Summary
I detta protokoll presenterar vi procedurerna i upprättandet Dystrofia myotonika 1 myoblast modeller, inklusive optimerade C2C12 cell underhåll, gen transfektion / transduktion, och myocyt differentiering.
Abstract
Dystrofia myotonika 1 (DM1) är en vanlig form av muskeldystrofi. Trots att flera djurmodeller har fastställts för DM1, myoblast cellmodeller är fortfarande viktiga eftersom de erbjuder ett effektivt cellulär alternativ för att studera cellulära och molekylära händelser. Fastän C2C12 myoblastceller har använts i stor utsträckning för att studera myogenes, resistens mot gen transfektion eller viral transduktion, hindrar forskningen i C2C12-celler. Här beskriver vi en optimerad protokoll som inkluderar daglig underhålls transfektion och transduktion förfaranden för att införa gener i C2C12 myoblaster och induktion av myocyt differentiering. Tillsammans står dessa förfaranden möjliggör bästa transfektion / transduktion effektivitet, samt konsekventa differentierings resultat. Protokollet beskrivet i upprättandet DM1 myoblast cellmodeller skulle gynna studiet av myotonisk dystrofi, såväl som andra muskelsjukdomar.
Introduction
Dystrofia myotonika (DM) är en autosomalt dominant sjukdom som drabbar flera system, främst hjärt- och skelettmuskler 1. Det finns två subtyper av sjukdomen, DM1 och DM2. DM1 är vanligare och har en mer allvarlig manifestation än DM2 2. Den genetiska mutationen bakom DM1 är en utvidgning av CUG triplett upprepningar belägna i 3 'otranslaterade regionen (UTR) av DM proteinkinas-genen (DMPK) 3. SAG upprepa nummer i opåverkade individer varierar från 5 till 37. Däremot ökar det till mer än 50, och ibland upp till tusentals i DM1 patienter 4. Som ett resultat, RNA-bindande proteiner, såsom muscleblind liknande en (MBNL1), CUGBP och Elav-liknande familjen 1 (Celf1), är misregulated. På grund av den sekvestrering på de expanderade CUG upprepningar, förlorar MBNL1 dess förmåga att reglera alternativ splitsning 5. Celf1, å andra sidan, är uppreglerad 6,7. Överuttryck av Celf1 förknippas med muskelförlustoch svaghet, som inte tillskrivs förlust av MBNL1 funktion. Djurmodeller simulerar DM1-relaterade förändringar, inklusive DMPK 3'-UTR CUG expansion, förlust av MBNL1, och överuttryck av Celf1, har fastställts. Men modellering DM1 i myoblaster erbjuder ett effektivt alternativ, särskilt för att dissekera DM1-relaterade cellulära och molekylära händelser.
C2C12 myoblast-cellinjen isolerades först från skadade C3H mus muskel och används i stor utsträckning för att studera myogenic differentiering 8,9. C2C12-celler förökar sig snabbt i fetalt bovint serum (FBS) innehållande media och lätt undergår differentiering när FBS utarmas. Men att använda denna myoblast differentiering modell presenterar två utmaningar: C2C12-celler är ofta resistenta mot gen transfektion / virusöverföring; och små variationer i cell hantering och differentiering förfarandet kan leda till påtagliga förändringar i myotube bildning.
Vårt laboratorium rutinmässigt använder C2C12 myoblaster som acell modell och har utvecklat protokoll som effektivt leverera gener från plasmid transfektion, retroviral transduktion, och lentivirala transduktion i C2C12 cellinje 10. I videon visar vi optimerade förfaranden för transfektion / transduktion C2C12-celler och upprätthålla differentiering konsekvens i upprättandet DM1 myoblast modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C2C12 Cell Culture
- Upprätthålla C2C12 mouse myoblaster i en 100 mm platta i tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM)) kompletterat med 20% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 2 mM L-glutamin. Låt C2C12 passe celler att bli cirka 50-60% sammanflytande.
- Kassera tillväxtmediet och tvätta C2C12-celler med 3 ml rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS och tillsätt 500 l 0,25% trypsin-EDTA för att frigöra cellerna. Placera plattan i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 3-5 min.
- Neutralisera trypsin genom tillsats av 3 ml tillväxtmedium. Pipett 6 - 8 gånger för att suspendera cellerna. Tillsätt 1 ml suspenderade cell till en ny 100 mm platta och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.
2. C2C12 Cell Transfektion / överföring och Val
- C2C12 plasmidtransfektion
- 24 h före transfektion, ssena 7,0 x 10 5 C2C12 celler i en brunn i en sex-brunnar för varje transfektion.
Notera: Detta leder till 50-60% konfluens vid tidpunkten för transfektion. - Låt transfektionsreagens att komma till rumstemperatur före användning.
- Tillsätt 2 mikrogram av plasmid-DNA (GFP-CUG5 eller GFP-CUG200) i 200 pl förvärmda serumfritt medium och virvel kort. Lägga 6 pl transfektionsreagens till mediet och blanda omedelbart under 30 sek med användning av en virvel. Inkubera blandningen under 30 min vid rumstemperatur.
- Ändra media C2C12-celler till 2,5 ml serumfritt tillväxtmedium. Tillsätt transfektionsblandningen till cellerna efter inkubation. Återgå plattorna till en 5% CO2, 37 ° C inkubator.
- Hålla cellerna i transfektionsblandningen / serumfritt tillväxtmedium i 4 h eller upp till över natten. Byta media tillbaka till tillväxtmedia nästa dag eller när cytotoxicitet är uppenbar.
Obs: Cytotoxicitet bestäms genom mikroskopisk inspektion av cells. Observera förändringar i cellmorfologi och cell lossnar. Så länge det inte finns någon uppenbar cytotoxicitet, inkubation över natten i serumfritt odlingsmedia ökar transfektion. - Markera cellerna 48 h efter transfektion genom tillsats av 1,2 till 1,6 mg / ml G418 för ~ 10 dagar tills kontrollkulturen (transfekterades utan plasmiderna) inte inverkar levande celler. Ändra media varannan dag med tillväxtmedium kompletterat med G418.
- Bibehålla de G418-resistenta cellerna i tillväxtmedium och 5% CO2 vid 37 ° C under efterföljande experiment.
- 24 h före transfektion, ssena 7,0 x 10 5 C2C12 celler i en brunn i en sex-brunnar för varje transfektion.
- Retrovirus förberedelse och C2C12 retroviral transduktion
- Förbereda HEK 293 odlingsmedium genom att komplettera DMEM hög glukoshalt med 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 2 mM L-glutamin.
- Cirka 24 timmar före transfektion, platta 4,0 x 10 6 ekotropa HEK 293-baserade förpackningscellerna i en 100 mm platta (80% konfluens vid transfektion) containing cellodlingsmediet.
- Låt transfektionsreagens att komma till rumstemperatur före användning.
- Blanda 15 | j, g plasmid-DNA (pMSCV-Puro eller pMSCV-Celf1Flag-Puro) i 1 ml serumfritt tillväxtmedium. Vortex kort. Tillsätt 30 | il transfektionsreagens från steg 2.2.2 i DNA / serumfritt tillväxtmedium röret och blanda väl med hjälp av vortex. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 30 min.
- Lägg transfektion blandningen droppvis till ekotropa HEK 293-baserade förpackningsceller. Snurra försiktigt plattorna och returnera dem tillbaka till 5% CO2, 37 ° C inkubator. Efter 24 timmar, ändra media till 10 ml förvärmt färskt odlingsmedium.
- Skörda supernatanten (innehållande retrovirus) 48 h efter transfektion med användning av en pipett och överföra supernatanten till ett 50 ml centrifugrör. Tillsätt 10 ml av nya varma media på plattan och returnera den till inkubatorn. Hålla supernatanten vid 4 ° C.
Obs: Medierna läggs försiktigt till than sidan av brunnen för att inte störa cellmonoskiktet. - Skörda andra omgången av supernatant 60 timmar efter transfektion och dela den med supernatanten från 2.2.5. Centrifugera vid 500 x g, 4 ° C under 7 min för att avlägsna cellrester.
- Överför supernatanten till ett nytt 50 ml centrifugrör. Använd retrovirus att transducera C2C12-celler vid denna punkt genom att fortsätta till steg 2.2.9 eller delmängd och lagra supernatanten vid -20 ° C för framtida bruk.
- Tina retroviruset från 2.2.7 vid rumstemperatur, om ett fruset lager används här.
Obs: Undvik flera frys-tö cykler. - Platta C2C12-celler på samma dag av transduktion siktar på 30-40% av sammanflöde.
- Kasta odlingsmedium och tvätta C2C12-celler med 3 ml rumstemperatur PBS. Avlägsna PBS, tillsätt 500 | il 0,25% Trypsin-EDTA och inkubera plattan i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 3-5 min.
- Neutralisera trypsin genom att tillsätta 3 ml tillväxt Medium. Pipett 6 - 8 gånger för att suspendera cellerna. Räkna celler med användning av en hemocytometer och tillsätt 8,0 x 10 5 C2C12-celler till en 60 mm platta.
- Tillsätt 0,5 ml retrovirus för att infektera en 60 mm platta med celler i 3 ml tillväxtmedium. Returnera plattan till inkubatorn.
- Ersätta med 3 ml färskt medium kompletterat med val antibiotikum (puromycin 1 - 3 | j, g / ml) 48 h efter infektion. Ersätt 3 ml medium med antibiotika varje dag för ~ 5 dagar tills otransducerade C2C12 kontrollkulturen dör ut.
- Förbereda HEK 293 odlingsmedium genom att komplettera DMEM hög glukoshalt med 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 2 mM L-glutamin.
- Lentivirus förberedelse och C2C12 Lentiviral transduktion
Obs: Utför alla lentivirus relaterade förfaranden i biosäkerhetsnivå 2 skåp och följa biologiska säkerhetsriktlinjer. Flytande avfall som innehåller viruset måste desinficeras innan de bortskaffas.- Platta 4,0 x 10 6 293T celler i en 100 mm platta (~ 80% konfluens vid dagen för transfektion) med HEK 293 cellodlingsmedium (DMEM hög glukoshalt, kompletterat med 10% fetaltbovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 2 mM L-glutamin) 24 h före transfektion.
- Värma transfektionsreagens till rumstemperatur. Blanda lentivirala förpackningar vektorerna (4 mikrogram pMD2.G och 6 mikrogram psPAX2) tillsammans med 8 mikrogram Lentiviral överföringsvek (Celf1 shRNA eller förvrängd kontroll shRNA) i 1 ml serumfritt cellodlingsmedium. Vortex kort.
- Lägg 36 l förvärmda transfektionsreagens till DNA / DMEM röret och blanda väl genom virvel. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 30 min.
- Avlägsna de 293T-celler från inkubatorn och tillsätt transfektionsblandningen till plattan. Snurra försiktigt plattan och returnera den tillbaka till 5% CO2, 37 ° C inkubator. Efter 24 timmar, byta ut transfektion blandning med 10 ml färskt odlingsmedium.
- Samla in supernatanten innehållande lentivirus 48 h efter transfektion och överföra den till en 50 ml centrifugrör. Tillsätt 10 ml nya varma medier till plattan och lämna tillbaka denatt inkubator. Lagra supernatanten vid 4 ° C.
- Samla den andra omgången av supernatant 60 timmar efter transfektion och kombinera det med supernatanten från 2.3.5. Centrifugera kort vid 500 xg, 4 ° C under 7 min.
- Överför supernatanten till ett färskt 50 ml centrifugrör. Om du använder färsk virus vidare till steg 2.3.9. För framtida användning, lagra virusinnehållande supernatanten vid -20 ° C i alikvoter om 10 ml.
- Tina viruset från 2.3.7 vid rumstemperatur före användning, om en frusen lager används.
Obs: Undvik flera frys-tö cykler. - Plate C2C12-CUG200 celler (erhållna i avsnitt 2.1) som beskrivs i 2.2.9 på samma dag av överföring.
Obs: Sikta på 30-40% av sammanflöde. - Tillsätt 0,5 ml virus att infektera en 60 mm platta med C2C12-CUG200 och återgå plattan i inkubatorn.
- Ersätta odlingsmediet med färskt medium kompletterat med valet antibiotikum (puromycin 1 - 3 | j, g / ml) 72 h efter transduktion.Uppdatera odlingsmedia varje dag med valet antibiotikum för ~ 5 dagar tills alla otransducerade C2C12-CUG200 kontrollkultur dör ut.
- Använd Western blot för att kontrollera Celf1 knockdown i GFP-CUG200 transfekterade celler.
3. C2C12 Celldifferentiering
- Plattan 2 x 10 6 celler i en brunn i en 6-brunnsplatta i 2,5 ml tillväxtmedium 24 h före initiering av differentiering.
Notera: Pläteringen densiteten kan justeras så att fullständig konfluens uppnås i 24 tim.- Skölj konfluenta celler med PBS och tillsätt 2,5 ml av låg-serumdifferentieringsmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 2% hästserum, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 1 | iM insulin) . Ersätta mediet varannan dag.
Obs: Håll lager insulin fryst och lägga till media vid varje byte av medium.
- Skölj konfluenta celler med PBS och tillsätt 2,5 ml av låg-serumdifferentieringsmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 2% hästserum, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 1 | iM insulin) . Ersätta mediet varannan dag.
- Under C2C12 differentiering, samla in prover för Quantitativa RT-PCR (se avsnitt 4) på följande tidpunkter: Day0, 1, 2, 4, och 6. Process kulturen för immunfärgning på dag 6-8 (se avsnitt 5).
4. RNA-isolering och Kvantitativ RT-PCR
- Använda tillverkarens protokoll för RNA-isolering. Efter isolering resuspendera RNA-pelleten i 30 | j, l RNas-fritt vatten och pipettera upp och ned flera gånger.
Obs: Proverna kan gå vidare till kvantitativ RT-PCR eller kan förvaras vid -80 ° C. - Använd en RT qPCR kit för kvantitativ RT-PCR 10 och följa tillverkarens instruktioner. Bered reaktionsblandningen enligt tabell 1.
| Komponent | Volym (il) | slutlig koncentration |
| 2x reaktionsbuffert | 10 | 1x |
| framåtriktad primer | 0,5 | 200 nM |
| omvänd primer | 0,5 | 200 nM |
| Sond | 0,5 | 200 nM |
| Omvänt transkriptas och RNas-inhibitor | 0,1 | 0,25 U / ml |
| Mall | 1 | 100 ng totalt RNA |
| RNas fritt vatten | 7,4 | NA |
| totalt Mix | 20 |
Tabell 1. Kvantitativ RT-PCR Master Mix Förberedelse
- Kör en 20 pl RT-qPCR reaktion med hjälp av termisk profil Tabell 2.
| Steget med omvänd transkription | 30 min, 48 ° C |
| DNA-polymerASE aktivering / omvänt transkriptas inaktive | 10 min, 95 ° C |
| 40 cykler | 15 sekund, 95 ° C |
| 1 min, 60 ° C |
Tabell 2. Kvantitativ RT-PCR termisk profil
5. Immunfärgning
- Fixera monolagerkultur i 2,5 ml nyberedd 4% paraformaldehyd / PBS vid rumstemperatur under 10 min.
- Permeabilize proverna i 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS under 30 min vid rumstemperatur.
- Överför proverna till en fuktad kammare. Blockera proverna i 2,5 ml blockeringsbuffert (0,1% nonjoniskt ytaktivt medel / PBS, 10% normalt getserum) under 30 min vid 37 ° C.
- Kassera blockerande buffert och applicera 800 | il primär antikropp mot myosin tung kedja utspädd i blockeringsbuffert (1: 100). Inkubera i en fuktad kammare över natten vid rumstemperatur.
- Tvätta plattan 3 times (10 min vardera) med 2,5 ml tvättbuffert (0,1% polysorbat 20 / PBS) på dag två.
- Ta bort tvättbufferten och applicera 800 | j, l sekundär antikropp (get-anti-mus-IgG, 1: 500 utspätt i PBS). Inkubera i en fuktad kammare vid rumstemperatur under 1 timme.
- Tvätta två gånger (10 min vardera) med 2,5 ml tvättbuffert.
- Inkubera med 800 pl DAPI (1 pg / ml, utspätt i destillerat avjoniserat H2O) under 5 minuter.
- Tvätta med 2,5 ml tvättbuffert igen under 10 min.
- Ändra tvättbufferten till 2,5 ml PBS och använda ett fluorescerande mikroskop för att ta bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C2C12-celler transfekterades med GFP-CUG5 eller GFP-CUG200. Efter läkemedelsresistens urval, var stabila pooler inrättas, som kan visualiseras genom GFP-uttryck (Figur 1A). Myotube bildning i de differentierade myoblaster detekterades genom myosin tung kedja immunfärgning 10 (Figur 1B). Kvantifieringen av myotube formation visade att fusions index minskade från 35,4 ± 4,1% till 2,6 ± 1,1% och myotube områden minskade från 35,6 ± 2,2% till 2,7 ± 0,8% av onormal CUG expansion i GFP-CUG200 (Figur 1C). Fusionsindex och myotube område räknades via det totala antalet kärnor i myotuber (≥ 2 kärnor) delat med det totala antalet kärnor och den procentandel av den totala bildytan som täcks av myotuber, respektive. Realtids-RT-PCR 10 genomfördes för att analysera uttrycket för ett antal muskel annorlundaiation besläktade gener inklusive MyoD, MyoG, Mef2c och Celf1. Jämfört med CUG5 kulturer, ökade CUG200 expressionen av Celf1 mRNA i prolifererande myoblaster vid början av differentieringen. Kongruent med tidigare rapporter var Celf1 uppreglering i samband med CUG-expansion i myogenic dystrofi en (figur 1D). Vidare, Western blotting 10 genomgående visade Celf1 proteinnivå höjdes (figur 1E), och CUG200 inhiberade uttryck av MyoD, MyoG och Mef2c under differentiering (figur 1D). Dessa resultat tyder på att SAG-expansionen leder till myotube defekter och nedsatt myoblast differentiering.
För att studera betydelsen av Celf1 i myoblast differentiering var pMSCV- Celf1Flag retroviral vektor konstrueras för att transducera C2C12-celler. 10 Puromycin-resistenta kloner slogs samman för differentieringsstudier. Western blot-resultaten visade att Flag-tagged Celf1 endast var närvarande i de pMSCV-Celf1Flag transducerade kulturer och uttrycket av Celf1 protein uppreglerades (Figur 2A). Bildandet av myotuber i Celf1-överuttryckande celler är ovanligt jämfört med kontrollodlingar (figur 2B), vilket tyder på att överuttryck av Celf1 försämrar allvarligt myoblast differentiering.
För att bestämma om Celf1 knockdown räddar differentiering brist på CUG expansion celler, Celf1 shRNA levereras till GFP-CUG200 celler genom lentivirala vektorer. Dubbla resistenta kloner (G418 och puromycin) valdes ut och slogs samman för differentieringsstudier. Nivån av endogent Celf1 protein reducerades markant i närvaro av Celf1 shRNA (figur 3A). Efter 6 dagars differentiering, var effekten av Celf1 shRNA öka myotube bildning uppenbar (figur 3B). Fusion index och myotube ärsom var 16,1 ± 3,0% respektive 15,2 ± 1,2%, respektive, jämfört med 4,6 ± 0,8% respektive 5,1 ± 1,3% i kontrollkulturer (Figur 3C). Samtidigt realtids-RT-PCR-resultat tyder på att uttrycket av MyoD, MyoG och Mef2c var signifikant ökat i Celf1 shRNA celler (Figur 3D) stöder Celf1 knockdown räddade myocyt differentiering brist.
Figur 1. CUG-Expansion hämmar myocyt Differentiering i C2C12-celler. (A) C2C12 celler uttryckte GFP-CUG5 eller GFP-CUG200 ubiquitously efter valet. Skalstrecken är 100 ^ m. Denna siffra har ändrats från våra tidigare papper 10. (B) myotuber bildades i GFP-CUG5 celler, men mindre i GFP-CUG200 celler. Myotuber visualiserades genom myosin tung kedja (MF-20) immunfärgning. Skala barer är 100 pm. (C) (D) i realtid RT-PCR-analys av Celf1 faktorer transkription MyoD, MyoG och Mef2c uttryck under myoblast differentiering. mRNA-nivåer plottades efter GAPDH normaliserade. Felgränserna representerar standardavvikelser. Students t-test utfördes för att jämföra de test till kontrollerna. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-CUG200 transfektion ökade Celf1 proteinexpression. ß-aktin visas som laddningskontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Överuttryck av Celf1 försämrar myoblast Differentiering. (A) Bevis på exogen Celf1Flag expression i C2C12-celler genom Western blöt. (B) Myotube bildning försämrades i Celf1Flag-överuttrycker C2C12 myoblaster. Myotuber visualiserades av MF-20 immunfärgning. Skala barer är 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Knockdown av Celf1 Delvis räddar CUG-Expansion-inducerad myoblast Differentiering brist. (A) Bevis på Celf1 knockdown med Western blöt. (B) Celf1 shRNA inducerad myotube bildning i GFP-CUG200 myoblaster. Myotuber visualiserades av MF-20 immunfärgning. Skala barer är 100 pm. (C) Celf1 shRNA-räddade celler som hade ökat fusions index och myotube områden. Felgränserna representerar standardavvikelser. (D) realtids-RT-PCR-analys av Celf1, faktorer transkription MyoD, MyoG och Mef2c expression under differentiering. mRNA-nivå avsattes efter normalisering till det av GAPDH. Felgränserna representerar standardavvikelser. Students t-test utfördes för att jämföra de test till kontroll. n> 3 * P <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C2C12 cellinje har använts som en modell för att studera myogenes 11-14. Dessa celler bibehåller en fibroblast-liknande utseende, prolifererar snabbt i media innehållande 20% fetalt bovint serum och lätt differentiera i medium innehållande 2% hästserum 15. Den snabba tillväxten och differentieringen är fördelaktiga egenskaper i en myogenes cellmodell. Här visar vi användning av plasmid, retroviral och lentivirala vektorer för att introducera cDNA 3'-UTR, och shRNA i C2C12-celler. De kritiska punkterna för transfektion / transduktion och underhåll av konsekvens i differentieringen är markerade nedan.
Celltätheten i det dagliga cell underhåll är kritisk. Dessa celler måste odlas under 50 - 70% konfluens. Grund av den korta populationsfördubblingstid, differentierar hög konfluens (> 70%) C2C12 kultur spontant när de lämnas över natt. Medan fraktionen av spontant differentierade celler kan vara små, närvarondifferentierade celler kommer att bidra till inkonsekvenser i efterföljande differentieringsexperiment. Dessutom, nyligen tinade C2C12-celler som har låg passagenummer föredras. För olika behandling, är celler ströks ut vid förutbestämda nummer så att de når fullständig konfluens efter 24 h. Insulin hålls fryst i små alikvoter och tillsätts varje gång differentieringsmedium byts. Dessa åtgärder för att förbättra differentierings resultat.
Serumfritt medium ökar C2C12 cell transfektion. Cellerna kan inkuberas i transfektionsblandningen / serumfritt medium över natten. I vårt labb, vi nå upp till 20% transfektion ränta, tillsammans med vissa tecken på cytotoxicitet. Koncentrationen av läkemedel som används för att välja C2C12 cell är högre, 1,2 till 1,6 mg / ml G418 eller 1 till 3 | ig / ml puromycin, och varaktigheten av markeringen är längre än de flesta andra cellinjer. På grund av potentiell toxicitet under högt läkemedelskoncentrationen och förlängas inkubationsperioden parti till partivariation i differentieringspotential kan uppstå. Det är mycket viktigt att justera de urvalsregler som (koncentration och varaktighet) baserad på cell utseende och för att behandla de experiment- och kontrollgrupperna tillsammans.
Vi har framgångsrikt infört GFP-CUG200 i C2C12-celler som förökar sig 3'-UTR CUG expansion i DM1. Introducera Celf1 i C2C12-celler och Celf1 shRNA i GFP-CUG200 C2C12-celler har gjort en utvärdering av cellulära och molekylära händelser som utlöses av Celf1 uppreglering och utforskning av inriktning Celf1 att hjälpa DM1 myoblast differentiering, respektive. Sammanfattningsvis modellen C2C12 myoblast presenteras här gynnar utredningen av Dystrofia myotonika samt allmän muskel cellbiologi och myogenic differentiering. Begränsningen av denna modell är att resultaten i cellinjer inte helt kan utsträckas till organismer. Resultaten i de nuvarande modellerna ofta fram till att isolera färska myoblaster från djur och studera deras differentieringtion. Ytterst styrka vi myoblast fynd i organismer.
Den unika styrkan med denna studie är den multi-tier genmanipulation i C2C12 myoblaster, vilket möjliggör modellering av sekventiella genetiska / patologiska händelser i DM1. Tidigare var RNA toxiciteten effekten av DMPK CUG expansionen dokumenteras i myoblaster 11-14, medan de patologiska roller Celf1 ades separat studerats i musmodeller 16,17. Modellering dessa sekventiella genetiska / patologiska händelser är tekniskt utmanande och tidskrävande om det utförs i djurmodeller. Som framgår i denna studie, den kombinerade användningen av fluorescerande och läkemedelsresistenta markörer tillåter modellering av ytterligare molekylära händelser i Dystrofia myotonika. Modellerna som är etablerade i denna studie skulle vara användbar i dissekera de detaljerade mekanismerna i DM1 patogenes. De skulle också vara värdefullt vid screening för läkemedel som riktar sig olika stegen i DM1 patogenes. Strategierna och förfarandena i dennaStudien kan belysa fastställande av andra modeller muskelsjukdom i myoblaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
