Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe
Summary
Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.
Abstract
Spezifische Gen-Transkription ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Der biologische Prozess wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, die genomischen regulatorischen Regionen einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die zu chemischen Modifikationen unterzogen werden. Modifikationen von Histonen führen weiter zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen-Transkription, also eine andere Ebene der Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zu bringen. Embryonale Stammzellen (ES – Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh Zellaggregate) oder in der 2D – Kultur der frühen Schritte der Herzentwicklung. Sie bieten im Prinzip genügend Material für Chromatinimmunpräzipitation (CHIP), eine Technologie, im Großen und Ganzen verwendet Gen regulatorischen Regionen zu identifizieren. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine humane Zellmodell Kardiogenese. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonalen Mausgeweben fürUntersuchung spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, sequentielle ChIP gefolgt von PCR oder Chip-Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.
Introduction
Das Herz ist das erste Organ gebildet wird und in dem Embryo funktionalen zu werden. Das Herz wird aus vielen Zelllinien aufgebaut , die von den ersten und zweiten embryonalen Herzfelder 1 entstehen. Von der nach der Befruchtung Blastozyste zu dem geformten Herz bis zu inszenieren, haben embryonale Zellen so viele Zellschicksal Entscheidungen zu treffen. Gen-Transkription wird in einem zeit- und ortsabhängig geregelt und ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Ein derartiges Verfahren ist durch spezifische Transkriptionsfaktoren vermittelt, die innerhalb des Genoms einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen Regulationsregionen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die Modifikationen wie Acetylierung unterworfen sind, Methylierung, Ubiquitinierung und / oder Phosphorylierung. Histonmodifikation führt zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen – Transkription in Abhängigkeit von dem Lysin – Rest von Histon 2 modifiziert.
jove_content "> Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde Jahre angelegt 3 vor und ist derzeit das am weitesten verbreitete Technologie, um Ziele von entweder modifizierten Histone oder Transkriptionsfaktoren zu identifizieren , 4. Nach Immunpräzipitation von Histonen oder Transkriptionsfaktoren können gebundene DNA sein entweder amplifiziert durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder sequenziert. ChIP ist technisch herausfordernder Gelretardationsassays 5 überwinden. jedoch ChIP keine direkte bedeutet die Bindung eines Transkriptionsfaktors an DNA, ein Vorteil Gelretardation Assays. auf der anderen Seite, ChIP kombiniert, um die DNA-Sequenzierung hat eine neue genomweite Perspektive auf die Genregulation geöffnet.ES – Zellen (ES – Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh., Zellaggregate) oder in der 2D – Kultur die frühen Schritte der Herzentwicklung 6 und bieten im Prinzip genügend Material für ChIP. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine menschliche Zellmodell von cardiogenesis obwohl ihr kardiogenen Potential hängt von ihrer epigenetischen Signatur 7. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonale Mausgeweben für spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich zu untersuchen. Jedoch wird das Genom in einer zeit- und zelltypspezifisch 8 transkribiert. Epigenetische Regulation der Gen-Transkription hat in lokalisierten Regionen untersucht werden. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, gefolgt sequentielle ChIP durch PCR oder Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetik ist ein wichtiger Bereich der Forschung in der Entwicklungsbiologie geworden. Wie ein genetisches Programm in embryonalen Zellen aktiviert wird, um die Zellen zu erwerben eine bestimmte Identität innerhalb einer embryonalen Linie zu ermöglichen, hat eine Schlüsselfrage für Entwicklungsbiologen für lange Zeit gewesen.
ChIP wurde in den letzten Jahren und kombiniert, um die DNA-Sequenzierung folgende Verbesserung der Auflösung der Sequenzierung im Großen und Ganzen verwendet….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
Riferimenti
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