Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.
Özgü gen transkripsiyonu embriyonik gelişim sırasında hücre kaderi kararı altında yatan önemli bir biyolojik süreçtir. Biyolojik işlem arttırıcılar ve kardiyak yapısal genlerin promoterleri de dahil olmak üzere genomik düzenleyici bölgeleri bağlanan transkripsiyon faktörleri tarafından aracılık edilir. DNA, kimyasal modifikasyonlar maruz histonlar sarılır. histon modifikasyonları daha böylece gen transkripsiyonu ince ayar düzenlemesi bir seviye getiren, aktif, bastırılmış ya da kendine hakim gen transkripsiyonu yol açar. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) kalp gelişiminin erken adımlar embriyoid organları (yani, hücre agrega) içinde veya 2D kültüründe özetlemek. Onlar kromatin immunoprecipitation (ChIP) için prensip yeterli malzemenin temin, teknik geniş gen düzenleyici bölgeleri tanımlamak için kullanılan. Ayrıca insan ES hücreleri cardiogenesis bir insan hücre modeli temsil etmektedir. gelişimin ileriki aşamalarında, fare embriyonik dokular için izinHücre kimliğinin belirlenmesi için gerekli olan özel epigenetik manzara soruşturma. Bu yazıda, PCR veya ES hücreleri, embriyoid organları ve kardiyak spesifik embriyonik bölgeleri kullanarak ChIP-dizileme ile takip ChIP, ardışık ChIP protokollerini tanımlar. Bu protokoller kardiyak gen transkripsiyonu epigenetik düzenleme soruşturma için izin verir.
Kalp ilk organ oluşturulacak ve embriyo fonksiyonel olmaktır. Kalp birinci ve ikinci embriyonik kalp alanları 1 kaynaklanan birçok hücre soyları inşa edilmiştir. sonrası fertilizasyon blastosist şekilli kalp kadar sahneleyecek itibaren, embriyonik hücreler birçok hücre kader kararlar dolayısıyla var. Gen transkripsiyonu zaman ve uzay-bağlı bir şekilde düzenlenir ve embriyonik gelişim esnasında hücre kaderi karar altında yatan temel biyolojik bir süreçtir. Bu tür bir işlem arttırıcılar ve kardiyak yapısal genlerin promoterleri de dahil olmak üzere genomu içindeki düzenleyici bölgeleri bağlanan spesifik transkripsiyon faktörleri tarafından aracılık edilir. DNA, asetilasyon, metilasyon, ubikuitinilasyon ve / veya fosforilasyon gibi modifikasyonlara maruz histonlar sarılır. Histon modifikasyonu histonun lizin tortusu 2 modifiye edildiği olarak aktif, baskılanmış ya da kendine hakim gen transkripsiyonu yol açar.
jove_content "> Kromatin immünopresipitasyon deneyi (ChIP) yıl önce 3 kurulmuştur ve en yaygın olarak kullanılan teknoloji modifiye histon ya da transkripsiyon faktörleri 4. histon veya transkripsiyon faktörlerinin immunoprecipitation takiben ya hedeflerini belirlemek için şu anda, ciltli DNA olabilir ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilir veya dizilenmiştir. ChIP teknik olarak daha zor jel retardasyon testleri 5 üstesinden gelmiştir. Bununla birlikte yonga DNA, jel retardasyon tahlilinde bir avantajı, bir transkripsiyon faktörü bağlanma doğrudan anlamına gelmez. Öte yandan, bir çip üzerinde DNA dizilimi kombine gen düzenlemesi üzerinde yeni bir genom perspektif açtı.ES hücreleri (ES hücreleri) embriyoid organları içinde özetlemek (yani., Hücre agrega) veya 2D kültürü kalp gelişimi 6 erken aşamaları ve ChIP için prensip yeterli malzemenin sağlamaktadır. Ayrıca insan ES hücreleri bir Ca insan hücre modeli temsil ederbunların kardiyojenik potansiyeli, ancak rdiogenesis kendi epigenetik imza 7 bağlıdır. gelişimin ileriki aşamalarında, fare embriyonik dokular, hücre kimliğinin belirlenmesi için gerekli olan özel epigenetik manzara soruşturma için izin verir. Bununla birlikte, genom, bir zaman ve hücre tipine özgü bir şekilde 8 transkripsiyonu. Gen transkripsiyonu epigenetik düzenlemesi lokalize bölgelerde çalışılması gerekmektedir. Bu yazıda, PCR veya sıralama ES hücreleri, embriyoid organları ve kardiyak spesifik embriyonik bölgeleri kullanarak takip ChIP, ardışık ChIP protokollerini tanımlar. Bu protokoller kardiyak gen transkripsiyonu epigenetik düzenleme soruşturma için izin verir.
Epigenetik gelişim biyolojisinde önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. genetik program embriyonik soyu içinde özel bir kimlik edinme hücreleri izin embriyonik hücreler aktive nasıl uzun süre gelişimsel biyologlar için bir kilit soru olmuştur.
ChIP genel olarak son yıllarda içinde kullanılan ve sıralama çözünürlükte iyileştirilmesi ile DNA sekanslaması için kombine edilmiştir. Bu geniş bağımlı şekilde bir genom hücreleri veya belirli embriyonik ve yeti…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |