Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti
Summary
Un regolamento messa a punto della trascrizione genica alla base embrionali decisione destino della cellula. Qui, descriviamo immunoprecipitazione della cromatina utilizzati per indagare regolazione epigenetica di entrambi differenziazione cardiaca delle cellule staminali e sviluppo cardiaco di embrioni di topo.
Abstract
Specifico trascrizione genica è un processo biologico fondamentale che sta alla base decisione destino delle cellule durante lo sviluppo embrionale. Il processo biologico è mediata da fattori di trascrizione che si legano regioni regolatorie genomiche compresi stimolatori e promotori di geni costitutivi cardiaci. DNA è avvolto attorno istoni che sono sottoposti a modificazioni chimiche. Le modifiche degli istoni ulteriormente portano a repressa, attivo o in bilico la trascrizione del gene, portando così un altro livello di regolazione fine messa a punto della trascrizione genica. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) ricapitolano entro corpi embrionali (cioè aggregati di cellule) o in coltura 2D primi passi dello sviluppo cardiaco. Essi forniscono in linea di principio abbastanza materiale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), una tecnologia ampiamente utilizzata per identificare geni regioni regolatorie. Inoltre, le cellule ES umane rappresentano un modello di cellule umane di cardiogenesis. Alle successive fasi di sviluppo, di topo tessuti embrionali consentonoindagare specifici paesaggi epigenetici necessarie per la determinazione dell'identità cellulare. Qui, descriviamo i protocolli di Chip, ChIP sequenziale seguita da PCR o chip-sequenziamento utilizzando cellule ES, corpi embrionali e cardiaci regioni embrionali specifiche. Questi protocolli consentono di indagare la regolazione epigenetica della trascrizione genica cardiaca.
Introduction
Il cuore è il primo organo a formarsi e diventare funzionale nell'embrione. Il cuore è costruito da molte linee cellulari che nascono dal primo e dal secondo campo cardiaci embrionali 1. Dal blastocisti post-fecondazione in scena fino alla forma di cuore, le cellule embrionali devono quindi prendere molte decisioni destino delle cellule. Gene trascrizione è regolata in modo tempo e spazio-dipendente ed è un processo biologico fondamentale che sta alla base decisione destino delle cellule durante lo sviluppo embrionale. Tale processo è mediato da specifici fattori di trascrizione che si legano regioni regolatorie all'interno del genoma compresi stimolatori e promotori di geni costitutivi cardiaci. DNA è avvolto attorno istoni che sono sottoposti a modificazioni come acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, e / o fosforilazione. Modificazione degli istoni porta a repressa, attivo o in bilico la trascrizione del gene a seconda di quale lisina residuo dell'istone viene modificato 2.
jove_content "> test di immunoprecipitazione della cromatina (chip) è stato istituito anni fa 3 ed è attualmente la tecnologia più ampiamente utilizzato al fine di identificare gli obiettivi di una istoni modificati o fattori di trascrizione 4. In seguito immunoprecipitazione degli istoni o fattori di trascrizione, DNA legato può essere sia amplificato mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) o sequenziato. ChIP è tecnicamente superato i test più impegnativi gel ritardo 5. Tuttavia ChIP non implica legame diretto di un fattore di trascrizione di DNA, un vantaggio di test gel ritardo. D'altra parte, ChIP combinati per il sequenziamento del DNA ha aperto una nuova prospettiva genome-wide sulla regolazione genica.Cellule staminali embrionali (cellule ES) ricapitolano entro corpi embrionali (es., Aggregati di cellule) o in coltura 2D primi passi dello sviluppo cardiaco 6 e dispongono di massima abbastanza materiale per chip. Inoltre, le cellule ES umane rappresentano un modello di cellule umane di cardiogenesis anche se il loro potenziale cardiogenico dipende dalla loro firma epigenetica 7. Alle successive fasi di sviluppo, di topo tessuti embrionali consentono di indagare specifici paesaggi epigenetici necessarie per la determinazione dell'identità cellulare. Tuttavia, il genoma è trascritto in un tempo e di cellule specifiche del tipo maniera 8. regolazione epigenetica della trascrizione genica deve essere studiato all'interno delle regioni localizzate. Qui, descriviamo i protocolli di Chip, ChIP sequenziale seguita da PCR o sequenziamento utilizzando cellule ES, corpi embrionali e cardiaci regioni embrionali specifiche. Questi protocolli consentono di indagare la regolazione epigenetica della trascrizione genica cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'epigenetica è diventato un importante campo di ricerca in biologia dello sviluppo. Come un programma genetico viene attivato nelle cellule embrionali per consentire alle cellule di acquisire una specifica identità all'interno di un lignaggio embrionale è stato per lungo tempo una questione chiave per biologi dello sviluppo.
Chip è stato ampiamente utilizzato negli ultimi anni e combinati per il sequenziamento del DNA in seguito miglioramento della risoluzione di sequenziamento….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
Riferimenti
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
- Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
- Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
- Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
- Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
- Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
- Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
- Brind’Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).
