Summary
Bu protokol, biz optimize C2C12 hücre bakım, gen transfeksiyon / transdüksiyon ve miyosit farklılaşma dahil miyotonik distrofi 1 myoblast modelleri, kurulması prosedürleri sunuyoruz.
Abstract
Miyotonik distrofi 1 (DM1) müsküler distrofi yaygın bir şeklidir. çeşitli hayvan modelleri DM1 için kurulmuş olmasına rağmen onlar hücresel ve moleküler olayları incelemek için etkili bir hücresel alternatif sunmak, çünkü myoblast hücre modelleri hala önemlidir. C2C12 miyoblast hücreleri yaygın gene ya da viral transdüksiyon ile Miyogenesis direnç incelemek için kullanılmıştır olmasına rağmen, C2C12 hücre araştırma engellemektedir. Burada, C2C12 iskelet hücreleri ve miyosit farklılaşmanın başlaması içine genleri tanıtmak için günlük bakım, transfeksiyon ve transdüksiyon prosedürleri içerir optimize edilmiş bir protokol açıklar. Toplu olarak, bu işlemler iyi transfeksiyon / transdüksiyon verimliliği, hem de uyumlu farklılaşma sonuçlarını verir. miyotonik distrofi çalışma, hem de diğer kas hastalıkları yararlanacak DM1 miyoblast hücre modellerinin oluşturulması açıklanan protokol.
Introduction
Miyotonik distrofi (DM) birden fazla sistemi, en önemlisi kalp ve iskelet kasları 1 etkileyen otozomal dominant bir hastalıktır. Bu hastalıkta, DM1 ve DM2 iki alt tipi vardır. DM1 daha sık görülür ve DM2 2 daha ciddi bir tezahürü vardır. DM1 yatan genetik mutasyon 3 'çevrilmemiş bölge DM protein kinaz geni (DMPK) 3 (UTR) bulunan KKG üçüz tekrarlarının bir açılımıdır. Etkilenmemiş kişilerde KKG tekrar sayısı aksine 37'ye 5 ila, daha fazla 50 artar ve bazen DM1 hastalarının 4'te binlerce değişir. Bunun bir sonucu olarak, bu gibi RNA bağlayıcı proteinler,-kas benzeri 1 (MBNL1) CUGBP ve Elav benzeri Aile 1 (Celf1), düzeni bozulmuş bulunmaktadır. Nedeniyle genişletilmiş KKG tekrarlarda haciz, MBNL1 alternatif yapıştırma 5 düzenleyen yeteneğini kaybeder. Celf1, diğer taraftan, 6,7 yukarı düzenlenir. Celf1 aşırı ekspresyonu kas kaybı ile ilişkilidirMBNL1 fonksiyon kaybına atfedilen değildir ve halsizlik. DMPK 3'-UTR KKG genişleme, MBNL1 kaybı ve Celf1 aşırı ifadesi de dahil olmak üzere DM1 ile ilgili değişiklikleri, simüle Hayvan modelleri, kurulmuştur. Ancak, miyoblastların içinde DM1 modelleme özellikle DM1 ile ilgili hücresel ve moleküler olayları diseksiyon için, etkili bir alternatif sunuyor.
C2C12 myoblast hücre hattı ilk yaralı C3H fare kas izole ve yaygın Miyojenik farklılaşma 8,9 incelemek için kullanılmıştır. C2C12 hücreleri hızla cenin sığır serumu (FBS) ortam ihtiva-eden prolifere ve kolayca FBS boşaldığında farklılaşma tabi tutulur. Oysa, bu myoblast farklılaşma modeli kullanılarak iki zorluğu beraberinde getirir: C2C12 hücreleri sıklıkla gen transfeksiyonu / viral transdüksiyon dirençlidir; ve hücre işleme ve farklılaşma prosedüründe küçük farklılıklar mihotüp oluşumunda belirgin değişikliklere yol açabilir.
Bizim laboratuvar rutin ac olarak C2C12 miyoblastları kullanırell modeli ve etkili bir C2C12 hücre hattına 10 plazmid transfeksiyon, retroviral kalıt ve lentiviral transdüksiyonu ile genleri teslim protokolleri geliştirilmiştir. videoda, / transfekte C2C12 hücrelerini transduse ve DM1 myoblast modelleri kurulmasında farklılaşma tutarlılığını sağlamak için optimize prosedürleri göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C2C12 Hücre Kültürü
- büyüme ortamında 100 mm plaka C2C12 fare miyoblastlar muhafaza (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM)),% 20 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 2 mM L-glutamin. % 60 konfluent - C2C12 pasajlı hücreler yaklaşık 50 olmak izin verin.
- büyüme ortamı atılır ve 3 mi oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) ile C2C12 hücreleri yıkayın. PBS çıkarın ve hücreleri ayırmak için 500 ul% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. 5 dakika - 3 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka koyun.
- 3 ml büyüme ortamı ekleyerek tripsin nötralize. Hücreleri askıya 8 kez - 6 Pipet. Yeni bir 100 mm'lik plaka süspansiyon hücre 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir.
2. C2C12 HÜCRE NAKLİ / transdüksiyon ve Seçimi
- C2C12 plazmid transfeksiyon
- 24 saat önce transfeksiyon, sHer transfeksiyon için altı oyuklu plakanın bir kuyuya sonunda 7.0 X 10 5 C2C12 hücreleri.
Not: Bu 50 yol açar - transfeksiyon zaman% 60 izdiham. - transfeksiyon reaktifi, kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar çıkmasına izin verin.
- Kısaca önceden ısıtılmış serum barındırmayan ortam ve vorteks 200 ul plazmit DNA (GFP CUG5 veya GFP-CUG200) 2 ug ekleyin. orta 6 ul transfeksiyon reaktif ekleyin ve bir girdap kullanarak 30 saniye boyunca hemen karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı.
- 2.5 ml serum serbest büyüme ortamına C2C12 hücrelerinin ortamı değiştirmek. inkübasyondan sonra hücrelere transfeksiyon karışımı ekleyin. % 5 CO 2, 37 ° C inkübatör plakaları dönün.
- 4 saat veya gece kadar transfeksiyon karışımı / serum serbest büyüme ortamı hücreleri tutun. Ertesi gün geri büyüme ortamına ortamı değiştirmek veya sitotoksisite belirgin olduğunda.
Not: Sitotoksisite ce mikroskobik muayene ile değerlendirilirrf. hücre morfolojisi ve hücre dekolmanı değişiklikleri gözlemleyin. Sürece hiçbir açık sitotoksisite olduğu gibi, serumsuz büyüme ortamı içinde bir gece boyunca inkübasyon transfeksiyon artırır. - (Plazmidler olmadan transfekte) kontrol kültürü canlı hücreler yok dek 10 gün ~ 1.6 mg / ml G418 - 1.2 ekleyerek hücreleri transfeksiyondan sonra 48 saat seçin. G418 ile desteklenmiş büyüme medya ile her iki günde bir ortamı değiştirmek.
- Daha sonraki deneyler için, 37 ° C'de büyüme ortamı ve% 5 CO2 içinde G418 dirençli hücrelerin bakımı.
- 24 saat önce transfeksiyon, sHer transfeksiyon için altı oyuklu plakanın bir kuyuya sonunda 7.0 X 10 5 C2C12 hücreleri.
- Retrovirüs hazırlanması ve C2C12 Retroviral transdüksiyon,
- % 10 cenin sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 2 mM L-glutamin ile DMEM yüksek glukoz ilave tarafından HEK 293 kültür ortamı hazırlayın.
- Yaklaşık 24 saatlik bir transfeksiyon önce, 100 mm levha (transfeksiyon% 80 izdiham) 4.0 x 10 6 ekotropik HEK 293 tabanlı paket hücreleri plaka Cıiçeren gruptur hücre kültürü ortamı.
- transfeksiyon reaktifi, kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar çıkmasına izin verin.
- 1 mi serumsuz büyüme ortamı içinde 15 ug DNA (pMSCV-Puro ya pMSCV-Celf1Flag-puro) karıştırın. Vortex kısa. DNA / serum serbest büyüme ortamı tüpüne adım 2.2.2 30 ul transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks kullanılarak iyice karıştırın. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
- ekotropik HEK 293 bazlı ambalaj hücrelere transfeksiyon karışımı damla damla ekleyin. Yavaşça girdap plakalar ve% 5 CO 2, 37 ° C inkübatör onları geri dönün. 24 saat sonra, 10 ml önceden ısıtılmış taze büyüme ortamına bir ortam.
- süpernatan içeren (retrovirüs), bir pipet kullanılarak transfeksiyondan sonra 48 saat hasat ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. plaka yeni sıcak ortam 10 ml ekleyin ve inkübatör geri. 4 ° C'de süpernatan tutun.
Not: Medya t yavaşça ilave ediliro kuyunun yan hücre tek tabaka bozmak şekilde değil. - transfeksiyondan sonra süpernatant 60 saat ikinci parti hasat ve 2.2.5 süpernatant ile havuz. 500 xg, 7 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj selüler artığın ayrılması için.
- Yeni bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. 2.2.9 ya da kısım adım ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de süpernatan depolamak için işlem, bu noktada C2C12 hücreleri nakletmek için retrovirüs kullanın.
- dondurulmuş bir stok Burada kullanıldığında, oda sıcaklığında 2.2.7 retrovirüs çözülme.
Not: Birden fazla donma-çözülme döngüleri kaçının. - izdiham% 40 - 30 amaçlayan iletimi aynı gün C2C12 hücreleri Plate.
- büyüme ortamı atın ve 3 ml oda sıcaklığında PBS ile C2C12 hücreleri yıkayın. PBS kaldır 500 ul% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 3 için 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe levhasını - 5 dak.
- 3 ml büyüme med ekleyerek tripsin nötralizeyum. Hücreleri askıya 8 kez - 6 Pipet. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 60 mm plakaya 8.0 x 10 5 C2C12 hücreleri ekleyin.
- 3 mi büyüme ortamı içinde hücrelerin bir 60 mm plaka enfekte etmek için 0.5 ml retrovirüs ekleyin. inkübatör plaka dönün.
- enfeksiyondan sonra 48 saat - seçme antibiyotik (3 ug / ml puromisin 1) ile desteklenmiş 3 mi taze ortam ile değiştirin. untransduced C2C12 kontrol kültürü dışarı ölene kadar 5 ~ gün için her gün antibiyotik ile 3 ml orta yerine.
- % 10 cenin sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 2 mM L-glutamin ile DMEM yüksek glukoz ilave tarafından HEK 293 kültür ortamı hazırlayın.
- Lentivirüs hazırlanması ve C2C12 lentiviral transdüksiyon
Not: Biyogüvenlik Seviye 2 kabine tüm lentivirüs ilgili prosedürleri uygulayın ve biyolojik güvenlik kurallarına uyun. virüs içeren sıvı atık bertaraf öncesinde dezenfekte edilmelidir.- % 10 fetal ile takviye edilmiş HEK 293 hücre kültürü ortamı (DMEM yüksek glukoz ile 100 mm plaka (~ transfeksiyon günde% 80 izdiham) 'de Plaka 4.0 x 10 6 293T hücreleri,sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 2 mM L-glutamin) transfeksiyondan önce 24 saat.
- Oda sıcaklığına kadar transfeksiyon reaktifi ısıtın. 8 ug lentiviral transfer vektörü ile birlikte lentiviral ambalaj vektörler (4 ug pMD2.G 6 ug psPAX2) karışımı (Celf1 shRNA veya kontrol shRNA karıştırılmış) 1 mi serumsuz hücre kültürü ortamı içinde. Vortex kısa.
- DNA / DMEM tüpüne 36 ul önceden ısıtılmış transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks ile iyice karıştırın. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
- inkübatör 293T hücreleri çıkarmak ve plaka transfeksiyon karışımı ekleyin. Yavaşça plaka girdap ve geri% 5 CO 2, 37 ° C inkübatör iade. 24 saat sonra, 10 mi taze kültür ortamı ile transfeksiyon karışımı değiştirin.
- transfeksiyondan sonra süpernatan ihtiva eden lentivirüs 48 saat toplamak ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine aktarın. plaka 10 ml yeni sıcak ortam ekleyin ve geriinkübatör için. 4 ° C'de süpernatan saklayın.
- transfeksiyondan sonra süpernatant 60 saat ikinci parti toplayın ve 2.3.5 süpernatant ile birleştirmek. 500 xg, 7 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje kısa.
- yeni bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. Taze virüs kullanıyorsanız, 2.3.9 adıma geçin. daha sonra kullanmak için, mağaza 10 ml'lik alikolar içinde -20 ° C'de süpernatan virüs içeren.
- dondurulmuş bir stok kullanılırsa, kullanılmadan önce oda sıcaklığında 2.3.7 virüs çözülme.
Not: Birden fazla donma-çözülme döngüleri kaçının. - transdüksiyon aynı gün 2.2.9 tarif edildiği gibi (Bölüm 2.1'de elde edilen) Levha C2C12-CUG200 hücreleri.
Not: 30 Amaç - izdiham% 40. - C2C12-CUG200 bir 60 mm plaka enfekte ve inkübatör plaka dönüş 0.5 mi virüs ekleyin.
- transdüksiyon sonra 72 saat - seçim antibiyotik (3 ug / ml puromisin 1) ile desteklenmiş taze medya ile kültür ortamı değiştirin.tüm untransduced C2C12-CUG200 kontrol kültürü dışarı ölene kadar 5 ~ gün için seçim antibiyotik ile kültür ortamı her gün yenileyin.
- GFP-CUG200 transfekte hücrelerde Celf1 demonte doğrulamak için Western blot kullanın.
3. C2C12 Hücre Farklılaşması
- Levha farklılaşma başlamadan önce 2.5 ml büyüme ortamı, 24 saat içinde 6 oyuklu plakanın bir oyuk 2 x 10 6 hücre.
Not: Tüm izdiham 24 saat içinde ulaşılır, böylece kaplama yoğunluğu ayarlanabilir.- PBS ile konfluent hücreler durulanır ve düşük serum farklılaştırma ortamının 2.5 mL (Dulbecco Eagle ortamı,% 2 at serumu ile desteklenmiş, modifiye 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve 1 uM insülin) ekleyin . iki günde orta yerine.
Not: Dondurulmuş stok insülin tutun ve her orta değişiminde medyaya ekleyin.
- PBS ile konfluent hücreler durulanır ve düşük serum farklılaştırma ortamının 2.5 mL (Dulbecco Eagle ortamı,% 2 at serumu ile desteklenmiş, modifiye 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve 1 uM insülin) ekleyin . iki günde orta yerine.
- C2C12 farklılaşması sırasında, Quan için numune toplamaktitative aşağıdaki zaman noktalarında RT-PCR (bakınız bölüm 4): 0 Gün, 1, 2, 4, ve 6. günde immün kültür 6. Süreci - 8 (bölüm 5).
4. RNA İzolasyonu ve Nicel RT-PCR
- RNA izolasyonu için imalatçının protokolü kullanarak. İzolasyondan sonra, 30 mL RNaz içermeyen su içinde RNA pelletini aşağı birkaç kez pipetleyin vb.
Not: Örnekler Nicel RT-PCR için devam edebilir ya da -80 ° C'de muhafaza edilebilir. - Kantitatif RT-PCR 10 için RT qPCR kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin. Tablo 1 'e göre, reaksiyon karışımı hazırlayın.
| Bileşen | Hacim (ul) | nihai konsantrasyon |
| 2x reaksiyon tamponu | 10 | 1x |
| İleri primer | 0.5 | 200 nM |
| Ters astar | 0.5 | 200 nM |
| sonda | 0.5 | 200 nM |
| Transkriptaz ve RNaz inhibitörü Ters | 0.1 | 0.25 U / ml |
| şablon | 1 | 100 ng toplam RNA, |
| RNaz ücretsiz su | 7.4 | NA |
| Toplam Mix | 20 |
TABLO 1. nicel RT-PCR Master Mix hazırlanması
- Termal profili Tablo 2 kullanılarak 20 ul RT-qPCR reaksiyonu çalıştırın.
| Ters transkripsiyon adımı | 30 dakika, 48 ° C |
| DNA polimeriase aktivasyon / Reverse Transcriptase inaktivasyonu | 10 dakika, 95 ° C |
| 40 devir | 15 sn, 95 ° C |
| 1 dakika, 60 ° C |
Tablo 2. nicel RT-PCR termal profili
5. immün
- 2,5 tek tabakalı kültürü saptamak taze, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid / PBS hazırlanabilir ml.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2.5 ml% 0.1 Triton X-100 / PBS içinde örnekleri geçirgenliği.
- nemlendirilmiş bir odasında örnekleri aktarın. 37 ° C'de 30 dakika süre ile tampon (% 0.1 noniyonik yüzey aktif cismi / PBS,% 10 normal keçi serumu) 2.5 ml örnekleri bloke eder.
- bloke tamponu atılır ve tampon (1: 100) engelleme seyreltilmiş miyozin ağır zincir karşı 800 ul primer antikor uygulayın. Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada gece boyunca inkübe edin.
- plaka 3 tim yıkayınes 2.5 ml yıkama tamponu günde 2 (% 0.1 polisorbat 20 / PBS) ile (10 dk).
- Yıkama tamponunu çıkarın ve 800 ul ikincil antikor (keçi anti-fare IgG, PBS içerisinde 1: seyreltildi 500) uygulanır. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, bir nemlendirilmiş oda içinde inkübe edin.
- 2.5 ml yıkama tamponu ile iki kez (10 dk) yıkayın.
- 5 dakika boyunca (damıtılmış iyonu giderilmiş H2 O içerisinde seyreltilmiş 1 ug / ml), 800 ul DAPI ile inkübe edin.
- 10 dakika süre ile tekrar 2.5 ml yıkama tamponu ile yıkayın.
- 2.5 ml PBS ile yıkama tamponu değiştirmek ve görüntüler yakalamak için bir floresan mikroskop kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C2C12 hücreleri GFP CUG5 veya GFP-CUG200 ile transfekte edilmiştir. Ilaç direnci seçimi yapıldıktan sonra, sabit havuzları GFP (Şekil 1A) ile görünür edilebilir, kurulmuştur. Farklılaşmış miyoblastların içinde mihotüp formasyonu 10 (Şekil 1B) immün ağır zinciri miyozin tarafından tespit edildi. Mihotüp oluşumu ölçümü füzyon endeksleri 2.6 ± 1.1% 35,4 ± 4,1 den% azalmış ve mihotüp alanları GFP-CUG200 (Şekil 1C) anormal KKG genişlemesi ile 2.7 ±% 0.8 35.6 ± 2.2% geriledi olduğunu göstermiştir. füzyon indeksi ve mihotüp alan çekirdekleri toplam sayısı ve sırasıyla miyotüplerinden kapsadığı toplam görüntü alanının yüzdesi bölü miyotüplerinden (≥ 2 çekirdekleri) de çekirdeklerin sayısı ile sayıldı. Gerçek zamanlı RT-PCR, 10 farklı kas bir dizi ekspresyonunu analiz etmek için yapılmıştırMyoD, MyoG, Mef2c ve Celf1 içeren iation benzer genler. CUG5 kültürler ile karşılaştırıldığında, CUG200 farklılaşma başında miyoblastlar çoğalan Celf1 mRNA ekspresyonunu artırmıştır. Daha önceki raporlarda ile uyumlu, Celf1 upregülasyonun myojenik distrofi 1 (Şekil 1D) içinde KKG-genişleme ile ilişkili bulunmuştur. Bundan başka, Western lekeleme 10 sürekli olarak gösterdi Celf1 protein (Şekil 1 E) yükseltilmiş ve CUG200 farklılaşma (Şekil 1D) içinde MyoD, MyoG ve Mef2c ekspresyonunu inhibe edilmiştir. Bu sonuçlar KKG-genleşme hatalarının ve bozulmuş myoblast farklılaşmasını mihotüp yol açtığını göstermektedir.
Miyoblast farklılaşma Celf1 rolünü incelemek için, pMSCV- Celf1Flag için retroviral vektör C2C12 hücreleri nakletmek için yapılmıştır. 10, puromisin-dirençli klonlar farklılaşma çalışmaları için havuzlandı. Western Blot sonuçları göstermiştir ki Bayrağı-tagged Celf1 pMSCV-Celf1Flag kalıt kültürlerinde, yalnızca mevcut olduğunu ve Celf1 proteininin ekspresyonu (Şekil 2A) yukarı regüle edilmiştir. Celf1 fazla sentezlenmesi ciddi miyoblast farklılaşma bozduğunu göstermektedir kontrol kültürlerine (Şekil 2B), ile karşılaştırıldığında hücrelerin Celf1-aşırı ifade içinde miyotüplerinin oluşumu nadirdir.
Celf1 demonte KKG-genleşme hücrelerinde farklılaşma eksikliği kurtarır olmadığını belirlemek için, Celf1 shRNA lentiviral vektörleri tarafından GFP-CUG200 hücrelerine teslim edildi. Çift dirençli klonlar (G418 ve puromisin) seçilir ve farklılaşma çalışmaları için havuzlandı. Endojen Celf1 protein düzeyi belirgin Celf1 shRNA (Şekil 3A) varlığında indirgendi. Farklılaşma 6 gün sonra, miyotüp oluşumunu artırma Celf1 shRNA etkisi (Şekil 3B) belirgindi. Füzyon endeksleri ve mihotüp vardırolarak 4.6 ± 0.8% ve kontrol kültürleri (Şekil 3C) 5.1 ± 1.3% ile karşılaştırıldığında, sırasıyla 16.1 ± 3.0 ve% 15.2 ±% 1.2 idi. Diğer taraftan, gerçek zamanlı RT-PCR sonuçları MyoD, MyoG ve Mef2c ekspresyonu anlamlı Celf1 demonte kurtarıldı miyosit farklılaşma eksikliği destek Celf1 shRNA hücreleri (Şekil 3D) artmış olduğunu ortaya koyar.
Şekil 1. KKG-Genişleme C2C12 hücrelerinde miyosit Farklılaşma engeller. (A) C2C12 hücreleri seçildikten sonra yayg GFP-CUG5 veya GFP-CUG200 dile getirdi. Ölçek çubukları 100 mikron. Bu rakam, daha önceki kağıdı 10 modifiye edilmiştir. (B) miyotüpleri GFP CUG5 hücrelerinde oluşan, ancak GFP CUG200 hücrelerinde daha azdır. Miyotüpleri ağır zincir (MF-20) immün miyosin ile görselleştirilmiştir. Ölçek çubukları 100 mikron bulunmaktadır. (C) (D) Celf1 gerçek zamanlı RT-PCR analizi, transkripsiyon myoblast farklılaşması sırasında myod, MyoG ve Mef2c ifadesini faktörleri. mRNA düzeyleri, GAPDH normalize sonra çizildi. Hata çubukları standart sapmaları temsil etmektedir. Student T testi kontrolleri için testler karşılaştırmak amacıyla yapıldı. n> 3, * p <0.05. (E) GFP-CUG200 transfeksiyon artmış Celf1 protein ekspresyonu. ß-aktin yükleme kontrolü olarak gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Celf1 bozar Miyoblast Farklılaşma Şekil 2. aşırı ekspresyonu. Eksojen Celf1Flag Expre (A) KanıtıWestern Blot ile C2C12 hücrelerinde salgılanması. (B) mihotüp formasyonu Celf1Flag-aşırı C2C12 iskelet hücreleri bozuktu. Miyotüpleri MF-20 immün ile görselleştirilmiştir. Ölçek çubukları 100 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Celf1 Kısmen kurtarır KKG-Genleşme Bağlı Miyoblast Farklılaşma Eksikliği Şekil 3. demonte. Western Blot ile Celf1 demonte (A) belgesi. GFP CUG200 miyoblastların (B) Celf1 shRNA neden miyotüp oluşumu. Miyotüpleri MF-20 immün ile görselleştirilmiştir. Ölçek çubukları füzyon indeksi ve mihotüp alanları artmıştı 100 mikron. (C) Celf1 ShRNA-kurtarıldı hücrelerdir. Hata çubukları standart sapmaları temsil etmektedir. (D) Celf1 gerçek zamanlı RT-PCR analizi, transkripsiyon farklılaşması sırasında myod, MyoG ve Mef2c ifadesini faktörleri. mRNA düzeyi GAPDH buna normalleştirilmesi sonra çizildi. Hata çubukları standart sapmaları temsil etmektedir. Student T testi kontrolü testleri karşılaştırmak amacıyla yapıldı. n> 3, * p <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C2C12 hücre hattı Miyogenesis 11-14 incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Bu hücreler, bir fibroblast-benzeri bir görünüm korumak,% 20 fetal inek serumu ihtiva eden ortamda hızla çoğalan ve hali hazırda% 2 at serumu 15 ihtiva eden ortam içinde farklılık gösterir. Hızlı büyüme ve farklılaşma bir Miyogenesis hücre modelinde avantajlı özellikleridir. Burada, C2C12 hücrelerine cDNA, 3'-UTR ve shRNA tanıtmak plazmid retroviral ve lentiviral vektörleri kullanımını göstermektedir. transfeksiyon / iletimi ve farklılaşma tutarlılık korunması için kritik noktalar aşağıda belirtilmiştir.
Günlük hücre bakım hücre yoğunluğu kritik öneme sahiptir. % 70 izdiham - Bu hücreler 50 altına kültüre edilmesi gerekebilir. bir gecede terk ettiğinde nedeniyle kısa nüfus iki katına zaman, yüksek izdiham (>% 70) C2C12 kültürü kendiliğinden farklılaştırır. kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin fraksiyonu küçük olsa da, durumfarklılaşmış hücreler daha sonra farklılaşma deneylerinde tutarsızlık katkıda bulunacaktır. düşük geçiş numarası Ayrıca, taze çözülmüş C2C12 hücreleri tercih edilir. bunlar 24 saat sonra tam bir izdiham ulaşmak için farklılaşma için, hücreler, önceden belirlenmiş bir sayı olarak plakalanır. İnsülin, küçük parçalar halinde donmuş tutulur ve farklılaştırma ortamı her değiştiğinde ilave edilir. Bu önlemler farklılaşma sonuçlarını iyileştirmek.
Serum barındırmayan ortam C2C12 hücre transfeksiyonu artırır. Hücreler, gece boyunca transfeksiyon karışımı / serum barındırmayan ortam içinde inkübe edilebilir. Laboratuvarda, biz sitotoksisite hafif belirtileri eşliğinde% 20 transfeksiyon oranına kadar elde eder. C2C12 hücreyi seçmek için kullanılan ilacın yoğunluğu yüksek, 1,2-1,6 mg / ml G418 ya da 1 ila 3 ug / ml puromisin ve daha uzun çok diğer hücre çizgileri daha seçimi süresidir. Nedeniyle yüksek ilaç konsantrasyonu altındaki potansiyel toksisitesi ve genişletilmiş kuluçka süresi, partiden partiyefarklılaşma potansiyelinin varyasyon ortaya çıkabilir. Hücre görünümü dayalı seçim düzeni (konsantrasyon ve süre) ayarlamak için ve birlikte deney ve kontrol grupları tedavi için çok önemlidir.
Biz başarıyla DM1 3'-UTR KKG genişleme yeniden C2C12 hücrelerine GFP-CUG200 girmiştik. GFP-CUG200 C2C12 hücrelerine C2C12 hücreleri ve Celf1 shRNA içine Celf1 Tanıtımı Celf1 upregülasyonun ve Celf1 sırasıyla DM1 myoblast farklılaşma yardımcı olmak için hedef keşif tarafından tetiklenen hücresel ve moleküler olayların değerlendirmesini sağladı. Özetle, burada sunulan C2C12 myoblast modeli myotonik distrofi yanı sıra genel kas hücre biyolojisi ve miyojen farklılaşma soruşturma yararlanır. Bu modelin sınırlama hücre hatlarında Sonuç tamamen organizmalara uzanmaz olmasıdır. Mevcut modellerin bulgular genellikle differentia hayvanlardan taze miyoblastları izole etmek ve okuyan ilerletiliryon. Sonuçta biz organizmalarda myoblast kanıtlarının.
Bu çalışmanın eşsiz gücü DM1 sıralı genetik / patolojik olayları modelleme sağlayan C2C12 iskelet hücreleri içinde çok katmanlı gen manipülasyonu olduğunu. Celf1 patolojik rolleri ayrı ayrı fare modelleri 16,17 çalışıldı ise daha önce, DMPK KKG genişleme RNA toksisitesi etkisi, iskelet hücreleri 11-14 belgelenmiştir. Bu ardışık genetik / patolojik olayların modellenmesi teknik açıdan zor ve zaman hayvan modellerinde gerçekleştirilen eğer alıcıdır. Bu çalışmada da görüldüğü gibi, floresan ve ilaca dirençli belirteçlerin kombine kullanımı myotonik distrofi ek moleküler olayların modellenmesi sağlar. Bu çalışmada modellerle DM1 patogenezinde ayrıntılı mekanizması kesme yararlı olacaktır. Ayrıca, DM1 patogenezinde farklı evreleri hedefleyen ilaçların taranmasında faydalı olacaktır. stratejileri ve bu usulleriÇalışma miyoblastların diğer kas hastalığı modelleri oluşturma konusunda ışık tutabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
