SPOT 배열 NSD1 긍정적와 함께 기판들 몇 가지 예측 소설을 포함 (H3K36 결정 특이성 프로파일을 사용하여 ) 및 음성 대조군 (H3K36A). 프리디 신규 대상의 일부가 강하게 (그들 중 일부는 주석) 메틸화하고, 다른 경우에는 예측을 검증 할 수 없었다. 패널 A와 C는 Kudithipudi 등으로부터 재생됩니다. (2014) 일부 수정 (19). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 베이스 | NMP 1 M Oxyma 순수 - 15 ml의 NMP에> 2,13 g Oxyma 순수 |
| 액티베이터 | 2.4 ml의 N, 15 ml의 NMP에 N '이소 프로필 카보 다이이 미드 |
| 상한 혼합물 | DMF 중 20 % 무수 아세트산 - 30 ㎖의 DMF> 6 ml의 무수 아세트산 |
| FMOC 탈 보호 | DMF 내의 20 % 피 페리 딘 - 1000 ml의 DMF에서> 200 ml의 |
| 사이드 체인 탈 보호 | 900 μL 이소 프로필 실란 + 600 μL의 DDH 2 O 30 ml의 TFA에서 |
| 염색 | DMF에 0.02 % 브로 모 페놀 블루 |
표 1 : 화학 혼합물 및 프로토콜에 사용되는 자신의 조성.
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Discussion
여기에 설명 된대로 합성 SPOT 단백질 - 단백질 상호 작용 부위를 맵핑하고 수정 펩티드 효소 기질 인식을 조사 할 수있는 강력한 방법이다. SPOT 방법에 의해 합성 된 펩타이드가이 각 인스턴스에서 확인하기 어려운 90 % 이상의 순도 21 것으로보고되었지만 때문에 SPOT 합성은 아직 특정 단점을 갖는다. 따라서, 결과는 예를 이용한 단백질 또는 도메인에 대한 표준 방법에 의해 합성, 정제 된 펩타이드와 다른 방법에 의해 재생되어야한다. 또한, SPOT 어레이들의 다른 중요한 단점은 재사용 할 수없는 대부분의 시간은 하나의 어레이 여러 세이를 수행하기 때문이다.
낮은 안정성 아미노산 합성의 효율을 높이기 위해 보호 된 아르기닌 마찬가지로 매 5 사이클들이 신선한 것이 중요하다. 효소 반응 또는 단백질 결합 연구에서 종종 펩티드 스폿의 주변부는 Mo가 있는지 관찰센터 ( "링 자리 효과")보다 신호 강도 재. 이 효과는 스폿의 중앙 부분 펩티드의 고밀도에 기인 할 수 있고,이어서,이를 펩티드 합성 (22)을 다운 스케일링함으로써 해결 될 수있다. 펩타이드의 추가의 문제점 해결을 위해 기계 수첩 종합과 회사의 서비스를 참고해야한다. 메틸화가 관찰되지 않는 경우, 양성 대조군 펩티드 (조사중인 효소에 의해 메틸화 것으로 공지 즉 펩티드) 막에 첨가한다.
SPOT 배열에 대체는, 고밀도 펩타이드 마이크로 어레이 (23)을 사용할 수 있습니다,하지만 그들은 더 비싸 사용을 위해 특수 장비가 필요합니다. 또한 스폿 당 펩티드의 양은 더 민감 판독 절차를 요구하는 작다. 단백질 어레이는 이러한 함수 (24, 25)을 연구 할 수 있지만, 각각의 단백질이 발현되고 정제 될 필요가 있기 때문에 그들이 제조하기가 더 어렵다배열에 단백질 접힘이 유지 될 필요가있다. 펩타이드 어레이의 또 다른 장점은 합성 과정에서 번역 후 변형의 도입 가능성 및 개별 아미노산 잔기의 역할의 돌연변이 시험의 용이성이다.
이것은이 프로토콜에 대한 필수적인 출발점, 조사중인 메틸화 효소에 의해 식별되는 하나 이상의 펩티드를 갖도록. 메틸화 조건 버퍼는 최적화뿐만 아니라 메틸화 된 농도되어야한다. 메틸화의 실시 시간 코스는 동적 범위의 손실이 발생할 것입니다 최고의 기판의 완전한 메틸화을 방지하기 위해 결정되어야한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
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