Abstract
En este protocolo, se demuestra un método para la síntesis de 2'-alquino modificado hebras ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntesis en fase sólida automatizada usando química de fosforamidita estándar. Los oligonucleótidos se post-sintéticamente etiquetados por dos nuevos tintes de cianina fotoestables utilizando catalizada por cobre click-química. La síntesis tanto de tinte donador y el aceptor se describe y se realiza en tres pasos consecutivos. Con el ADN como la arquitectura circundante, estos dos colorantes se someten a una transferencia de energía cuando se ponen en estrecha proximidad por hibridación. Por lo tanto, la hibridación de dos cadenas de ADN de cadena sencilla se visualiza mediante un cambio de color de la fluorescencia. Este cambio de color se caracteriza por espectroscopia de fluorescencia, pero también puede ser observada directamente mediante el uso de una lámpara de ultravioleta de mano (UV). El concepto de una lectura de fluorescencia de dos colores hace que estas sondas de oligonucleótidos excelentes herramientas para imágenes moleculares especialmente cuando el pho descritose utilizan colorantes tostable. De este modo, se evita que photobleaching de las sondas de formación de imágenes, y los procesos biológicos se puede observar en tiempo real para un período de tiempo más largo.
Introduction
La imagen molecular representa una técnica fundamental para la comprensión de los procesos biológicos dentro de las células vivas. 1-3 El desarrollo de sondas basadas en ácidos nucleicos fluorescentes para tales aplicaciones químico-biológicas se ha convertido en un campo de investigación en expansión. Estas sondas fluorescentes tienen que cumplir con algunos requisitos para convertirse en herramientas adecuadas para imágenes de células. En primer lugar, los tintes aplicados deben exhibir fluorescencia con altos rendimientos cuánticos, los cambios grandes de Stokes y, sobre todo, las altas fotoestabilidades para permitir a largo plazo de imágenes in vivo. Y en segundo lugar, deben mostrar una lectura de fluorescencia fiable. Convencional cromóforo-extintor-sistemas se basan en la lectura de un solo color fluorescencia mediante simples cambios en la intensidad de fluorescencia. 4 Este enfoque conlleva el riesgo de resultados positivos falsos o negativos falsos debido a la autofluorescencia de los componentes intracelulares o baja relación señal-ruido debido a enfriamiento no deseado por otro comcomponentes. 4
Recientemente hemos informado sobre el concepto de "semáforos" de ADN que muestran lecturas de fluorescencia de dos colores mediante el uso de dos cromóforos diferentes. 5-6 El concepto se basa en la transferencia de energía (ET) a partir del colorante donante al colorante aceptor que cambia la fluorescencia Color (ver Figura 1). Esto permite una lectura más fiable y por lo tanto proporciona una poderosa herramienta para sondas de imagen fluorescentes. Etiquetado de oligonucleótidos con colorantes fluorescentes se puede lograr mediante dos enfoques diferentes. Los colorantes se pueden incorporar durante la síntesis química de ADN sobre una fase sólida mediante el uso de bloques de construcción de fosforamidita correspondientemente modificados. 7 Este método se limita a colorantes que son estables bajo condiciones de fosforamidita y desprotección estándar. Como alternativa, las metodologías de modificación post-sintéticos fueron establecidos en la química de oligonucleótidos. Aquí, demostramos la síntesis de una de nuestras nuevas fotosenergía tabla de pares de transferencia de 8,9 y el etiquetado de post-sintética de ADN mediante el uso de cobre-1,3-catalizada cicloadición entre azidas y alquinos (CuAAC). 10
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Protocol
Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas apropiadas de seguridad que normalmente se requieren en los laboratorios de química orgánica, tales como el uso de una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes.
1. Síntesis de los colorantes
Nota: Ambos colorantes pueden ser sintetizados por los mismos tipos de reacción Figura 2 muestra una visión general de estas reacciones..
- Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1)
- Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa a)
- Disolver 466 mg 4-picolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum.
- Calentar a 85 ° C durante 16 hr.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
- Añadir 20 ml de acetato de etilo al aceite residual y la mezcla se trata en un baño ultrasónico W 120 para 3 min.
- Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N.
- Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa b)
- Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 376 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum.
- Calentar a 85 ° C durante 16 hr.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
- Añadir 15 ml de diclorometano al residuo.
- Filtrar y desechar el precipitado resultante.
- Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un rotevaporador ary para obtener el producto como aceite de color marrón.
- Síntesis de 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2A, etapa c)
- Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de indol-3-carbaldehído, 1,52 g de carbonato de potasio y 2,70 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo.
- Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo.
- Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo.
- Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a 50 ° C bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio.
- Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1) (Figura 2A, etapa d)
- Trabajar en atmósfera de argón y con exclusión de humedad. DISSOLve 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io y 48 mg 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo.
- Añadir 0,07 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente.
- Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava tres veces con éter dietílico.
- Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico.
- Combinar los precipitados.
- Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa a)
- Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (tinte 2)
- Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, etapa a)
- Disolver 715 mg 4-metilquinolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum.
- Calora 85 ° C durante 16 hr.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
- Añadir 20 ml de acetato de etilo al resto de aceite y tratar la mezcla en un baño ultrasónico 120 W durante 3 min.
- Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N.
- Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, la etapa b)
- Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 333 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum.
- Calentar a 85 ° C durante 16 hr.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
- Añadir 15 ml de diclorometano al residuo.
- Filtrar y desechar el precipitado resultante.
- Retire el disolvente under presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para obtener el producto como aceite de color marrón.
- Síntesis de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2B, la etapa c)
- Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de 2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído, 0,996 g de carbonato de potasio y 1,77 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo.
- Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo.
- Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo.
- Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
- Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-phe nyl-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (Figura 2B, la etapa d)
- Trabajar bajo argsobre y bajo exclusión de humedad. Disolver 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io y 59,7 mg de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz de fondo redondo equipado con condensador de reflujo.
- Añadir 0,06 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente.
- Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava con éter dietílico tres veces.
- Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico.
- Combinar los precipitados.
- Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, etapa a)
2. Síntesis de las cadenas de ADN
Nota: La síntesis de las cadenas de ADN se lleva a cabo utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida, como se describe por M. Caruthers 11 en un sintetizador de ADN. El funcionamiento del sintetizador se prueba antes del procedimiento sintético, y los reactivos se renuevan sinecesario.
- prearrangements
- Se disuelve el disponible comercialmente 2'-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (CU) en 1,2 ml de diluyente amidita (acetonitrilo seco adicional). Mueva la solución en el vial a un vial de sintetizador y el tornillo en el sintetizador.
- Realizar una "prueba de fugas" (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para asegurarse de que no existe una fuga de gas argón. Si la "prueba de fugas" falla, el tornillo en el vial con más fuerza.
- Primer la solución cU rellenando el tubo que conecta a la cámara de síntesis en fase sólida.
- Lave todas las líneas con acetonitrilo.
- Síntesis de cadenas de ADN
- Utilizar el ordenador conectado a entrar en el método de secuencia de ADN y de acoplamiento, siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. La etapa de acoplamiento del bloque de construcción cU tarda 168 segundos con 7 pulsos (cada pulso son 16 l) en comparación con 40 segundos con 7 impulsos para una convencionalfosforamidita como bloques de construcción.
- Montar la columna que contiene el CPG (vidrio de poro controlado) como fase sólida que se ha modificado con 1 mol de la primera base (síntesis de ADN se lleva a cabo a partir de 3 'a 5') en el sintetizador.
- Iniciar la síntesis de ADN en el sintetizador 11.
- Workup de cadenas de ADN sintetizadas
- Se secan las columnas con las cadenas de ADN sintetizadas bajo vacío S / N.
- Utilice una pinza para abrir la columna y liberar la CPG en un vial de reacción. Añadir 700 l de solución de amoniaco acuoso concentrado para desproteger el oligonucleótido y liberar la hebra de ADN a partir de la GPC.
- Cerrar el vial y aplicar una tapa de seguridad en el recipiente de reacción para evitar que se rompa, y se calienta a 50 ° C durante 18 hr.
- Eliminar el amoníaco por centrifugación bajo presión reducida (100 mbar) a 30 ° C durante 30 min.
- Comience la filtración de GPC: Recipiente de centrifugar a 11.000 xg for 3 min. Tome sobrenadante y la transfiere en un dispositivo centrífugo con un tamaño de poro de 0,45 micras. Se centrifuga a 1.000 xg durante 4 minutos.
- Mientras tanto, añadir 300 l de agua doblemente destilada a la GPC, vórtice durante 20 segundos y se centrifuga a 11.000 xg durante 3 min. Transferir el sobrenadante en el dispositivo de centrífuga y centrifugar a 1000 xg durante 4 min. Repita este procedimiento de lavado dos veces.
- Eliminar el agua de las soluciones acuosas combinadas por centrifugación a 0,1 mbar y 25 ° CO / N.
3. Procedimiento de "clic"
- Añadir 50 l de agua doblemente destilada, 25 l de una solución de ascorbato de sodio (0,4 M en agua), 34 l de tris - [(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1), 114 l de la azida (0,01 M en DMSO / tBuOH 3: 1) y 17 l de un tetrakis () de cobre (solución hexafluorofosfato de acetonitrilo I) (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1) a la muestra de ADN alquino-modificado liofilizado. Incubar la muestra a 60 ° C durante 1,5 hr.
- Enfriar a temperatura ambiente.
- Añadir 150 l Na 2 EDTA (0,05 M en agua) y 450 l de acetato de sodio (0,3 M en agua) a la muestra de ADN y la transferencia a un tubo de 10 ml.
- Añadir 10 ml de etanol (100%) y mantenerla en -32 ° C durante 16 horas.
- buque Centrifugar durante 15 min a 1.000 xg y eliminar el sobrenadante.
- Lavar DNA-pellet con 2 ml de etanol frío (80%).
- pellet seco bajo presión reducida.
4. La purificación por HPLC
Nota: Antes de la separación de las hebras de ADN se aseguran de que la HPLC está funcionando adecuadamente, lo suficientemente solvente está disponible y la columna está limpio. Enjuague columna con la concentración de partida de tampón / acetonitrilo.
- Se disuelve el crudo ADN precipitado en 250 l de agua doblemente destilada y la transferencia a un vial de HPLC.
- Iniciar la HPLC de ejecución de 45 min con un gradiente de 0% de acetonitrilo a 15% de acetonitrilo para el tinte 1 y un gradi ento de 0% de acetonitrilo al 17% de acetonitrilo para el tinte 2. Monitorear la carrera por el control de 260 nm (absorción de ADN) y 459 nm (colorante 1) o 542 nm (colorante 2). Reunir las fracciones que muestran la absorción en los dos canales de longitud de onda.
- Compruebe las fracciones recogidas de la masa por la derecha asistida por matriz de ionización de desorción por láser (MALDI) espectrometría de masas usando una matriz que consiste en 3-hidroxipicolínico ácido (3HPA) y diammoniumhydrogencitrate.
- Preparar la matriz mediante la mezcla de 900 l de una solución saturada de 3-HPA en 1: 1 mezcla de acetonitrilo y agua con 100 l de una solución diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) en agua.
- Pipetear 1-2 l de la sonda de ADN en el objetivo y dejar secar al aire.
- Añadir 0,2 l de la matriz de 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate a la muestra y se mezcla hasta que cristaliza.
- Realizar la espectrometría de masas MALDI.
- Combinar las fracciones de HPLC que muestran los medios de la derecha.
Nota: La concentración se determina midiendo la absorción a 260 nm utilizando un espectrofotómetro UV / VIS, sobre la base de los coeficientes de extinción (ε 260) de las bases de ADN y el colorante.
- Disolver el ADN en 100 - 200 l de agua doblemente destilada.
- Aplicar 1 l de la solución de ADN en el UV / Vis espectrofotómetro.
- Medir la absorción a 260 nm. Repetir tres veces.
- Toma el valor medio para calcular la concentración de la solución. Para el cálculo de los coeficientes de extinción, utilizar ε 260 nm de las cuatro bases naturales 12 y el 260 nm ε de la UC bloque de construcción comprado (considerado como uridina natural) 12 para obtener el 260 nm ε de toda la cadena de ADN. Para colorante 1, el uso ε 260 nm = 10,200 * L * mol -1 cm -1 y 2 para el tinte, el uso ε = 260 nm 13.100 L * mol <sup> -1 * cm-1. Calcular la concentración de la solución siguiente ley de Lambert-Beers 'basado en los coeficientes de extinción y absorbancias medidas. 13
6. Preparación de la muestra y Espectroscopía
- Preparación de muestras de una sola hebra
- Preparar separado 1 ml de 2,5 M soluciones de cada uno de los DNA1 modificado y DNA2 en NaCl 200 mM, NaP 50 mM, pH i = 7.
- Preparación de muestras de doble cadena
- Preparar 1 ml de una solución que contiene 2,5 M de DNA1 y 2,5 M de NaCl en DNA2 200 mM, NaP 50 mM I buffer, pH = 7 en un recipiente de reacción.
- Fije la tapa con un tapón de seguridad y el calor a 90 ° C durante 10 min. A continuación, apague la calefacción y se deja enfriar a temperatura ambiente O / N.
- espectroscopia de absorción
Nota: Para determinar la longitud de onda de excitación para la especificación de fluorescenciaLos espectros de absorción espectroscopia se registran.- Capítulo único de mediciones
- Registrar una medición en blanco, solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP I buffer, pH = 7.
- Transferir la solución preparada de DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo y registrar la absorción. Corregir la medición contra los datos en blanco. Determinar el valor máximo de absorción del colorante.
- Repita para DNA2.
- Capítulo único de mediciones
- La espectroscopia de fluorescencia
- Capítulo único de mediciones
- Grabar una medida en blanco que contenía NaCl 200 mM única, NaP 50 mM I buffer, pH = 7; usando la longitud de onda de excitación del tinte 1.
- Transferir la solución DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo.
- Registre el espectro de fluorescencia.
- Medición de doble hebra
- Transferir la solución de doble cadena en una cubeta de vidrio de cuarzo. Registre el espectro de fluorescencia utilizando la longitud de onda de excitación del tinte 1.
- Capítulo único de mediciones
- experimentos de visualización
Precaución: la protección ocular adecuada se debe usar para evitar el daño UV a los ojos!- Para obtener una mejor comprensión de lo que los espectros registrados se muestran, irradiar las cubetas con lámparas UV de mano (Figura 5). Observe el cambio en el color de la fluorescencia de la sola con el ADN de doble cadena.
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Representative Results
La absorción y fluorescencia espectros del ADN de una sola y de doble cadena se registran como se muestra en la Figura 4.
Los espectros de absorción registrada (Figura 4 derecha) muestran la absorción máximos λ max a 465 nm para DNA1 de cadena sencilla (colorante 1) y 546 nm para DNA2 de cadena sencilla (colorante 2). El DNA1_2 recocido (tinte y tinte 1 2) muestra máximos a 469 nm y tanto 567 nm. Tanto máximos de absorción muestran un desplazamiento batocrómico, 4 nm de tinte 1 y 21 nm para el tinte 2. Estos pequeños cambios espectroscópicos son el resultado de interacciones excitónicas entre los colorantes dentro de la arquitectura de doble hélice de ADN.
Los espectros de fluorescencia correspondiente (Figura 4 izquierda) exhiben máximos λ max, a 537 nm para DNA1 de cadena sencilla (colorante 1, excitación a 435 nm), a 607 nm para una solaDNA2 -cables (tinte 2, excitación a 535 nm) y a 615 nm para DNA1_2 recocido (tinte 1 y 2 de tinte, excitación a 435 nm). DNA1_2 muestra únicamente el máximo de emisión del tinte de 2 a pesar de tinte 1 es excitado selectivamente lo que evidencia que la transferencia de energía se produce de manera eficiente de tinte para teñir 1 2. Esto da una relación de contraste de emisión de 1:57.
La diferencia entre hebra simple y doble es evidente comparando el color de emisión en la cubeta durante la excitación con una lámpara de UV estándar como se muestra en la Figura 5.
Figura 1. Concepto básico de una transferencia de energía en el ADN. La hebra de ADN modificado donante (verde) muestra la fluorescencia a 535 nm tras la irradiación a 435 nm. Si se hibrida con la hebra contador aceptor-modificado (rojo) la resultante de doble cadena scómos únicamente la fluorescencia roja del colorante aceptor a 610 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Síntesis visión general de tinte 1 y el colorante 2. La síntesis de los dos colorantes de cianina 1 (A) y 2 (B) se lleva a cabo en tres pasos consecutivos. 9 (A) a) 1,3-diyodopropano, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN 3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-diyodopropano, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN 3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 93%; do) K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 44%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Estructura de bloque de creación de Cu, colorantes 1 y 2 y secuencias de DNA1 y DNA2. Los colorantes 1 y 2 están vinculados a la posición de la ribosa la 2 'por un enlazador triazol dentro de las secuencias dadas de DNA1 y DNA2. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Fluocencia de hebras de ADN de cadena simple y doble (izquierda) y la absorción de las cadenas de ADN de cadena sencilla y doble (derecha). Espectros de emisión de DNA1 (negro) excitado en 464 nm, DNA2 (rojo), excitado a 535 nm y 435 nm (color rosa ), y se muestran híbrido DNA1_DNA2 (azul), se excita a 435 nm. Los espectros de absorción de la DNA1 de cadena sencilla (negro), DNA2 (rojo), y el DNA1_DNA2 hebra doble hibridado (azul) se muestran en el programa de la derecha. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. color de emisión del ADN de cadena sencilla con colorante donante (izquierda) y el ADN de doble cadena con el donante y el colorante aceptor (derecha) durante la excitación por una lámpara UV. La imagen de la cubeta que contiene la DNA1 una sola hebra (left lateral) muestra una fluorescencia verde brillante, y la imagen de DNA1_DNA2 de doble cadena (lado derecho) muestra fluorescencia de color rojo durante la excitación por una lámpara UV a 366 nm de mano. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo muestra el procedimiento completo para etiquetar ADN post-sintéticamente a través de CuAAC por los tintes fluorescentes azida modificado. Esto incluye la síntesis de los colorantes y el ADN alquino-modificado, así como el procedimiento de etiquetado.
La síntesis de los colorantes sigue cuatro pasos. Todos los productos pueden ser obtenidos por una precipitación bastante simple debido a su carga positiva y no se necesita cromatografía en columna consume mucho tiempo. La introducción de las funcionalidades azida antes de las etapas de acoplamiento centrales acorta las síntesis de los colorantes a cuatro en lugar de cinco pasos de reacción consecutivos. se evitaron La aplicación de 1,3-diyodopropano en lugar de 3-yodopropanol para la etapa de alquilación, la reacción de Appel y las siguientes reacciones Finkelstein para convertir la función hidroxilo en las funcionalidades yodo. Estos cambios en comparación con los procedimientos publicados nos permiten sintetizar los colorantes en escalas mayores y períodos más cortos de tiempo.
DNA1 está etiquetado por colorante 1, el colorante donante y DNA2 por colorante 2, el colorante aceptor. Cuando DNA1 y DNA2 se hibridan ambos colorantes se meten en las proximidades. Una transferencia eficiente de la energía se observa cuando tinte 1 se excita. En principio, la interacción entre ambos colorantes excitónica puede interferir con una transferencia de energía eficiente ya que este último proceso exige la desacoplar y excitard tinte 1 y desacoplado tinte 2. La excitación de los colorantes acoplados iniciarían diferentes vías fotofísicas. 14 Nuestros estudios previos 9,15 revelaron que el aplicado disposición 3'-5'-diagonal de colorantes proporciona la base estructural para solamente pequeñas interacciones excitónicas entre los colorantes y transferencia de energía eficiente.
La alta eficiencia de la transferencia de energía de fluorescencia demostrado permite la lectura precisa en in vitro e in vivo. Esto ofrece una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la visualización de la hibridación de ADN en las balizas moleculares, la unión de moléculas diana en aptámeros de ácidos nucleicos basados, así como la visualización de la integridad de pequeños ARN de interferencia (siRNA) dentro de las células. La principal limitación es el requisito para etiquetar ambas cadenas de ADN. En el futuro, nuestro objetivo es centrar nuestra labor en el desarrollo de sondas de oligonucleótidos doblemente marcada que llevan ambos colorantes en una hebra.
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Acknowledgments
El apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), el Grupo de Investigación de Formación GRK 2039 (financiado por la DFG) y el KIT se agradece.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
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