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Synthèse de la longueur d'onde de décalage d'ADN à l'aide de sondes d'hybridation cyanine photostable

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54121
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology
* These authors contributed equally

Abstract

Dans ce protocole, nous démontrons une méthode pour la synthèse de 2'-alcyne modifié acide désoxyribonucléique (ADN) brins par synthèse en phase solide automatisée en utilisant la chimie phosphoramidite standard. Les oligonucléotides sont post-synthétiquement marqués par deux nouveaux colorants de cyanine photostable en utilisant le cuivre catalysée par un clic-chimie. La synthèse du donneur et accepteur de colorant est décrit et est réalisée en trois étapes consécutives. Avec l'ADN que l'architecture environnante, ces deux colorants sont soumis à un transfert d'énergie quand ils sont amenés en étroite proximité par hybridation. Par conséquent, le recuit des deux brins d'ADN simple brin est visualisée par un changement de couleur de la fluorescence. Ce changement de couleur est caractérisé par spectroscopie de fluorescence, mais peut aussi être directement observée à l'aide d'un rayonnement ultraviolet de poche (UV), la lampe. Le concept d'une double lecture de la couleur de fluorescence rend ces sondes d'oligonucléotides d'excellents outils pour l'imagerie moléculaire en particulier lorsque le pho décrittostable colorants sont utilisés. De ce fait, le photoblanchiment des sondes d'imagerie est empêchée, et les processus biologiques peuvent être observées en temps réel pendant une période de temps plus longue.

Introduction

L' imagerie moléculaire représente une technique fondamentale pour la compréhension des processus biologiques dans les cellules vivantes. 1-3 Le développement de sondes fluorescentes d'acides nucléiques sur la base de ces applications chimiques et biologiques est devenu un domaine de recherche en pleine expansion. Ces sondes fluorescentes doivent répondre à quelques exigences pour devenir des outils appropriés pour l'imagerie cellulaire. Tout d' abord, les colorants appliqués doivent présenter une fluorescence avec des rendements quantiques élevés, les changements de grande Stokes et, surtout, de hauts photostabilities pour permettre à long terme dans l' imagerie in vivo. Et deuxièmement, ils doivent montrer une lecture de fluorescence fiable. Conventionnel chromophore-quencher-systèmes sont basés sur la lecture d'une seule couleur de fluorescence par de simples changements dans l' intensité de fluorescence. 4 Cette approche porte le risque de résultats faussement positifs ou faussement négatifs en raison de l' autofluorescence des composants intracellulaires ou faibles rapports signal sur bruit en raison de l'extinction indésirable par d'autres composants. 4

Nous avons récemment rapporté sur le concept de "feux d'ADN" qui montrent deux lectures de couleurs de fluorescence en utilisant deux chromophores différents. 5-6 Le concept est basé sur le transfert d'énergie (ET) à partir du donneur de colorant au colorant accepteur qui modifie la fluorescence couleur (voir Figure 1). Ceci permet une lecture plus fiable et fournit ainsi un outil puissant pour les sondes d'imagerie fluorescentes. L'étiquetage des oligonucléotides avec des colorants fluorescents peut être réalisée par deux méthodes différentes. Des colorants peuvent être incorporés lors de la synthèse chimique d'ADN sur une phase solide en utilisant des blocs de construction des phosphoramidites modifiés en conséquence. 7 Cette méthode est limitée aux colorants qui sont stables dans des conditions de phosphoramidite et de déprotection standard. En variante, les méthodes de modification post-synthèse ont été établies dans la chimie des oligonucléotides. Ici, nous démontrons la synthèse d'un de nos nouvelles photosl' énergie de table paires de transfert 8,9 et l'étiquetage post-synthétique de l' ADN en utilisant le cuivre catalysée 1,3-cycloaddition entre azides et alcynes (CuAAC). 10

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Protocol

Attention: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont toxiques et cancérigènes. S'il vous plaît utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées qui sont généralement nécessaires dans les laboratoires de chimie organique, comme le port d'une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants.

1. Synthèse des colorants

Remarque: Les deux colorants peuvent être synthétisés par les mêmes types de réaction Figure 2 montre une vue d' ensemble de ces réactions..

  1. Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-ium (colorant 1)
    1. Synthèse de la 1- (3-iodopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium (figure 2A, l' étape a)
      1. Dissoudre 466 mg de 4-picoline et 5,91 g de 1,3-diiodopropane dans 10 ml d'acétonitrile dans un flacon de 20 ml d'espace de tête et sceller hermétiquement par un bouchon à septum.
      2. Chauffer jusqu'à 85 ° C pendant 16 heures.
      3. Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
      4. Ajouter 20 ml d'acétate d'éthyle à l'huile résiduelle et traiter le mélange dans un bain de 120 W à ultrasons pendant 3 minutes.
      5. Recueillir le précipité formé par filtration et lavage cinq fois avec de l'acétate d'éthyle. Sécher le produit solide sous vide O / N.
    2. Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium (figure 2A, l' étape b)
      1. Dissoudre 900 mg de 1- (3-iodopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium dans 12 ml d'acétonitrile dans un flacon de 20 ml d'espace de tête, ajouter 376 mg d'azoture de sodium, et de sceller hermétiquement par un bouchon à septum.
      2. Chauffer jusqu'à 85 ° C pendant 16 heures.
      3. Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
      4. Ajouter 15 ml de dichlorométhane au résidu.
      5. Filtrez et jeter le précipité résultant.
      6. On élimine le solvant sous pression réduite en utilisant une pourritureaire évaporateur pour obtenir le produit sous forme d'huile brune.
    3. Synthèse de la 1-méthyl-1H-indole-3-carbaldéhyde (figure 2A, l' étape c)
      1. Sous gaz inerte (argon), on dissout 1,45 g d'indole-3-carbaldéhyde, 1,52 g de carbonate de potassium et 2,70 g de carbonate de diméthyle dans 10 ml de diméthylformamide anhydre dans un ballon de 50 ml équipé d'un condenseur à reflux à fond rond.
      2. Incorporer le mélange à 130 ° C pendant 19 heures.
      3. Laisser refroidir à la température ambiante, puis versez le mélange sur la glace.
      4. On extrait la couche aqueuse à trois reprises avec 150 ml d'acétate d'éthyle.
      5. Combiner les couches organiques, les laver avec de l'eau, les sécher sur du sulfate de sodium et éliminer le solvant à 50 ° C sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
    4. Le couplage à la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-ium (colorant 1) (figure 2A, l' étape d)
      1. Travailler sous atmosphère d'argon et à l'abri de l'humidité. Dissolve 90 mg de 1- (3-azidopropyl) -4-méthylpyridine-1-ium et de 48 mg de 1-méthyl-1H-indole-3-carbaldéhyde dans 4 ml d'éthanol dans un flacon de 20 ml équipé d'un condenseur à reflux à fond rond.
      2. Ajouter 0,07 ml de pipéridine et on chauffe à 80 ° C pendant 4 heures.
      3. Laisser refroidir à température ambiante.
      4. Recueillir le précipité résultant par filtration et laver trois fois avec de l'éther diéthylique.
      5. Ajouter de l'éther diéthylique au surnageant et recueillir le précipité résultant par filtration. Laver trois fois avec du diéthyléther.
      6. Combinez les précipités.
  2. Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-2-phényl-1H-indol-3-yl) vinyl) quinoléin-1-ium (colorant 2)
    1. Synthèse de la 1- (3-iodopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium (figure 2B, l' étape a)
      1. Dissoudre 715 mg de 4-méthyl-quinoléine et 5,91 g de 1,3-diiodopropane dans 10 ml d'acétonitrile dans un flacon de 20 ml d'espace de tête et sceller hermétiquement par un bouchon à septum.
      2. Chaleurà 85 ° C pendant 16 heures.
      3. Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
      4. Ajouter 20 ml d'acétate d'éthyle à l'huile restante et traiter le mélange dans un bain de 120 W à ultrasons pendant 3 minutes.
      5. Recueillir le précipité formé par filtration et lavage cinq fois avec de l'acétate d'éthyle. Sécher le produit solide sous vide O / N.
    2. Synthèse de la 1- (3-azidopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium (figure 2B, l' étape b)
      1. Dissoudre 900 mg de 1- (3-iodopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium dans 12 ml d'acétonitrile dans un flacon de 20 ml d'espace de tête, ajouter 333 mg d'azoture de sodium, et de sceller hermétiquement par un bouchon à septum.
      2. Chauffer jusqu'à 85 ° C pendant 16 heures.
      3. Laisser refroidir à la température ambiante, puis éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
      4. Ajouter 15 ml de dichlorométhane au résidu.
      5. Filtrez et jeter le précipité résultant.
      6. Retirez le u solvantelon pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir le produit sous forme d'huile brune.
    3. Synthèse de la 1-méthyl-2-phényl-1H-indole-3-carbaldéhyde (figure 2B, l' étape c)
      1. Sous gaz inerte (argon), on dissout 1,45 g de 2-phényl-1H-indole-3-carbaldéhyde, 0,996 g de carbonate de potassium et 1,77 g de carbonate de diméthyle dans 10 ml de diméthylformamide anhydre dans un ballon de 50 ml équipé d'un condenseur à reflux à fond rond.
      2. Incorporer le mélange à 130 ° C pendant 19 heures.
      3. Laisser refroidir à la température ambiante, puis versez le mélange sur la glace.
      4. On extrait la couche aqueuse à trois reprises avec 150 ml d'acétate d'éthyle.
      5. Combiner les couches organiques, les laver avec de l'eau, les sécher sur du sulfate de sodium et éliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif.
    4. Le couplage à la 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-méthyl-2-phenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) quinoléin-1-ium (figure 2B, l' étape d)
      1. Travailler sous arget à l'abri de l'humidité. Dissoudre 90 mg de 1- (3-azidopropyl) -4-méthylquinoléine-1-ium et 59,7 mg de 1-méthyl-2-phényl-1H-indole-3-carbaldéhyde dans 4 ml d'éthanol dans un ballon de 20 ml à fond rond équipé avec un condenseur à reflux.
      2. Ajouter 0,06 ml de pipéridine et on chauffe à 80 ° C pendant 4 heures.
      3. Laisser refroidir à température ambiante.
      4. Recueillir le précipité résultant par filtration et laver avec du diéthyléther trois fois.
      5. Ajouter de l'éther diéthylique au surnageant et recueillir le précipité résultant par filtration. Laver trois fois avec du diéthyléther.
      6. Combinez les précipités.

2. Synthèse des brins d'ADN

Remarque: La synthèse des brins d'ADN est effectuée en utilisant la méthode au phosphoramidite en phase solide, comme décrit par M. Caruthers 11 sur un synthétiseur d'ADN. Le fonctionnement du synthétiseur est testé avant la procédure de synthèse, et les réactifs sont renouvelés sinécessaire.

  1. préarrangements
    1. Dissoudre le 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite disponible dans le commerce (Cu) dans 1,2 ml de diluant amidite (acétonitrile extra-sec). Déplacer solution dans le flacon à un flacon de synthétiseur et visser dans le synthétiseur.
    2. Effectuer un "test de fuite» (selon les instructions du fabricant) pour vous assurer qu'aucune fuite de gaz d'argon existe. Si le "test de fuite" échoue, visser dans le flacon plus étroitement.
    3. Amorçage de la solution cU en remplissant le tube qui relie la chambre de synthèse en phase solide.
    4. Lavez toutes les lignes avec de l'acétonitrile.
  2. La synthèse des brins d'ADN
    1. Utiliser l'ordinateur connecté à entrer dans la méthode de la séquence d'ADN et de couplage, en suivant les instructions du protocole du fabricant. L'étape de couplage du bloc de construction cU prend 168 secondes avec 7 impulsions (chaque impulsion sont 16 pi) par rapport à 40 sec avec 7 impulsions pour un classiquephosphoramidite en tant que blocs de construction.
    2. Monter la colonne contenant la CPG (verre à pores contrôlés) en tant que phase solide, qui est modifié avec 1 umole de la première base (synthèse de l'ADN est réalisée à partir de 3 'à 5') dans le synthétiseur.
    3. Lancer la synthèse sur le synthétiseur d'ADN 11.
  3. Le traitement des brins d'ADN synthétisés
    1. Sécher les colonnes avec les brins d'ADN synthétisés sous vide O / N.
    2. Utilisez une pince pour ouvrir la colonne et libérer le CPG dans un flacon de réaction. Ajouter 700 ul d'une solution aqueuse concentrée d'ammoniac pour déprotéger l'oligonucléotide et de libérer le brin d'ADN à partir de la CPG.
    3. Fermer le flacon et appliquer un couvercle de sécurité sur le récipient de réaction pour l'empêcher d'éclater, et on chauffe à 50 ° C pendant 18 heures.
    4. Éliminer l'ammoniac par centrifugation sous pression réduite (100 mbar) à 30 ° C pendant 30 min.
    5. Lancer la filtration du CPG: navire Centrifugeuse à 11.000 xg foR 3 min. Prendre surnageant et on la transfère dans un dispositif centrifuge avec une taille de pores de 0,45 pm. Centrifuger à 1000 g pendant 4 min.
    6. ajouter Pendant ce temps 300 pi d'eau distillée deux fois à la CPG, vortex pendant 20 secondes et centrifuger à 11 000 xg pendant 3 min. Transférer le surnageant dans le dispositif centrifuge et centrifuger à 1000 g pendant 4 min. Répéter deux fois cette procédure de lavage.
    7. Enlever l'eau à partir des solutions aqueuses rassemblées par centrifugation à 0,1 mbar et 25 ° CO / N.

3. "En cliquant sur" Procédure

  1. Ajouter 50 ul d'eau bidistillée et 25 pl d'une solution d'ascorbate de sodium (0,4 M dans l'eau), 34 ul de tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) méthyl] amine (0,1 M dans du DMSO / tBuOH 3: 1), 114 pl de l'azoture (0,01 M dans du DMSO / tBuOH 3: 1) et 17 ul d'un tétrakis (acétonitrile) cuivre () solution de l'hexafluorophosphate I (0,1 M dans du DMSO / tBuOH 3: 1) à l'échantillon d'ADN modifié par alcyne lyophilisée. Incuber l'échantillon à 60 ° C pendant 1,5 heure.
  2. Laisser refroidir à température ambiante.
  3. Ajouter 150 ul de Na 2 EDTA (0,05 M dans l' eau) et 450 ul d' acétate de sodium (0,3 M dans l' eau) à l'échantillon d'ADN et la transférer dans un tube de 10 ml.
  4. Ajouter 10 ml d'éthanol (100%) et la maintenir au -32 ° C pendant 16 heures.
  5. Centrifugeuse navire pendant 15 min à 1000 xg et retirer le surnageant.
  6. Laver l'ADN culot avec 2 ml d'éthanol froid (80%).
  7. culot sec sous pression réduite.

4. Purification HPLC

Note: Avant de séparer les brins d'ADN assurez-vous que la HPLC fonctionne correctement, suffisamment de solvant est disponible et la colonne est propre. Rincer la colonne avec la concentration à partir de tampon / acétonitrile.

  1. Dissoudre l'ADN-pellet brut dans 250 ul d'eau bidistillée et le transfert à un flacon de HPLC.
  2. Début HPLC course de 45 min avec un gradient de 0% d'acétonitrile à 15% d'acétonitrile pour colorant 1 et un gradi ent de 0% d'acétonitrile à 17% d'acétonitrile pour la teinture 2. Surveiller la course en vérifiant 260 nm (absorption d'ADN) et 459 nm (colorant 1) ou 542 nm (colorant 2). Recueillir les fractions qui montrent l'absorption dans les deux canaux de longueur d'onde.
  3. Vérifiez les fractions collectées pour le droit de masse par matrice désorption laser assistée par ionisation (MALDI) spectrométrie de masse en utilisant une matrice constituée de 3-hydroxypicolinique acide (3hPa) et diammoniumhydrogencitrate.
    1. Préparer la matrice en mélangeant 900 ul d'une solution saturée de 3-HPA 1: 1 mélange d'acétonitrile et d'eau avec 100 ul d'une solution de diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) dans l'eau.
    2. Pipeter 1-2 pi de la sonde d'ADN sur la cible et le laisser sécher à l'air.
    3. Ajouter 0,2 ul de la matrice 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate à l'échantillon et mélanger jusqu'à ce qu'il cristallise.
    4. Effectuer la spectrométrie de masse MALDI.
    5. Combiner les fractions de CLHP qui présentent le droit de masse.
_title "> 5. Détermination de la concentration

Remarque: La concentration est déterminée en mesurant l'absorption à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre UV / VIS, sur la base des coefficients d'extinction (ε 260) des bases de l' ADN et le colorant.

  1. Dissoudre l'ADN dans 100 - 200 ul doublement eau distillée.
  2. Appliquer 1 pi de la solution d'ADN sur le spectrophotomètre UV / VIS.
  3. Mesurer l'absorption à 260 nm. Répétez trois fois.
  4. Prenez la valeur moyenne pour calculer la concentration de la solution. Pour le calcul des coefficients d'extinction, utilisez ε 260nm des quatre bases naturelles 12 et 260nm de ε du cU de bloc de construction acheté (considérée comme uridine naturelle) 12 pour obtenir le 260nm de ε de l'ensemble du brin d'ADN. Pour colorant 1, l' utilisation ε 260nm = 10200 L * mol -1 * cm pour les colorants 2, l' utilisation ε 260nm = 13100 L * mol -1 et <sup> -1 * cm -1. Calculer la concentration de la solution suivant la loi de Lambert-Beers sur la base des coefficients d'extinction et les absorbances mesurées. 13

6. Préparation des échantillons et Spectroscopie

  1. Préparation des échantillons de simple brin
    1. Préparer séparément 1 ml de solution à 2,5 uM de chacune des ADN1 modifiée et ADN2 dans 200 mM de NaCl, 50 mM de NaP i, pH = 7.
  2. Préparation des échantillons double brin
    1. Préparer 1 ml d'une solution contenant 2,5 uM de ADN1 et 2,5 uM de ADN2 dans 200 mM de NaCl, 50 mM de NaP i, pH = 7 dans un récipient de réaction.
    2. Fixer le couvercle avec un bouchon de sécurité et de la chaleur à 90 ° C pendant 10 min. Ensuite, éteignez le chauffage et laisser refroidir à la température ambiante O / N.
  3. La spectroscopie d'absorption
    Remarque: Pour déterminer la longueur d'onde d'excitation pour la spécification de fluorescenceLes spectres d'absorption spectroscopie sont enregistrés.
    1. Torons mesures simples
      1. Enregistrement d' une mesure à blanc ne contenant que 200 mM de NaCl, mM NaP 50 i, pH = 7.
      2. Transférer la solution préparée de ADN1 dans une cuvette de 1 cm en verre de quartz et d'enregistrer l'absorption. Corrigez la mesure par rapport aux données vierges. Déterminer la valeur maximale d'absorption du colorant.
      3. Répétez l'opération pour ADN2.
  4. La spectroscopie de fluorescence
    1. Torons mesures simples
      1. Enregistrement d' une mesure à blanc contenant mM de NaCl à 200 mM , NaP 50 i, pH = 7; en utilisant la longueur d'onde d'excitation du colorant 1.
      2. Transférer la solution de ADN1 dans une cuvette de 1 cm en verre de quartz.
      3. Relever le spectre de fluorescence.
    2. Double mesure brin
      1. Transférer la solution double brin dans une cuvette de verre de quartz. Enregistrer le spectre de fluorescence en utilisant la longueur d'onde d'excitation du colorant 1.
  5. Expériences de visualisation
    Attention: une protection oculaire appropriée doit être portée pour éviter les dommages UV pour les yeux!
    1. Pour obtenir une meilleure compréhension de ce que les spectres enregistrés montrent, irradier les cuvettes avec lampes UV de poche (figure 5). Observez le changement de couleur de fluorescence de la seule à l'ADN double brin.

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Representative Results

Absorption et spectres de fluorescence de l'ADN simple et double brin sont enregistrés comme le montre la figure 4.

Les spectres d'absorption enregistrés (figure 4 à droite) montrent maxima d' absorption λ max à 465 nm pour ADN1 simple brin (colorant 1) et 546 nm pour ADN2 simple brin (colorant 2). Le DNA1_2 recuite (colorant 1 & colorant 2) montre des maxima à la fois 469 nm et 567 nm. Les deux maxima d'absorption montrent un effet bathochrome, 4 nm pour le colorant 1 et 21 nm pour la teinture 2. Ces petits changements spectroscopiques sont le résultat d'interactions entre les colorants excitonique dans l'architecture double hélice d'ADN.

Les spectres correspondants de fluorescence (Figure 4 à gauche) présentent des maxima λ max, à 537 nm pour ADN1 simple brin (colorant 1, excitation à 435 nm), à 607 nm pour un seulADN2 -stranded (colorant 2, excitation à 535 nm) et à 615 nm pour DNA1_2 recuite (colorant 1 & dye 2, excitation à 435 nm). DNA1_2 montre uniquement le maximum d'émission du colorant 2, bien que le colorant 1 est sélectivement excité qui met en évidence que le transfert d'énergie se produit de manière efficace à partir de colorant pour teindre 1 2. Cela donne un rapport de contraste d'émission de 01:57.

La différence entre simple et double brin est évident en comparant la couleur d'émission dans la cuvette lors de l' excitation avec une lampe UV norme comme le montre la Figure 5.

Figure 1
Figure 1. Concept de base d'un transfert d'énergie dans l' ADN. L'ADN brin donneur modifié (vert) présente une fluorescence à 535 nm lors d'une irradiation à 435 nm. Si elle est hybridée avec la contre-brin accepteur modifié (rouge), le double brin résultant de lhows que la fluorescence rouge du colorant accepteur à 610 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Synthèse vue d'ensemble de colorant 1 colorant et 2. La synthèse des deux colorants de cyanine 1 (A) et 2 (B) est réalisée en trois étapes consécutives. 9 (A) a) 1,3-diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) de K 2 CO 3, du carbonate de diméthyle, le DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) pipéridine, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-diiodopropane, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 93%; c) K 2 CO 3, du carbonate de diméthyle, le DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) pipéridine, EtOH, 80 ° C, 4 heures, 44%. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Structure du bloc cU-bâtiment, les colorants 1 et 2 et des séquences de ADN1 et ADN2. Les colorants 1 et 2 sont liés à la position 2 'du ribose par un lieur triazole dans les séquences données de ADN1 et ADN2. 9 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Fluorescence de brins simple et double brin d' ADN ( à gauche) et l' absorption de brins d'ADN simple brin et double ( à droite). Les spectres d' émission de ADN1 (noir) excité à 464 nm, ADN2 (rouge), excité à 535 nm et 435 nm (rose ), et DNA1_DNA2 hybride (bleu), excité à 435 nm sont présentées. Les spectres d'absorption du ADN1 simple brin (noir), ADN2 (rouge), et le double DNA1_DNA2 brin hybridé (bleu) sont présentées sur le salon du côté droit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Couleur des émissions de l'ADN simple brin avec un colorant donneur ( à gauche) et l' ADN double brin avec donneur et accepteur de colorant ( à droite) lors de l' excitation par une lampe UV. L'image de la cuvette contenant le ADN1 simple brin (left côté) présente une fluorescence vert vif, et l'image de la double DNA1_DNA2 brin (côté droit) présente une fluorescence rouge lors de l' excitation par une lampe UV de poche à 366 nm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ce protocole montre la procédure complète pour marquer l'ADN post-synthétiquement via CuAAC par des colorants fluorescents azoture modifié. Cela comprend la synthèse des colorants et de l'ADN modifié par alcyne ainsi que la procédure d'étiquetage.

La synthèse des colorants en quatre étapes. Tous les produits peuvent être obtenus par une précipitation assez simple en raison de leur charge positive et pas de temps Chromatographie sur colonne est nécessaire. L'introduction des fonctionnalités azides avant les étapes de couplage central raccourcit les synthèses des colorants à quatre au lieu de cinq étapes de réaction consécutives. L'application du 1,3-diiodopropane au lieu du 3-iodopropanol pour l'étape d'alkylation, la réaction d'appel et les réactions Finkelstein suivantes pour convertir la fonction hydroxyle dans les fonctionnalités iodés ont été évitées. Ces changements par rapport aux procédures publiées nous permettent de synthétiser les colorants dans les plus grandes échelles et des périodes plus courtes.

(par exemple, la déprotection avec du carbonate de potassium). Cela représente une solution beaucoup plus coûteuse et nécessite la synthèse des phosphoramidites modifiés par un colorant correspondant en tant que blocs de construction d'ADN ou d'étiquetage sur le support solide (sur le talon).

ADN1 est marqué par le colorant 1, le colorant donneur et le colorant ADN2 par 2, le colorant accepteur. Lorsque ADN1 et ADN2 sont recuites les deux colorants entrent dans la proximité. Un transfert d'énergie efficace est observée lorsque le colorant 1 est excité. En principe, l'interaction excitonique entre les deux colorants peuvent interférer avec un transfert d'énergie efficace puisque ce dernier procédé nécessite l'découplé et d'exciterd colorant 1 et découplées colorant 2. Excitation des colorants couplés entameraient différentes voies photophysiques. 14 Nos études antérieures ont révélé que 9,15 l'arrangement 3'-5'-diagonal appliquée de colorants constitue la base structurelle pour seulement peu interactions excitoniques entre les colorants et le transfert efficace de l'énergie.

Le rendement élevé du transfert d'énergie démontrée permet fluorescence précise la lecture in vitro et dans des expériences in vivo. Cela offre une large gamme d'applications, y compris la visualisation de l'hybridation de l'ADN dans les balises moléculaires, la liaison de molécules cibles dans les aptamères d'acides nucléiques à base ainsi que la visualisation de l'intégrité des petits ARN interférents (ARNsi) à l'intérieur des cellules. La principale limitation est l'obligation d'étiqueter les deux brins d'ADN. Dans l'avenir, nous visons à concentrer notre travail sur le développement de sondes d'oligonucléotides doublement marquée portant les deux colorants dans un brin.

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Acknowledgments

Le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la formation à la recherche Groupe GRK 2039 (financé par DFG) et KIT est grandement apprécié.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
synthesis
4-Picoline Sigma Aldrich 239615
1,3-Diiodopropane Sigma Aldrich 238414
Acetonitrile Fisher Scientific 10660131 HPLC grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10456870 technical grade
Sodium azide Sigma Aldrich 71290 p.a. grade
Dichloromethane Fisher Scientific 10626642 technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98% ABCR AB112969
Potassium carbonate, 99+% Acros 424081000
dimethylcarbonate Sigma Aldrich 517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve Acros 348435000
Sodium sulfate Bernd Kraft 12623.46
Ethanol, 99.5% Acros 397690010
Piperidine, 99% Acros 147181000
Diethylether Fisher Scientific 10407830 technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% ABCR AB125050
4-Methylquinoline ABCR AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer Applied Biosystems  -
DMT-dA(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich A111081
DMT-dT Phosphoramidite Sigma Aldrich T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite Sigma Aldrich G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma Aldrich L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis Sigma Aldrich L010400
Cap A Sigma Aldrich L840000
Cap B Sigma Aldrich L850000
CPG dT Column 1.0 µmole Proligo Reagents T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole Proligo Reagents G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents C461010
ammonia (aqueous solution)  Fluka Analytical 318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm Pall ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) Sigma Aldrich 75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite Chem Genes ANP-7754
workup
vacuum concentrator Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate Sigma Aldrich 346276
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich A7631
EDTA disodium salt Sigma Aldrich E5134
TBTA-ligand  -  - synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer Bruker Daltonics
LC-318 C18 column Supelcosil via Sigma Aldrich 58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio Varian
Fluoromax-3 fluorimeter Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

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References

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Synthèse de la longueur d&#39;onde de décalage d&#39;ADN à l&#39;aide de sondes d&#39;hybridation cyanine photostable
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Arndt, S., Walter, H. K., Wagenknecht, H. A. Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes. J. Vis. Exp. (113), e54121, doi:10.3791/54121 (2016).

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