Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos
Summary
Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.
Abstract
a transcrição do gene específico é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. O processo biológico é mediada por factores de transcrição que se ligam a regiões reguladoras genómicas incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvido em torno histonas que são sujeitas a modificações químicas. Modificações das histonas ainda levar a transcrição de genes reprimida, activado ou equilibrado, trazendo assim mais um nível de regulamentação sintonia fina da transcrição de genes. As células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ou seja, agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco. Eles fornecem material suficiente em princípio para imunoprecipitação da cromatina (ChIP), uma tecnologia amplamente utilizada para identificar regiões reguladoras de genes. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano de cardiogenesis. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitirinvestigando paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou chip-sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.
Introduction
O coração é o primeiro órgão a ser formada e para se tornar funcional no embrião. O coração é construído a partir de muitas linhagens de células que surgem a partir dos primeiro e segundo campos cardíaco embrionário 1. A partir do blastocisto pós-fertilização organizar-se para o coração em forma, as células embrionárias têm, assim que tomar muitas decisões destino celular. Gene transcrição é regulada de forma tempo e dependente do espaço e é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. Um tal processo é mediada por factores de transcrição específicos que se ligam a regiões reguladoras dentro do genoma incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvida em torno de histonas, que são sujeitos a modificações tais como acetilação, metilação, ubiquitinação, e / ou fosforilação. Histona modificação conduz a transcrição do gene reprimida, activado ou preparada dependendo de qual o resíduo de lisina de histona é modificado 2.
jove_content "> ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), foi criado anos atrás 3 e é atualmente a tecnologia mais amplamente utilizada, a fim de identificar alvos, tanto de histonas modificadas ou fatores de transcrição 4. Após imunoprecipitação de histonas ou fatores de transcrição, o DNA ligado pode ser quer amplificado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou sequenciados. chip tem tecnicamente superar mais desafiantes ensaios de retardamento em gel 5. no entanto chip não implica a ligação directa de um factor de transcrição de ADN, uma vantagem do ensaio de retardamento em gel. por outro lado, Chip combinados para sequenciamento de DNA, abriu uma nova perspectiva de todo o genoma na regulação dos genes.Células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ie., Agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco 6 e fornecer material suficiente em princípio para o chip. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano da cardiogenesis embora o seu potencial cardiogênico depende da sua assinatura epigenética 7. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitir investigar paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. No entanto, o genoma é transcrita em um tempo e modo específico de células do tipo 8. regulação epigenética da transcrição de genes tem que ser estudado dentro de regiões localizadas. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenética tornou-se um importante campo de pesquisa em biologia do desenvolvimento. Como um programa genético é activada em células embrionárias para permitir que as células a adquirir uma identidade específica dentro de uma linhagem embrionário tem sido por muito tempo uma questão essencial para biólogos do desenvolvimento.
Chip tem sido amplamente utilizada nos últimos anos e combinados para sequenciamento de DNA seguinte melhoria na resolução de sequenciamento. Isto tornou-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
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