Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Направленный метод Эволюция Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

Направленный эволюция в Saccharomyces CEREVISIAE предлагает много привлекательных преимуществ при проектировании ферменты для биотехнологических приложений, процесс , который включает в себя строительство, клонированию и экспрессии мутантных библиотек, в сочетании с высокой частотой гомологичной рекомбинации ДНК в естественных условиях. Здесь мы приводим протокол для создания и библиотеки мутантных экрана у дрожжей, основанные на примере грибковой арил-спиртовой оксидазы (АОА), чтобы повысить его общую активность. Два сегмента белка были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем случайного мутагенеза и ин виво рекомбинации ДНК. Заходами ~ 50 б.п. фланкирующих каждый сегмент позволил правильную сборку гена ААО-фьюжн в линеаризованный вектор, что приводит к полной автономно тиражирование плазмиды. Мутант библиотеки , обогащенные функциональными вариантами ААО подвергали скринингу в S. CEREVISIAE супернатанты с чувствительным анализом с высокой пропускной способностью на основе реакции Фентона. Общий процессбиблиотека строительство в S. CEREVISIAE описанные здесь , могут быть легко применены к эволюции многих других эукариотических генов, избегая дополнительных ПЦР - реакций, экстракорпоральное ДНК - рекомбинации и лигирования шаги.

Introduction

Направленный молекулярная эволюция представляет собой надежный, быстрый и надежный метод для разработки ферментов 1, 2. Через итеративных раундов случайной мутации, рекомбинации и скрининга, улучшенные варианты ферментов могут быть сформированы , которые действуют на новых субстратах, в новых реакций, в ненатуральных среды, или даже помочь клетке для достижения новых целей обмена веществ 3-5. Среди хостов , используемых в направленной эволюции, дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE пивовара предлагает репертуар решений для функциональной экспрессии сложных белков эукариот, которые никаким иным образом не прокариотических аналогов 6,7.

Используется исчерпывающе в исследованиях клеточной биологии, эта маленькая эукариотической модель имеет много преимуществ с точки зрения пост-трансляционных модификаций, легкость манипулирования и преобразования эффективности, все из которых являются важными чертами инженеру ферментов путем направленной эволюции 8. Кроме того, высокая частотагомологичной рекомбинации ДНК в S. CEREVISIAE в сочетании с его эффективным устройством корректура открывает широкий спектр возможностей для создания библиотеки и сборки генов в живом организме , способствуя эволюции различных систем от отдельных ферментов до сложных искусственных путей 9-12. Наша лаборатория провела прошедшее десятилетие разработки инструментов и стратегий для молекулярной эволюции различных ligninases в дрожжах (оксидоредуктаз , участвующие в деградации лигнина в процессе естественного распада древесины) 13-14. В этой связи, мы представляем подробный протокол для подготовки и экран мутантные библиотеки в S. CEREVISIAE для модели flavooxidase, -арил-спиртовой оксидазы (ААО 15) -, который может быть легко переведено на многие другие ферменты. Протокол включает в себя целенаправленный направленный метод эволюции (морфингом мутагенный Организованная Рекомбинация процесса гомологичной в естественных условиях Группировка) при содействии аппарата дрожжевых клеток 16, А.Н.да очень чувствительный метод скрининг - анализа , основанный на реакции Фентона с целью определения активности AAO секретируемый в культуральный бульон , 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Мутант библиотека Строительство

  1. Выберите регионы , которые будут подвергнуты морфинговой с помощью вычислительных алгоритмов на основе доступных моделей кристаллической структуры или гомологии 18.
    1. Здесь цель две области ААО из вёшенка степная для случайного мутагенеза и рекомбинации (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), в то время как усиливающей остаток гена (844 пар оснований ) с помощью High-Fidelity PCR (рисунок 1).
      Примечание: Некоторые сегменты могут быть изучены с помощью морфинга в независимом или комбинированном образом 16.
  2. Amplify целевых областей с помощью мутагенной ПЦР. Создание перекрывающихся областей между сегментами (~ 50 б.п. каждая), накладывая ПЦР реакции определенных регионов.
    1. Готовят мутагенного ПЦР целевых сегментов в конечном объеме 50 мкл, содержащих ДНК-матрицы (0,92 нг / мкл), 90 нМ чувство олиго (RMLN для сегмента MI и ААО-BP для сегмента M-II), 90 нм аntisense праймер (ААО-92С для сегмента MI и RMLC для сегмента M-II), 0,3 мМ дНТФ (0,075 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО), 1,5 мМ MgCl 2, 0,05 мМ MnCl 2 и 0,05 ед / мкл Taq - ДНК - полимеразы. Грунтовки последовательности подробно описаны на рисунке 1.
    2. Используйте следующую программу ПЦР: 95 ° С в течение 2 мин (1 цикл); 95 ° С в течение 45 сек, 50 ° C в течение 45 сек, 74 ° С в течение 45 секунд (28 циклов); и 74 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
  3. Amplify не-мутагенными области с ультра-высокой точности воспроизведения полимеразы и включают в себя соответствующие зоны перекрытия мутагенные сегментов и / или линеаризованный вектор свесы.
    1. Подготовка реакционных смесей в конечном объеме 50 мкл, содержащем: ДНК-матрицы (0,2 нг / мкл), 250 нМ олиго чувство HFF, 250 нМ олиго антисмысловой HFR, 0,8 мМ дНТФ (0,2 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,02 ед / мкл ДНК - полимеразы iproof. Грунтовки последовательности подробно описаны в <сильный> Рисунок 1.
    2. Используйте следующую программу ПЦР: 98 ° C в течение 30 сек (1 цикл); 98 ° С в течение 10 сек, 55 ° C в течение 25 сек, 72 ° С в течение 45 сек (28 циклов); и 72 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
      Примечание: В условиях , описанных в 1.2 и 1.3 из 43 наложений пар оснований (плазмида-М1 область); 46 пар оснований (M1 область ВЧ-область); 47 пар оснований (HF область-M2 область) и 61 пар оснований (M2 регионализация плазмида) предназначены (Рисунок 1) с целью способствовать в естественных условиях сплайсинга у дрожжей.
    3. Очищают все фрагменты ПЦР (мутагенные и мутагенными) с использованием набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
  4. Линеаризовать вектор таким образом, что фланговые области примерно 50 пар оснований, которые созданы гомологичны 5'- и 3'-концов гена-мишени.
    1. Готовят реакционную смесь , содержащую линеаризация 2 мкг ДНК, 7,5 U Bam HI, 7,5 U Xho I, 20 мкг БСА и 2 мкл буфера Baм HI 10x в конечном объеме 20 мкл.
    2. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 2 ч и 40 мин. Затем продолжить инактивацию при 80 ° С в течение 20 мин.
  5. Очищают линеаризованного вектора путем экстракции в геле агарозы , чтобы избежать загрязнения с остаточной кольцевой плазмиды (рисунок 2).
    1. Нагрузка реакции переваривания смесь в мега-лунку полупрепаративной с низкой температурой плавления агарозном геле (0,75%, вес: объем), а также аликвоту (5 мкл) реакционной смеси в смежный хорошо в качестве репортера.
    2. Запуск ДНК-электрофорез (5 В / см между электродами, 4 ᵒC) и отделяют агарозный гель, соответствующий мега-колодец и хранить его при температуре 4 ᵒC в 1x TAE.
    3. Пятно полосу с молекулярной массой лестницы и репортера. Визуализируйте полосы под действием УФ-света. Ник положение, в котором линеаризованный вектор места.
      Примечание: Поскольку качество очищенного линеаризованной вектора является critiкал фактором успешной рекомбинации и сборки в дрожжах, избежать гель для окрашивания электрофореза полупрепаративной ДНК. Использование красителей и УФ - облучения для экстракции геля может повлиять на стабильность вектора ДНК, ставя под угрозу в естественных условиях эффективность рекомбинации. В качестве альтернативы токсичных EtBr красителей, гель Красный и SYBR красители обычно используются для окрашивания геля.
    4. При отсутствии УФ-излучения, определить линеаризованного вектора во фрагменте мега-луночного с использованием указаний о зарубок в окрашенном репортер полосу таким образом, чтобы его можно выделить.
    5. Извлечение линеаризованного вектора из агарозы и очищают его с помощью набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: Используйте высокого копирования челночные векторы с эписомными антибиотических и ауксотрофию маркеров: В этом примере мы использовали урацил независимый и ампициллину pJRoC30 вектор под контролем промотора дрожжей GAL1.
  6. Приготовьте эквимолярное миxture фрагментов ПЦР и смешать его с линеаризованной вектора в соотношении 2: 1, с не менее чем 100 нг линеаризованной плазмиды (тест различных соотношениях эквимолярная библиотеки / открытого вектора для достижения хороших урожаев трансформации).
    1. Измеряют поглощение фрагментов ПЦР и линеаризованный вектор при 260 нм и 280 нм для определения их концентрации и чистоты.
  7. Transform дрожжевых компетентных клеток со смесью ДНК с использованием набора для коммерческого трансформации дрожжей (см таблицу поставок) в соответствии с инструкциями изготовителя.
    1. При этом используют дефицитный по протеазе и URA3 - зависимой S. CEREVISIAE штамм BJ5465. Трансформации клеток с родительским замыкают в цикл вектора в качестве внутреннего стандарта в ходе скрининга (см ниже). Кроме того, проверьте фона путем преобразования линеаризованного вектора в отсутствие ПЦР-фрагментов.
      Примечание: В случае обнаружения начальных низких уровней секреции, используют S.CEREVISIAE с дефицитом протеазы , такие как штаммы BJ5465 способствовать накоплению активного белка в супернатантах культур. Если целевой фермент подвергается гипергликозилирование, использование гликозилирования-дефицитных штаммов (например, Δ kre2 что только способен прикрепляться меньшие маннозы олигомеры) может быть подходящим вариантом.
  8. Тарелка трансформированные клетки на SC отсева учащихся из пластин и инкубировать их при 30 ° С в течение трех дней. Пластина (на SC отсева учащихся из пластин , дополненной урацил) URA3 - S. Клетки CEREVISIAE , не имеющие плазмиды в качестве отрицательного контроля для скрининга (см ниже).

2. Высокопроизводительный скрининг анализа (рисунок 3)

  1. Заполните соответствующее количество стерильных 96-луночных планшетах (23 пластин для анализа библиотеки клонов 2000) с 50 мкл минимальной среды на лунку с помощью пипетки робота.
  2. Выберите отдельные колонии из SC-выпадении пластин и передавать их на 96-луночные планшеты,
    1. В каждой пластине, прививают номер столбца 6 с родительским типом в качестве внутреннего стандарта и хорошо H1 с URA3 - S. Клетки CEREVISIAE (в SC среде , дополненной урацил) без плазмиды в качестве отрицательного контроля.
      Примечание: Ну H1 заполняется конкретно бросивших среде с добавлением урацила. Пустое лунку, содержащую носитель без клеток, могут быть также получены в качестве дополнительного контроля стерильности.
  3. Покрывал пластины с их крышками и завернуть их в парафильмом. Инкубируйте пластин в течение 48 ч при 30 ° С, 225 оборотов в минуту и ​​80% относительной влажности во влажной шейкере.
  4. Удалите парафином, добавьте 160 мкл экспрессионной среды в каждую лунку с помощью пипетки робота, запечатать пластины и инкубировать их в течение еще 24 часов.
    Примечание: минимальная среда и выражение среды получают , как описано в другом месте 19. Уровни секреции могут варьироваться в зависимости от исследуемого гена и, соответственно, тон инкубацией раз должен быть оптимизирован в каждом конкретном случае для синхронизации роста клеток во всех лунках.
  5. Центрифуга пластины (мастер - пластинки) , при 2800 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  6. Передача 20 мкл надосадочной жидкости из лунок в основной пластины к репликам пластины с использованием жидкости обработки роботизированную мультистанционной.
    Примечание: Для того, чтобы благоприятствовать фермента секреции рекомендуется заменить нативный сигнальный пептид белка - мишени с помощью сигнальных пептидов , обычно используемых для гетерологичной экспрессии в дрожжах (например, коэффициент α препропоследовательность лидер, лидер K 1 Убийца токсина из S. CEREVISIAE, или даже химерные варианты обоих пептидов 13). В качестве альтернативы, нативный сигнальный пептид, может быть исключительно эволюционировали для секреции в дрожжах.
  7. Добавьте 20 мкл 2 мМ р -methoxybenzylalcohol в 100 мМ натрий - фосфатном буфере , рН 6,0 с помощью пипетирования робота. Перемешать пластины кратко с 96-мыLL планшет-миксер и инкубировать их в течение 30 мин при комнатной температуре.
  8. С пипетирования робота, добавьте 160 мкл реагента FOX на каждую реплику пластины и кратко перемешать смеситель (конечная концентрация ЛИС смеси в скважине: 100 мкМ ксиленол оранжевый, 250 мкМ Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 и 25 мМ H 2 SO 4).
    1. Добавьте несколько добавок к реагенту для повышения чувствительности, такие как органические сорастворители (ДМСО, этанол, метанол) или сорбитол 17. Здесь, усиливают реакцию путем добавления сорбитол до конечной концентрации 100 мМ (рисунок 4).
  9. Прочитайте пластины (режим конечной точки, т 0) при 560 нм на планшет - ридере.
  10. Инкубируйте пластин при комнатной температуре , пока цвет не разрабатывает и измерить поглощение снова (T 1).
    1. Вычислить относительную активность от разности между значением Abs после инкубации и у исходного измерения нормирована на ПАРЕntal типа для каждой пластины (t 1 - T 0).
  11. Тема лучшие мутантные хиты в двух последовательных повторных показов, чтобы исключить ложные срабатывания.
    Примечание: Как правило, повторные скрининги включают выделения плазмид из дрожжей, амплификации и очистки в кишечной палочки, а затем трансформации свежих дрожжевых клеток с плазмидой 19. Каждый выбранный клон повторно показан в pentaplicate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ААО от P. eryngii является внеклеточным flavooxidase , который поставляет грибковые пероксидазы с H 2 O 2 , чтобы начать атаковать лигнина. Два сегмента AAO были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем морфинга в целях повышения его активности и его экспрессию в S. CEREVISIAE 19. Независимо от иностранных ферментов укрывал на S. CEREVISIAE, самый важный вопрос при создании мутантных библиотек в дрожжах относится конструирование конкретных перекрывающихся регионов в пользу сращивание между фрагментами и их клонирования в линеаризованный вектор. В данном примере, для каждой реакции ПЦР, все фрагменты были заходами приблизительно 50 пар оснований, чтобы способствовать в естественных условиях сплайсинга в дрожжах. Число событий рекомбинации зависит от количества сегментов , которые будут собраны и клонировали с линеаризованной вектором (то есть два пересекающихся события имели место междутри сегмента PCR -The два мутагенных сегменты , фланкирующие не-мутагенезу сегментные- плюс два дополнительных кроссоверы с линеаризованный вектор, рисунок 1). По нашему опыту, перекрывающиеся последовательности длиной более 50 пар оснований уменьшает вероятность внутренней рекомбинации в то время как они не улучшают эффективность трансформации.

Мутационные нагрузки были скорректированы путем отбора проб мутантные библиотек с различными ландшафтами, вычисляя число клонов с <10% от активности фермента родителей, а в дальнейшем их проверки путем секвенирования случайной выборки активных и неактивных вариантов (рис 5А). Для определения коэффициента дисперсии S. CEREVISIAE клетки были трансформированы с родительским ААО и высевали на чашки с SC-выпавшей пластин. Отдельные колонии собирали и инокулировали в 96-луночного планшета и активность клонов оценивали из свежих препаратов. мутагенный образец2 (Taq / MnCl 2 0,05 мМ) была выбрана в качестве отправной точки для создания библиотеки и скрининга.

По мере того как биологическая активность AAO увеличивает концентрацию H 2 O 2 в реакционной среде, мы искали чувствительного и точного анализа , чтобы количественно оценить незначительные изменения в H 2 O 2. ЛИС является химический метод , основанный на реакции Фентона 20, в результате чего окисление H 2 O 2 привода реакции Fe 3+ с ксиленоловым оранжевого цвета с образованием сине-фиолетовый комплекс (о -cresolsulfone-фталеин 3 ', 3' '- бис (метилимино) диацетат ε 560 = 1,5 × 10 4 М -1 см -1). Стадию окисления черных амплифицировали путем добавления сорбита для повышения чувствительности анализа, увеличивая распространение радикалов с кажущейся е 560 = 2,25 х 10 5 М -1 см -1 (Fi4 цифра).

Предел обнаружения этого анализа (в мкМ диапазоне) рассчитывалась по методу определения заготовки в 96-луночный планшет со стандартами в трех экземплярах (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 и 4 мкМ H 2 O 2 ) и с помощью нескольких супернатанатах S. CEREVISIAE недостает URA3 - плазмиды (рис 5б). Анализ был линейным в присутствии сорбита (до 8 мкМ H 2 O 2), и хотя линейность был более настойчив в отсутствие этого сахара (по крайней мере до 30 мкМ H 2 O 2) ответ был слабее , (например, при 6 мкМ H 2 O 2, усовершенствованный стандарт 4 раза был получен в присутствии сорбитола -deep purple- из оптической плотности 0.24 при его отсутствии -Темный оранжево (фиг.5В)). Отношения между Абс и концентрацией ААО оценивали с увеличением количества енаблюдалась nzyme (из дрожжевых супернатантов) и линейный отклик; R 2 = 0,997 (5С).

Следует отметить, что сигнал ЛИС был стабилен в течение нескольких часов без каких-либо видимых помех со стороны различных элементов в культуральной жидкости. Расчетная чувствительность FOX составляла ~ 0,4 мкМ H 2 O 2 , полученного с помощью ААО в супернатанте в присутствии сорбитола и ~ 2 мкМ в его отсутствие.

Мутант библиотека 2000 клонов была построена и просеивают с этим анализом. Несколько мутантов AAO были идентифицированы с улучшенной секреции заметно и активностью против р метоксибензил спирта (рис 5D) 19.

Рисунок 1
Рисунок 1.. Морфинговой Протокол для ААО эволюции две различные области AAO были предназначены для случайного мутагенеза и рекомбинации: M1 (голубой, 590 пар оснований ) , который включает сигнальный пептид (SP); M2 (желтый, 528 пар оснований). Область HF (серый, 844 пар оснований) амплифицировали с высокими полимераз верности. Мутагенные области были отображены в кристаллической структуре ААО (PDB ID: 3FIM). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Приготовление продуктов ПЦР и линеаризованный вектор (А) Аналитический агарозном геле (1% вес: объем). Содержащий молекулярный маркер вес (1 кб лестничную) , на дорожках 1 и 7; линеаризованные вектор Bam HI и Xho I, дорожка 2; ПЦР сегмент M1, полоса 3; PCR сегмент M2, полоса 4; ПЦР сегмент HF, полоса 5; в стИво повторно собран вектор линеаризованной с Nhe I (содержащий полный ген AAO с регионами MI, HF и M-II), полоса 6. (B) Вектор линеаризация, полосы 1 и 6 молекулярные стандарты, 1 Kb лестницы; плазмиду Минипрепарат, дорожка 2; плазмиду линеаризуется с NHe I, полоса 3; плазмида линеаризуется с Bam HI и Xho I, полоса 4; Линеаризованная плазмиду получают путем экстракции геля и очистки после переваривания, полоса 5. (C) протокола для очистки плазмиды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. высокопроизводительного скрининга протокола. Обзор процесса. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное версион этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Метод ЛИС. Белый гнили грибы нападают на клеточную стенку древесины посредством реакции Фентона , который производит гидроксильный радикал ОН •. Метод пары ЛИСИЦЫ это реакция на ксиленоловым оранжевый (ХО), и поглощение ХО-Fe 3+ комплекса измеряется при 560 нм. Окисления черных усиливается добавлением сорбита в смеси реагентов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. мутагенные Пейзажи для морфинга библиотек с использованием различных ПЦР к ошибкам условий и Validation экранирующего Количественное определение. (A нг>) морфинговой пейзажи. Сплошная горизонтальная линия показывает активность родительского типа в тесте а пунктирные линии показывают коэффициент дисперсии анализа. Проценты показывают количество клонов с менее чем 10% от активности фермента родительским. Работы построены в порядке убывания. (B) Предел обнаружения ЛИС оценивали с увеличением концентрации H 2 O 2 в присутствии (черные кружки) и отсутствие (белые квадраты) сорбита. (C) Линейная корреляция между концентрацией ААО (трансформированные супернатантов) и Abs 560 нм. Каждая точка соответствует среднему значению 8 экспериментов и включает в себя стандартное отклонение. (D) Mutant библиотека пейзаж. Выбранные варианты (слежка квадрат) были снова просеивают , как сообщалось в другом месте 19. Сплошная линия показывает активность ААО родительского типа.> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы суммировали большинство советы и приемы используются в нашей лаборатории для конструирования ферментов с помощью направленной эволюции в S. CEREVISIAE ( с использованием Aao в качестве примера) , таким образом , что они могут быть адаптированы для использования с многими другими системами эукариотических ферментов просто следуя общий подход , описанный здесь.

С точки зрения создания библиотеки, морфинг является быстрый метод один горшок , чтобы ввести и рекомбинируют случайные мутации в небольших участках белка, оставляя остальные участки белка неизмененном 16. Библиотеки с несколькими мутационных нагрузок могут быть легко получены и рекомбинируют в естественных условиях, наряду с линеаризованной плазмидой, чтобы создать полный автономно реплицирующийся вектор. Очень важно , что перекрывающие последовательности обрамляют каждую растяжку , чтобы позволить фрагменты полноразмерного гена должны быть собраны путем рекомбинации в естественных условиях, избегая дополнительных реакций ПЦР и лабораторных стадий лигирования в. В этом рrotocol, частота кроссоверов событий между ПЦР-фрагменты могут быть увеличены за счет уменьшения размера перекрывающихся областей, хотя это может поставить под угрозу эффективность трансформации. Независимо от того, ДНК - полимераз , используемых для мутагенной ПЦР, мутационный нагрузки можно регулировать с помощью предварительно построения и анализа малых мутант библиотечные ландшафтов (рис 5А). Если комплект GeneMorph II используется, он по - прежнему целесообразно использовать такой подход , так как в естественных условиях рекомбинации ДНК может заметно изменить мутационные нагрузки оцененные производителем. В общих чертах, мутантные ландшафты, в которых 35 - 50% от общего числа клонов экранированных осталось менее 10% от родительской активности подходят для направленной эволюции кампаний, хотя это число изменяется в зависимости от целевого белка и его активность. Как правило, анализ мутантных библиотек ландшафтов дополнительно проверяется секвенирования ДНК методом случайной выборки мутантов. В текущем примере, TaqДНК-полимеразу использовали из-за его высокой частотой появления ошибок, что связано с отсутствием 3'→ 5'proof-чтение экзонуклеазной активности. Мутационный нагрузки в библиотеках Taq были изменены путем добавления различных концентраций MnCl 2, но использование несбалансированных дНТФ и / или снижения концентрации шаблонных генов также подходящие варианты. Присущие ограничения морфинговой происходят из числа сегментов рекомбинировать. По нашему опыту, до четырех белковых блоков (пять кроссоверов событий подсчета областей рекомбинации с вектором линеаризованной) может быть сращены с хорошими выходами преобразования (~ 10 5 клонов в реакции трансформации). Этот метод может быть легко модифицирован для выполненного мутагенеза сайт множественного насыщения (например, с использованием NDT вырожденных праймеров или создания вырождением в течение 22 уникальных кодонов) , чтобы исследовать несколько позиций одновременно, значительно снижая усилия скрининга 21,22.

"слепой" протокол скрининга для ААО является чрезвычайно чувствительным и надежным (на основе прямого детектирования H 2 O 2 , независимо от используемого субстрата ферментом), представляющий собой комплементарную анализа с другими хорошо установлено косвенное протоколы для обнаружения пероксидов (в основном сцепные пероксидазы с колориметрических субстратов). Действительно, анализ ЛИС был обычно используется для измерения H 2 O 2 в биологических жидкостях, и теперь ее можно легко перевести в протоколы развиваться Aao и любой другой H 2 O 2 продуцирующие ферменты (например, глюкозы оксидазы, целлобиозного дегидрогеназы, глиоксаля оксидазы, метанол оксидазы), в частности, на осуществление деятельности по ненатуральных подложках, где ответы являются иначе трудно обнаружить.

S.cerevisiae , является наиболее адекватным хозяином для направленной эволюции эукариотических генов , поскольку он предлагает высокую эффективность преобразования (до 1 х 106 трансформантов / мкг ДНК), он выполняет сложный пост-трансляционной обработки и модификации (включая N- и С-терминальной обработки, а также гликозилирование) и экспортирует чужеродные белки в культуральный бульон , через секреторный путь. Кроме того, хорошо зарекомендовавшие себя инструменты молекулярной биологии доступны для работы с этим дрожжам, в том числе одно- или двунаправленным эписомными (не интегративный) челночных векторов под контролем промоторов различной силы. И последнее , но не в последнюю очередь, его высокая частота гомологичной рекомбинации ДНК позволило ряд методов должны быть разработаны для получения разнообразия ДНК , которые в настоящее время используются для эволюции одиночных белков, а также более сложные пути фермента 8, 12, 13, 23. естественных условиях разрыв ремонт в и корректура устройство этих дрожжей могут быть также использованы для создания химер , когда рекомбинировать различные гены (с прибл. 60% идентичности последовательности ДНК), а также перетасовать лучшим потомком / мутации из Directed эволюция кампании или собрать вместе в пробирке и в естественных условиях методов рекомбинации в одном раунде эволюции, тем самым обогащая мутантные библиотеки с точки зрения foldability и функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Not I restriction enzyme New England Biolabs R0189S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name Company Catalog Number Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
7. Plates
96-well plates Greiner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greiner Bio-One 655161 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greiner Bio-One 656171 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Tags

Молекулярная биология выпуск 110 направленной эволюции, сфокусированного случайный мутагенез с высокой пропускной способностью скрининга
Направленный метод Эволюция<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em&gt;: Mutant Создание и скрининг библиотеки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viña-Gonzalez, J.,… More

Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter