Эпигенетическое регуляции сердечной дифференциации эмбриональных стволовых клеток и тканей
Summary
Тонкая настройка регуляции транскрипции генов лежит в основе эмбриональных клеток решения судьбы. Здесь мы опишем иммунопреципитации хроматина, используемые для изучения эпигенетической регуляции как сердца дифференцировки стволовых клеток и развития сердца эмбрионов мыши.
Abstract
Конкретная транскрипции гена является ключевым биологическим процессом, который лежит в основе решения судьбы клеток во время эмбрионального развития. Биологический процесс опосредуется факторами транскрипции, которые связывают геномных регуляторных областей, включая усилителями и пропагандистов сердца конститутивных генов. ДНК обернута вокруг гистонов, которые подвергают химической модификации. Модификации гистонов дополнительно приводят к подавленной, активировать или уравновешенного транскрипции генов, в результате чего еще один уровень тонкой регуляции настройки транскрипции генов. Эмбриональные стволовые клетки (ES – клетки) резюмировать в эмбриональных телец (т.е. клеточные агрегаты) или в 2D культуре на ранних ступенях развития сердца. Они обеспечивают в принципе достаточно материала для иммунопреципитации хроматина (CHIP), технология широко используется для идентификации генов регуляторных областей. Кроме того, ЭС клетки человека представляют собой клеточную модель человека из кардиогенеза. На более поздних стадиях развития, мышиных эмбриональных тканей позволяютисследуя конкретные эпигенетические ландшафты, необходимые для определения идентичности клеток. Здесь мы описываем протоколы чиповых, последовательного ChIP с последующей ПЦР или брелка-секвенирования с использованием ES-клеток, эмбриональных телец и сердечные специфические эмбриональные регионы. Эти протоколы позволяют исследовать эпигенетической регуляции сердечного транскрипции генов.
Introduction
Сердце является первым органом, который будет сформирован и стать функциональным в зародыше. Сердце строится из многих клеточных клонов , которые вытекают из первого и второго полей эмбриональных сердца 1. От после оплодотворения бластоцисты стадии до форме сердца, эмбриональные клетки имеют, таким образом, чтобы принимать множество решений клеточных судеб. Транскрипции генов регулируется в во времени и пространстве-зависимым образом и является ключевым биологическим процессом, который лежит в основе решения судьбы клеток во время эмбрионального развития. Такой процесс опосредовано специфическими факторами транскрипции, которые связываются регуляторные области в пределах генома, включая энхансеры и промоторы генов сердечных конститутивные. ДНК обернута вокруг гистонов, которые подвергаются модификации, такие как ацетилирование, метилирование, убиквитинилирование, и / или фосфорилирования. Модификация гистонов приводит к подавленной, активировать или уравновешенного транскрипции генов в зависимости от которой остаток лизина гистона модифицированного 2.
jove_content "> иммунопреципитации хроматина анализ (ЧИП) была создана лет назад 3 и в настоящее время является наиболее широко используемой технологией с целью выявления целей либо модифицированных гистонов или транскрипционных факторов 4. Следуя иммунопреципитации гистонов или факторов транскрипции, связанной ДНК может быть либо усиливается с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенировали. ЧИП имеет технически преодолеть более сложные гель замедляющие анализы 5. Однако ЧИП не подразумевает прямого связывания фактора транскрипции с ДНК, преимущество геля замедляющей анализа. с другой стороны, чиповых в сочетании с секвенирования ДНК открыло новую геному перспективу регуляции генов.ES – клетки (ES – клетки) резюмировать в эмбриональных органов (то есть., Клеточные агрегаты) или в 2D культуре на ранних стадиях развития сердца 6 и обеспечить в принципе достаточно материала для микросхеме. Кроме того, ЭС клетки человека представляют собой клеточную модель человеческого Саrdiogenesis хотя их кардиогенный потенциал зависит от их эпигенетической подписи 7. На более поздних стадиях развития, мышиных эмбриональных тканей позволяют исследовать специфические эпигенетические ландшафты, необходимые для определения идентичности клеток. Тем не менее, геном расшифрован таким образом , 8 типоспецифичной затрат времени и клеток. Эпигенетическая регуляция транскрипции генов должен быть изучен в локализованных областях. Здесь мы описываем протоколы чиповых, последовательного ChIP с последующей ПЦР или секвенирования с использованием ES-клеток, эмбриональных телец и сердечные специфические эмбриональные регионы. Эти протоколы позволяют исследовать эпигенетической регуляции сердечного транскрипции генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetics стала важной областью исследований в области биологии развития. Как генетическая программа активируется в эмбриональных клетках, чтобы позволить клеткам приобретать определенную идентичность в эмбриональном линии был в течение длительного времени является ключевым вопросом…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
Riferimenti
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
- Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
- Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
- Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
- Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
- Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
- Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
- Brind’Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).
