Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires
Summary
Un règlement de réglage fin de la transcription des gènes à la base embryonnaire décision du destin cellulaire. Nous décrivons ici des analyses d'immunoprécipitation de chromatine utilisées pour étudier la régulation épigénétique de la différenciation cardiaque des cellules souches et le développement cardiaque d'embryons de souris.
Abstract
la transcription du gène spécifique est un processus biologique essentiel qui sous-tend la cellule décision de devenir au cours du développement embryonnaire. Le processus biologique est médiée par des facteurs de transcription qui lient les régions régulatrices génomiques comprenant des activateurs et des promoteurs de gènes constitutifs cardiaques. L'ADN est enroulé autour histones qui sont soumis à des modifications chimiques. Les modifications des histones conduisent en outre refoulé, activé ou en équilibre la transcription des gènes, ce qui porte un autre niveau de régulation de réglage fin de la transcription du gène. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) récapitulent au sein des corps embryoïdes (ie, des agrégats cellulaires) ou en culture 2D les étapes précoces du développement cardiaque. Ils fournissent en principe matériel suffisant pour chromatine immunoprécipitation (ChIP), une technologie largement utilisée pour identifier des régions régulatrices de gènes. En outre, les cellules ES humaines représentent un modèle de cellules humaines de cardiogenèse. Aux stades ultérieurs de développement, les tissus embryonnaires de souris permettentenquêter sur les paysages épigénétiques spécifiques nécessaires à la détermination de l'identité cellulaire. Nous décrivons ici les protocoles de ChIP, ChIP séquentielle suivie par PCR ou ChIP-séquençage en utilisant des cellules ES, des corps embryoïdes et régions embryonnaires spécifiques cardiaques. Ces protocoles permettent d'étudier la régulation épigénétique de la transcription du gène cardiaque.
Introduction
Le cœur est le premier organe à être formé et devenir fonctionnel dans l'embryon. Le coeur est construit à partir de plusieurs lignées cellulaires qui proviennent des premier et second champs cardiaques embryonnaires 1. De stade blastocyste post-fécondation jusqu'à la forme de coeur, les cellules embryonnaires doivent donc prendre de nombreuses décisions du destin cellulaire. La transcription des gènes est régulée de manière dépendante du temps et de l'espace et est un processus biologique essentiel qui sous-tend la cellule décision de devenir au cours du développement embryonnaire. Un tel processus est médié par des facteurs de transcription spécifiques qui se lient à des régions régulatrices du génome comprenant les amplificateurs et les promoteurs des gènes constitutifs cardiaques. L'ADN est enroulé autour histones qui sont soumis à des modifications telles que l'acétylation, une méthylation, une ubiquitinylation, et / ou la phosphorylation. La modification des histones conduit à la transcription du gène refoulé, activé ou en équilibre en fonction de ce qui est modifié résidu de lysine de l' histone 2.
jove_content "> chromatine immunoprécipitation dosage (ChIP) a été mis en place il y a 3 ans et est actuellement la technologie la plus largement utilisée dans le but d'identifier des cibles de soit histones modifiées ou des facteurs de transcription 4. Après immunoprécipitation des histones ou des facteurs de transcription, ADN lié peut être soit amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou séquencée. ChIP a techniquement surmonter les plus difficiles des essais de retard sur gel 5. Cependant ChIP ne signifie pas la liaison directe d'un facteur de transcription à l' ADN, un avantage du dosage de retard sur gel. d'autre part, ChIP combinée à un séquençage d'ADN a ouvert une nouvelle perspective du génome entier sur la régulation des gènes.Les cellules ES (cellules ES) récapitulent à l'intérieur des corps embryoïdes ( par exemple des agrégats cellulaires.,) Ou en culture 2D les premières étapes du développement cardiaque 6 et fournissent , en principe , suffisamment de matériel pour les copeaux. En outre, les cellules ES humaines représentent un modèle cellulaire humaine de cardiogenesis bien que leur potentiel cardiogénique dépend de leur signature épigénétique 7. Aux stades ultérieurs de développement, les tissus embryonnaires de souris permettent d'enquêter sur les paysages épigénétiques spécifiques nécessaires à la détermination de l'identité cellulaire. Cependant, le génome est transcrit dans un type spécifique de temps et de manière cellule 8. la régulation épigénétique de la transcription génique doit être étudiée dans des régions localisées. Nous décrivons ici les protocoles de ChIP, ChIP séquentielle suivie par PCR ou séquençage en utilisant des cellules ES, des corps embryoïdes et régions embryonnaires spécifiques cardiaques. Ces protocoles permettent d'étudier la régulation épigénétique de la transcription du gène cardiaque.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'épigénétique est devenue un domaine important de la recherche en biologie du développement. Comment un programme génétique est activé dans les cellules embryonnaires pour permettre aux cellules d'acquérir une identité spécifique au sein d'une lignée embryonnaire a été pendant longtemps une question clé pour les biologistes du développement.
ChIP a été largement utilisé dans les dernières années, et combiné à un séquençage d'ADN suivante amélioration…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
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