Summary
Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.
Abstract
yalıtım ve büyük gemilerden vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) kültürü iyi bilinmektedir birlikte, koroner dolaşımdan izole Kültür VSMC'Ier çalışmıştır. Sağlam aort kemerli Kalpler çıkarılır ve sindirim çözeltisi kolajenaz tip II, 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve 1 M CaCI2 300 birim / ml içeren retrograd Langendorff ile perfüze edildi. guruplarına kaplama ortamı içinde yeniden süspansiyon haline, santrifüjle topaklar haline 90 dakika boyunca 15 dakika aralıklarla toplanmış ve doku kültür tabaklarında kaplandı. VSMC'Ier SM22α varlığında α-SMA ve vimentin ile karakterize edilmiştir. Bu tekniği kullanarak ana avantajlarından biri, farelerin koroner dolaşımdan VSMC'lerde izole etmek yeteneğidir. Hücreler kullanılabilir uygulamalar için bazı sınırlar elde edilen hücrelerin küçük bir sayı, izole koroner VSMC köklü hücre kültürü teknikleri ve Assa çeşitli kullanılabilir, ancakys. genetiği değiştirilmiş farelerin VSMC'lerde araştıran çalışmalar yapı-fonksiyon ve vasküler patolojiler ile ilişkili sinyal süreçleri hakkında ayrıntılı bilgi verebilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı, hücre kültürü ve standart hücre kültürü deneylerinde kullanım için murin koroner dolaşım vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) izole etmektir. Biz Diyabette vasküler yeniden moleküler mekanizmaları değerlendirmek için bu tekniği geliştirdi. Biz daha önce diyabet 1 db / db fare modelinde septal koroner arteriyollerde hipertrofik yeniden içe bildirdi. Bağlı murin septum koroner bulunan doku miktarının sınırlı, db / db ve kontrol farelerinde protein değişiklikleri (örneğin, Western blot) araştıran standart deneysel teknikler, en iyi zordur. Buna ek olarak, daha önce anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB), losartan, db / db farelerinde 2 gözlenen yenileme azalttığını göstermiştir. Bu nedenle, koroner dolaşımdan başlıca VSMC'lerde izolasyonu bize daha fazla katk olabilir diyabetik farelerde VSMC fenotip değişiklikleri veya sinyal aktive yolları, araştırmak için izin verirolumsuz koroner arteriole yeniden için ting.
Çeşitli çalışmalar değil, her belirli vasküler yatakta daha kemirgen aorta, izole VSMC kullanarak kanonik sinyal yollarını aydınlatmıştır. Bununla birlikte, farklı olabilir, her vasküler yatakta VSMC'Ierin öne vasküler yatak koroner aort belirli yenileme ve db / db farelerinde 1 mezenterik sirkülasyonu göstermiştir. Nedenle, daha iyi bir VSMC'Ierin her set meydana gelen patolojik değişiklikleri anlamak için her vasküler yatakta VSMC'Ierin izole etmek için gereklidir. izole edilmesi ve aort VSMC'Ierin kültürlenmesi için farklı yöntemler bir bolluk vardır. Ancak şu anda, fare koroner dolaşım 3'ten VSMC'Ierin izolasyonu yayımlandı sadece bir çalışma var. Teng ve ark. Fare koroner dolaşım VSMC'lerde izole etmek için bir yöntem bildirmek için ilk oldu; Ancak, önemli ölçüde protokolü değiştirdik onlar da endotel cel izole olarakls. Diğer laboratuarları da Teng ve ark gelen protokolü kullandık. Koroner arter miyositleri ve havayolu düz kas hücreleri 4,5 izole etmek. Biz dahil olan değişiklikler yüksek koroner dolaşım VSMC'Ierin zenginleştirilmiş hücrelerin bir popülasyonu verecektir.
İzole memeli kalp veya Langendorff tekniği retrograd perfüzyon Oscar Langendorff'a tarafından 1897 6 yılında kurulmuş ve hala yaygın kardiyovasküler hücrelerin izolasyonu için kullanılmaktadır bugün. Modern fare genetik modifikasyon ilerlemesi ile birleştiğinde Burada sunulan teknik, koroner dolaşımdan VSMC'Ierin moleküler davranış yakın soruşturma için değerli bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Bu çalışma Sağlık Rehberinin National Institutes göre gerçekleştirilmiştir ve Nationwide Çocuk Hastanesi Kurum Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Hazırlık / ayarlayın
Not: Bu izolasyon tekniği bir halka standında yan yana yerleştirilmiş iki Langendorff ısıtma bobinleri gerektirir ve bir dolaşan su banyosu paralel bağlanmış.
- su banyosu dolaşım açın ve Langendorff kanülün ucunda 33-34 ° C'lik bir nihai sıcaklığa ulaşmak için sıcaklığı ayarlamak (bu, kullanılan su banyosu nedeniyle 6-7 ° C kaybı 40 ° C olarak ayarlanır ayarlamak boru boyunca sıcaklık). perfüzyon pompaları açmak ve 0.5 ml / dak perfüzyon hızını ayarlamak.
- otoklavlanmış ultra saf su ve 100 ml% 70 etanol, 50 ml, her yıkama su ceketli ısıtma bobinleri iki ekli boru ve 25 gauge kanül temizleyin.
- ısıtma bobinlerini temizleyinve bir şırınga ile hava basma fenol kırmızısı olmadan Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 10 ml ile yıkanır. ısıtma bobinleri ve tüp HBSS bırakın.
- boru kırmızı fenol olmadan oda sıcaklığında HBSS ile dolu bir steril 10 mi Luer-kilit şırınga takın. Bu olumsuz VSMC izolasyonu etkisi sindirim sırasında hava emboli neden olabileceğinden HBSS dolu bir şırınga takarken herhangi bir hava kabarcığı boru ve ısıtma bobinleri içinde sıkışıp emin olun.
- fenol kırmızısı olmadan buz HBSS ile dolu başka bir steril 10 ml şırınga ısıtma bobinleri ve yerden 25 gauge kanül çıkarın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde bu tutun. Diğer kanül için tekrarlayın.
- Enzim sindirimi çözeltisi hazırlayın.
- Dijestiyon çözeltisi, 75 ml 300 U / ml bir nihai konsantrasyon elde etmek için spesifik pek çok sayıda uygun kolajenaz tip 2 tartılır.
- fenol kırmızısı ile HBSS, 75 ml kolajenaz çözülür. Daha sonra, 0, 1.5 ml ilave.1 Mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve karışım, 1 M CaCI2 75 ul.
- Hemen sindirim çözeltisi kullanılarak halinde, 37 ° C'ye ısıtınız. Aksi takdirde, en fazla 6 saat süre ile 4 ° C'de yerleştirin. Bu çözelti, her gün taze yapılmalıdır.
- durak çözüm / kaplama ortamını hazırlayın.
- 100 mi, yüksek glikoz (4.5 g / L), DMEM 500 ml FBS, primocin L-glutamin, 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler 5 ml HEPES 5 mi, 1 ml ısı ile inaktive edilmiş ekleyin. Filtre sterilizasyonu önerilir.
- Kısım 4 ° C'de, A1-A6 sayılı on iki 15 ml konik tüpün her birine durdurma çözeltisi, B1-B6, ve yer 6 mi. Kısım 37 ° C inkübatör içinde 50 ml konik ve yerine durdurma çözeltisi 50 mi.
Not: Gerekirse bu adım ayrıca önceki izolasyon gün hazırlanabilirler. Bu durdurma çözeltisi hücre izolasyonu, aşağıdaki kaplama ortamı olarak kullanılır.
- 30 G iğne ile donatılmış iki adet 1 ml'lik şırınga hazırlayınheparin, 100 ul (1.000 birim / ml).
- 5-0 cerrahi ipek bir 5 cm parça kesin. Diğer iki kat daha uzun bir ucu ile cerrahi ipek gevşek bir yukarıdan aşağı düğüm. 25-gauge kanül üzerine yerleştirin, fakat sıkmayın. Diğer 25 G kanül için tekrarlayın.
- Steril, buzla soğutulmuş, HBSS olmayan fenol kırmızısı, 2 ml olan dört adet 35 mm steril Petri kapları (# 1-4) doldurun. buz üzerinde tutun.
2. Ötenazi, Kalp İzolasyon ve kanülasyonu
- Kalp izolasyondan önce, durdurma çözeltisi sindirim çözümü ve 50 ml konik sıcak olduğundan emin olun. bir halka standında bir büret kelepçe (ya da halka standı kelepçe) buz ve yerden ekli 25 G kanül ile HBSS dolu şırıngayı çıkartın.
- % 3 isofluorane kullanarak fareler anestezi. Fare, her arka bacak üzerinde bir ayak dokunuşuyla anestezi onaylayın. bacak seyirmesi, fare henüz çok 1 dakika bekleyin ve ayak dokunmatik tekrar anestezi değildir.
- kürk a çıkararak juguler ven Açığamakasla boyun anterior nd cilt. Sonra, dikkatle juguler ven çevreleyen herhangi bir yağ çıkarmak için forseps kullanabilir. yağ ayrılmasından sonra, yavaş yavaş, heparin, 100 ul (1.000 birim / ml) enjekte edilir. aşırı kanama önlemek için ven üzerinde bir cerrahi sünger yerleştirin.
- 1 dakika sonra, açık göğüs ilk brakiyosefalik şubesi aracılığıyla sağlam çıkan aorta tutmak için emin olun, kavisli bir forseps ile kalbi, asansör kalp maruz ve makas kullanarak tüketim için. Hemen fenol olmadan 35 mm çanak içine kırmızı buz HBSS ile (# 1) kalbi yerleştirin ve durulayın.
Not: Bir diseksiyon kapsamı kullanarak aşağıdaki 4 adımı uygulayın. - ucu çanak 2. sadece buz gibi soğuk HBSS yüzeyinin altında bulunan ve açıkça mikroskop aracılığıyla görülebilir, böylece halka üzerine monte edilmiştir 25 G kanül 45 ° açıyla durmak yerleştirin. çanak # 2 kalbini aktarın.
- Dumont forseps kullanarak, hafifçe p künt diseksiyon ile aşırı adipoz kaldırarak aorta maruzRevent delme veya aort yırtılması. Sonraki 25 G kanül üzerinde aorta slayt forseps kullanabilir.
- Bu nedenle retrograd perfüzyon vana bütünlüğünü tehlikeye olacak ve yakın değil, aort kapak ötesinde aort, aşağı doğru kanül Kılavuzu. kanül yerleştirildikten sonra, aorta üzerinde önceden bağlanmış ipek kaydırın ve sıkın. kalbi korumak için aort etrafında bir kare düğüm oluşturmak için ikinci bir düğüm.
- Aort güvenli bağlı sonra, yavaşça 25 G kanül takılı şırınga buz HBSS ile koroner dolaşıma kalan kan yıkayın. Aşırı koroner basıncı önlemek için çok fazla itmek değil özen gösterin. Sadece çok yavaş ve nazik floş floş tamamlamak için gereklidir. Kaçak serbest aort kanülasyon de bu nazik temizleme sırasında görülebilir.
- HBSS akışını başlatmak için perfüzyon pompası açın. dikkat ederek, HBSS dolu şırınga (ekli kalp ile) 25 G kanül kaldırHBSS ile dolu kanül göbeğini tutmak ve sıcak HBSS dolu ısıtma bobinleri bağlayın. 8 dakika boyunca 0.5 ml / dk'lık bir oranda perfüzyon pompası ile kalbin perfüzyon başlayın.
- ilk kalp kanüle ve sistem üzerinde perfüze olan sonra tekrar ikinci kalp için 2,1-2,8 adımları. Bu izolasyonların nedenle dikkatli planlama ve zamanlama gereklidir her kalp için sendeleyerek edilecektir.
3. Sindirim
- HBSS ile yıkama işleminden sonra, önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi, 10 ml ile doldurulmuş bir pompa şu anda 10 mi HBSS şırınga değiştirin. 0.5 ml / dak hızında 12 dakika boyunca sindirim çözeltisi, her bir kalp serpmek. Bu herhangi bir kalıntı kan ve endotel hücrelerini içerecek bu ilk sindirim kaynaklanan fraksiyonları toplamak etmeyin.
- 12 dakika sonra, 0.4 ml / dk perfüzyon oranını değiştirmek, soğuk durdurma solut dolu (her sindirim için birinci ya da ikinci kalp karşılık gelen boru A1 ve B1), 15 ml'lik bir konik yerVSMC zenginleştirilmiş perfüzat toplamaya başlamak için kalbin altında bir buz kovası içine iyon.
- 15 dakika sonra, şimdi her iki fraksiyonların toplanmasından sonra, 10 dakika boyunca 89 xg boru A2 ya da B2 ve döner konik tüp A1 ve B1 toplama konik olarak değiştirin. Pompa üzerinde sindirim çözeltisi ile doldurulmuş şırınga çözeltisinin en az 1 ml olduğunda, sindirim çözeltisi taze doldurulmuş 10 ml şırınga ile değiştirin.
- Santrifüj işleminden sonra, her toplama tüpünden aspire süpernatant, yaklaşık 0,5 ml bırakarak. Sıcak durdurma çözeltisi (ya da kaplama ortam) 2 mL A1 süspanse pelet. gevşek kapaklı 37 ° C inkübatör B1 tüp ve yer tüp A1 tüpten tabanda ekleyin.
- Tekrarlayın 90 dakika olmak üzere toplam tahsilat süre kullanılır (A6 ve B6 yoluyla) tüm tüplere kadar 3.3 ve 3.4 adımları tekrarlayın. sindirim 80 dakikada, tüp A6 ve B6, respe bu hücreleri ventrikül içinde sıkışıp olabilecek hücreleri temizlemek ve toplamak için kalp tepe kesip açmakctively.
Not: Bazen kalp 90 dakika zaman noktası öncesinde kanül kapalı düşecek. Böyle bir durumda, sindirim çözeltisinin 2 ml'si ile doldurulur, steril bir 35 mm Petri kabı içine kalp ve yer almak. Kalbin tepe kesin ve hafifçe sindirim çözeltisi ile kalbi durulayın. Daha sonra, 50 ml'lik bir konik steril bir 100 um hücre süzgecinden sindirim çözeltisi 2 ml filtre ve tüp A6 ya B6 ekle. - sonraki tüpleri (A2 ve B2) her dönüşte sonra, (A1 ve B1 kombine) Önceki toplama tüpüne yeniden süspanse VSMC'lerde ekleyin. Ayrıca, pompa sindirim çözüm tükendi ve sindirim boyunca gerekli 10 ml şırınga geçiş izin özen gösterin.
- Hortum birleştirildikten sonra, 10 dakika boyunca 89 xg VSMC zengin süspansiyon santrifüj.
- mümkün olduğunca toplama tüpleri aspire kadar süpernatant. bir 35 mm kültür çanak medya ve plaka kaplama 2 ml kalan pelletini. Yeri kültür çanak i24 saat boyunca 37 ° C inkübatör n.
4. Hücre Kültürü
Not: biyogüvenlik kabini kalan adımları tamamlayın.
- 24 saat sonra, yavaşça kaplama medya aspire. Kültür normalde enkaz büyük miktarda olacaktır. Hücreleri yıkamak için sıcak, steril PBS 2 ml ekleyin ve bir saat yönünde hareket dönerken hafifçe iki parmakla karşı çanak dokunun.
- 360 ° döndürdükten sonra, PBS aspire ve ikinci kez tekrarlayın. PBS aspire ve steril, ılık PBS başka bir 2 ml ekleyin. plaka üzerinde hiçbir enkaz az olduğundan emin olmak için mikroskop altında kültür çanak kontrol edin. Hücre izdiham bu anda belirlenebilir.
- enkaz kültür kaplarına kalırsa, adımı 4.2 tekrarlayın. kültür çanak enkaz açık ise, PBS aspire ve sıcak kaplama medya 2 ml ekleyin.
- 24 saat sonra, kültür nihai kalıntıları veya ölü hücrelerin çıkarılması için sıcak, steril PBS ile tekrar yıkama hücreleri. PBS ve p aspirehücreler üzerinde sıcak kaplama medya başka bir 2 ml dantel.
- Her gün hücreleri üzerinde kontrol edin ve taze ısınmış kaplama medya ile her 48 saat beslenirler. Bu noktada, hücreler standart hücre kültür deneyleri için de kullanılabilir. prosedür mükemmel kadar 7 gün sürebilir, ancak VSMC, kaplama sonrası yaklaşık% 80 birleşen 4-5 gün olmalıdır. sonraki pasajlar yarma, 1 maksimum kullanıyorsanız: 4 35 mm yemekleri (ya da kültür kaplarına karşılaştırılabilir bir alana).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedeniyle bizim koroner VSMC izolasyon tekniğinin yeni bir yönüne, hücre izolasyonu saflığını belirlemek için çalıştı. Fare koroner VSMC'Ier ilk yıkamadan sonra kültürdeki hücrelerin morfolojisi dayanarak geçit 2. kendi morfolojisi ve immünofloresan boyama kadar dayanan tespit edildi, izolasyon prosedürü etkili bir kalp miyositleri ve endotel hücrelerini ortadan kaldırır. VSMC'Ier geçit 2 (Şekil 1) kadar onların morfoloji korur. Ancak, adventisyal ve interstisyel fibroblastlar tarafından kirlenme olasılığı vardır. Bu potansiyel şaşırtmak ekarte etmek için, biz SM22α için izole hücreler boyanmış, α-düz kas aktini (α-SMA), VSMC hem pasajlar 1-2 (Şekil 2), 7,8, ve vimentin, bir fibroblast işaretleyici 9 işaretleme kalemler. Bizim hücre izolasyon CD31 yoksun olduğunu Biz de göstermektedir geçit 2. aracılığıyla bu belirteçlerin hiçbir değişiklik gözlenen / PECAM boyama (insan coronBu izolasyon protokolü kullanılarak endotel hücre kirlenme eksikliği gösteren bir pozitif kontrol olarak kullanılan li mikrovasküler endotel hücreleri). Toplu olarak, bizim hücre izolasyon prosedürü, koroner dolaşım VSMC'Ierin bir hemen hemen saf popülasyonu verir ve şu anda daha fazla deney için kullanılabilir.
Şekil 1:. Parlak saha faz kontrast koşullarında 10X büyütmede görüntülü heterozigot db / db farelerde izole Örnek kültürlenmiş koroner VSMC Yetiştirme koroner VSMC (geçit 2). Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Immunoflheterozigoz koroner VSMC'Ierin Kaplama kültürlenmiş koroner VSMC'Ierin uorescence boyama. (db / db) SM22α, α-SMA, vimentin antikorlar ile etiketlenir geçitlerin 1-2 de fare ve CD31 / PECAM. Görüntüler 10X büyütmede çekilen. Önemli bir değişiklik geçişi gözlenmiştir. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın amacı, fare kalplerinden pürüzsüz koroner damar verimini artırmak için mevcut hücre izolasyonu protokolleri adapte oldu. Vasküler düz kas biyoloji öncü çalışmaların çoğu kültürlenmiş sıçan aortik düz kas hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar VSMC büyüme, göç ve hipertrofisi 7 kontrol moleküler mekanizmaları temel bilgi sağladı. Alan ilerledikçe Ancak, VSMC fenotip ve işlevini vasküler yatakta özel bir dizi faktöre göre kontrol edilmiştir ortaya çıkmıştır. Örneğin, çevresel damarlarda göre, koroner arterler, farklı fonksiyonel tepkileri gösterir yaralanma cevaplarda artış belirgin belirtileri sergileyen ve kanal, reseptörler ve sinyal molekülleri 10,11 benzersiz bir dizi gösterir. gemi sözleşme miyokardiyumun sistol sırasında sıkıştırılmış çünkü koroner yatak da, eşsiz bir hemodinamik kuvvetlere maruz kalmaktadır. Bizim son çalışma bu Coron göstermektedirtip 2 diyabetli db / db farelerde li mikrovasküler remodeling aort ve mezenterik direnç damarlarının 1,12 farklıydı. Düşük geçiş VSMC'Ier gerekli kullanarak in vitro çalışmalar, bu farklılıkların hesaba moleküler mekanizmaları anlamak için. Izole ve fare aort veya mezenterik arter VSMC'lerde kültüre farklı ve köklü çeşitli yöntemler olmasına rağmen, şu anda, fare koroner dolaşım 3'ten VSMC'Ierin izolasyonu yayımlandı sadece bir çalışma var.
Bu protokol, koroner dolaşım primer fare VSMC'Ierin izolasyonu için geliştirilmiş bir yöntem ortaya koymaktadır. Bizim protokol gevşek Teng ve arkadaşları tarafından yayımlanan tek dayanmaktadır. 3. orijinal tekniğe başvuran modifikasyonlar zenginleştirilmiş nüfus ve VSMC'lerde yüksek verim sağlar. Bu sonuçlara ulaşmak için gerekli olan kritik adımlar kanül doğru yerleştirilmesini içeren, nazik floşKalbin ing aşırı kan kaldırmak ve sindirim sonunda kalbin apeks kesme. üç, kanül yerleştirme büyük önem taşımaktadır. Koroner dolaşım aort kapak hemen distal koroner çıkımının gelen perfüze. Bu nedenle, sol ventrikül içine kanül yerleştirilmesi ile supap bütünlüğünün bozulması zayıf koroner perfüzyonu ve uygulanabilir VSMC'Ierin sayısı belirgin bir azalmaya neden olacaktır. Koroner dolaşımın nazik yıkama kültürü için kullanılan son pelet aşırı kan kaldıracak değil sadece, aynı zamanda kanül doğru yerleştirme elde edilir belirleyecektir. Son olarak, sindirim sırasında, bazı VSMC böylece hücreleri serbest ve kaplama bir daha izdiham verecektir sindirim sonuca apeks kesme, ventriküllerin içinde sıkışıp hale gelebilir.
kullanılabilir önemli bir değişiklik 25 G sonda iğne veya Harvard Aparatı fare aort cannul kullanımıİğne kanülü yerine bir. sonda iğne kullanılarak Bununla birlikte, bir iğnenin ucunda top ile koroner ostiumları engellemek için ekstra bakım değil almalıdır. İğnenin ayarı önce perfüzyon gerekiyorsa nazik yıkama adımı ortaya çıkaracaktır. Buna ek olarak, sindirim çözeltisi içinde kullanılan kolajenaz türü uygun VSMC izolasyonu için önemlidir. Tip II kollajenaz saf değil - böyle tripsin, klostripain ve caseinase gibi diğer enzimler içerir. Bu nedenle, soya fasulyesi tripsin miktarı sindirim kullanılan kolajenaz spesifik çok göre ayarlanması gerekebilir sindirim çözeltisine ilave inhibitördür.
tekniğin bir sınırlama, tüm koroner dolaşım VSMC izole olmasıdır. Koroner mikrodamarlar odaklanmış Daha önceki çalışmalarda (çapı 80-120 mikron) 1,2, ancak farelerde ana koroner arterler daha büyük (> 160 mikron) 13 vardır. Buna ek olarak, bu tekniknique ayrıca koroner venöz dolaşımı değil, sadece arteriyel dolaşımın hücreleri izole eder.
Langendorff tekniği, 100 yılı aşkın bir süredir kullanılmış olsa da, fare genomu manipülasyon daha yeni gelişmeler (örneğin knock-in, knock-out, mutasyonlar) geniş bir uygulama çeşitli güncellenmiş teknik yararlanmak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. izolasyonu ve kültürü sonra, hücreler, farmakolojik maddeler ile viral enfeksiyon ve tedavisi dahil olmak üzere, ek deneyler için kullanılabilir. Genetik olarak tadil edilmiş fareler ve standart hücre kültür ortak kullanımı faregiller koroner dolaşım VSMC'Ierin derin bir inceleme için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu eser (PAL ve K99HL116769 AJT için R01HL056046) Sağlık Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve Nationwide Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü (PAL ve AJT kadar) oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
