Abstract
In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Synthese von 2'-Alkin-Desoxyribonukleinsäure (DNA) Stränge durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie modifiziert. Oligonukleotide werden nach der Synthese durch zwei neue photo Cyaninfarbstoffen markiert unter Verwendung von Kupfer-katalysierte Klick-Chemie. Die Synthese von Spender und Akzeptor-Farbstoff ist, beschrieben und wird in drei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. Mit der DNA wie die umgebende Architektur, diese beiden Farbstoffe laufen einen Energietransfer, wenn sie in die Nähe von Hybridisierung gebracht werden. Daher Annealing von zwei einzelsträngigen DNA-Stränge wird durch eine Veränderung der Fluoreszenzfarbe visualisiert. Diese Farbänderung wird durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert, sondern auch durch die Verwendung eines Hand ultraviolette (UV) Lampe direkt beobachtet werden kann. Das Konzept einer Doppelfluoreszenzfarbe Auslese macht diese Oligonukleotidsonden hervorragende Werkzeuge für die molekulare Bildgebung vor allem, wenn die beschriebene photostable Farbstoffe verwendet. Dadurch Photobleaching der Abbildungssonden verhindert und biologische Prozesse in Echtzeit für einen längeren Zeitraum beobachtet werden.
Introduction
Die molekulare Bildgebung stellt eine grundlegende Technik für die in lebenden Zellen biologischen Prozesse verstehen. 1-3 Die Entwicklung von fluoreszierenden Nukleinsäure-basierte Sonden für solche chemisch-biologische Anwendungen ein expandierendes Forschungsgebiet geworden ist. Diese Fluoreszenzsonden müssen einige Anforderungen erfüllen die geeigneten Werkzeuge für Cell Imaging zu werden. Erstens sollten die eingesetzten Farbstoffe Fluoreszenz mit hoher Quantenausbeute aufweisen, große Stokes-Verschiebungen und, was am wichtigsten ist , hohe Photostabilitäten Langzeit - in vivo - Bildgebung zu ermöglichen. Und zweitens sollten sie eine zuverlässige Fluoreszenzanzeige zeigen. Herkömmliche Chromophor-Löscher-Systeme auf der Anzeige eines einzelnen Fluoreszenzfarbe durch einfache Veränderungen in der Fluoreszenzintensitäten basieren. 4 Dieser Ansatz das Risiko von falsch - positiven oder falsch - negative Ergebnisse trägt wegen Autofluoreszenz von intrazellulären Komponenten oder Low - Signal-zu-Rausch - Verhältnis aufgrund unerwünschter Löschung durch andere componenten. 4
Vor kurzem berichteten wir über das Konzept der "DNA - Ampel" , die zwei unterschiedliche Chromophore durch Verwendung von Dual - Fluoreszenzfarbe Ablesungen zeigen. 5-6 Das Konzept basiert auf dem Energietransfer (ET) aus dem Donor - Farbstoff an den Akzeptor - Farbstoff, der die Fluoreszenz ändert Farbe (siehe Abbildung 1). Dies ermöglicht eine zuverlässigere Anzeige und stellt damit ein leistungsfähiges Werkzeug für Fluoreszenz-Imaging-Sonden. Markierung von Oligonucleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen kann durch zwei verschiedene Ansätze erreicht werden. Farbstoffe können während der chemischen DNA - Synthese an einer festen Phase unter Verwendung von entsprechend modifizierten Phosphoramidit - Bausteinen. 7 Diese Methode ist beschränkt auf Farbstoffe eingearbeitet werden , die unter Bedingungen Standard - Phosphoramidit und Entschützung stabil sind. Als Alternative wurden post-synthetische Modifikation Methoden in Oligonukleotidchemie etabliert. Hier zeigen wir die Synthese eines unserer neuen FotosTabelle Energietransferpaare 8,9 und die post-synthetischen Markierung von DNA durch Kupfer-katalysierte 1,3-Cyclo zwischen Aziden und Alkinen (CuAAC) verwendet wird . 10
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Protocol
Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken, die typischerweise in der organischen Chemie Laboratorien erforderlich sind, wie zum Beispiel ein Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe zu tragen.
1. Synthese der Farbstoffe
Anmerkung: Beide Farbstoffe können durch die gleichen Reaktionstypen synthetisiert werden , Figur 2 einen Überblick über diese Reaktionen zeigt..
- Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium - iodid (Farbstoff 1)
- Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylpyridin-1-ium - iodid (2A, Schritt a)
- Man löst 466 mg 4-Picolin und 5,91 g 1,3-Diiodpropan in 10 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle und Dichtung dicht mit einer Septumkappe.
- Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden.
- Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck, um einen Rotationsverdampfer.
- 20 ml Ethylacetat zu dem Restöl und behandeln der Mischung in einem 120 W Ultraschallbad für 3 min.
- Sammeln des gebildeten Niederschlag durch Filtration und wäscht fünfmal mit Essigester. Trocknen Sie das feste Produkt unter Vakuum O / N.
- Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium (2A, Schritt b)
- Man löst 900 mg 1- (3-Iodpropyl) -4-methylpyridin-1-ium-iodid in 12 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle, fügen 376 mg Natriumazid, und abdichten dicht durch eine Septumkappe.
- Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden.
- Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.
- 15 ml Dichlormethan zu dem Rückstand.
- Filter aus und entsorgen Sie die resultierende Niederschlag.
- Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck unter Verwendung eines rotary Verdampfer um das Produkt als braunes Öl zu erhalten.
- Synthese von 1-Methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (2A, Schritt c)
- Unter Schutzgas (Argon), lösen sich 1,45 g Indol-3-carbaldehyd, 1,52 g Kaliumcarbonat und 2,70 g Dimethylcarbonat in 10 ml absolutem Dimethylformamid in einem 50 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet.
- Rühren Sie die Mischung bei 130 ° C für 19 Std.
- Lassen Sie auf RT abkühlen, dann gießen Sie die Mischung auf Eis.
- Die wässrige Phase dreimal mit je 150 ml Ethylacetat.
- Die organischen Schichten, sie mit Wasser waschen, trocknen Sie sie über Natriumsulfat und Entfernen des Lösungsmittels bei 50 ° C unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.
- Ankoppeln an 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium - iodid (Farbstoff 1) (2A, Schritt d)
- Arbeiten unter Argon und unter Ausschluss von Feuchtigkeit. DISSOLve 90 mg 1- (3-Azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium und 48 mg 1-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd in 4 ml Ethanol in einem 20 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet.
- Hinzufügen, 0,07 ml Piperidin und Wärme auf 80 ° C für 4 Stunden.
- Erlauben auf RT abkühlen.
- Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration und wäscht dreimal mit Diethylether.
- Hinzufügen Diäthyläther zu dem Überstand und Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration. Waschen dreimal mit Diethylether.
- Kombinieren Sie die Niederschläge.
- Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylpyridin-1-ium - iodid (2A, Schritt a)
- Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinolin-1-ium - iodid (Farbstoff 2)
- Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylchinolin-1-ium - iodid (2B, Schritt a)
- Man löst 715 mg 4-methylchinolin und 5,91 g 1,3-Diiodpropan in 10 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle und Dichtung dicht mit einer Septumkappe.
- Hitzebis 85 ° C für 16 Stunden.
- Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.
- 20 ml Ethylacetat zu dem restlichen Öl und behandeln der Mischung in einem 120 W Ultraschallbad für 3 min.
- Sammeln des gebildeten Niederschlag durch Filtration und wäscht fünfmal mit Essigester. Trocknen Sie das feste Produkt unter Vakuum O / N.
- Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4-methylchinolin-1-ium (2B, Schritt b)
- Man löst 900 mg 1- (3-Iodpropyl) -4-methylchinolin-1-ium-iodid in 12 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle, fügen 333 mg Natriumazid, und abdichten dicht durch eine Septumkappe.
- Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden.
- Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.
- 15 ml Dichlormethan zu dem Rückstand.
- Filter aus und entsorgen Sie die resultierende Niederschlag.
- Entfernen Sie das Lösungsmittel under vermindertem Druck am Rotationsverdampfer das Produkt als braunes Öl zu erhalten.
- Synthese von 1-Methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd (2B, Schritt c)
- Unter Schutzgas (Argon), lösen sich 1,45 g 2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd, 0,996 g Kaliumcarbonat und 1,77 g Dimethylcarbonat in 10 ml absolutem Dimethylformamid in einem 50 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet.
- Rühren Sie die Mischung bei 130 ° C für 19 Std.
- Lassen Sie auf RT abkühlen, dann gießen Sie die Mischung auf Eis.
- Die wässrige Phase dreimal mit je 150 ml Ethylacetat.
- Die organischen Schichten, sie mit Wasser waschen, trocknen Sie sie über Natriumsulfat und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer.
- Ankoppeln an 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phe nyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinolin-1-ium - iodid (2B, Schritt d)
- Die Arbeiten im Rahmen argauf und unter Ausschluss von Feuchtigkeit. Man löst 90 mg 1- (3-Azidopropyl) -4-methylchinolin-1-ium und 59,7 mg 1-Methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd in 4 ml Ethanol in einem 20 ml-Rundkolben, ausgestattet mit Rückflußkühler.
- 0.06 ml Piperidin und Wärme auf 80 ° C für 4 Stunden.
- Erlauben auf RT abkühlen.
- Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration und wäscht mit Diäthyläther dreimal.
- Hinzufügen Diäthyläther zu dem Überstand und Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration. Waschen dreimal mit Diethylether.
- Kombinieren Sie die Niederschläge.
- Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylchinolin-1-ium - iodid (2B, Schritt a)
2. Synthese der DNA-Stränge
Anmerkung: Die Synthese der DNA - Stränge erfolgt auf einer Festphase , die Phosphoramidit - Methode, wie von M. Caruthers 11 auf einem DNA - Synthesizer beschrieben. Die Funktionsweise des Synthesizers wird vor dem Syntheseverfahren getestet, und die Reagenzien werden erneuert, wennnotwendig.
- Vorplanung
- Man löst den im Handel erhältlichen 2'-O-Propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) in 1,2 ml Amiditchemie Verdünnungsmittel (extra trockenem Acetonitril). Bewegen Lösung in dem Fläschchen mit einem Synthesizer Fläschchen und verschrauben Synthesizer.
- Führen Sie eine "Dichtigkeitsprüfung" (nach Herstellerangaben), um sicherzustellen, dass kein Argongas Leck vorhanden ist. Wenn der "Dichtigkeitsprüfung" versagt, Schraube noch fester in das Fläschchen.
- Prime die cU Lösung durch das Rohr füllt, die auf der Festphasensynthese Kammer verbindet.
- Waschen Sie alle Linien mit Acetonitril.
- Synthese von DNA - Strängen
- Die angeschlossenen Computer die DNA-Sequenz und Kopplungsverfahren einzugeben, nach den Anweisungen aus dem Protokoll des Herstellers. Der Kupplungsschritt des cU Baustein nimmt 168 sec mit 7 Impulsen (jeder Impuls sind 16 & mgr; l) im Vergleich zu 40 Sekunden mit 7 Impulsen für ein herkömmlichesPhosphoramidit als Bausteine.
- Montieren der Säule die CPG (controlled pore glass) als feste Phase enthält, die mit 1 & mgr; Mol der ersten Base modifiziert ist, in den Synthesizer (DNA-Synthese von 3 'bis 5') durchgeführt.
- Startet die Synthese auf der DNA - Synthesizers 11.
- Die Aufarbeitung der synthetisierten DNA - Stränge
- Trocknen Sie die Spalten mit den synthetisierten DNA-Stränge unter Vakuum O / N.
- Verwenden Sie eine Zange um die Säule zu öffnen und das CPG in ein Reaktionsgefäß lösen. Hinzufügen, 700 & mgr; l konzentrierter wässriger Ammoniaklösung das Oligonucleotid zu entschützen und geben den DNA-Strang aus der CPG.
- Küvette und wenden sie platzen und Hitze ein Sicherheitsdeckel auf das Reaktionsgefäß 18 Stunden auf 50 ° C zu verhindern.
- Entfernen Ammoniak durch Zentrifugation unter vermindertem Druck (100 mbar) bei 30 ° C für 30 min.
- Starten Filtration von CPG: Zentrifugenbehälter bei 11.000 xg for 3 min. Nehmen Überstand und gibt sie in eine Zentrifugenvorrichtung mit einer Porengröße von 0,45 um. Zentrifuge bei 1000 × g für 4 min.
- hinzufügen Inzwischen wurden 300 ul doppelt destilliertem Wasser auf die CPG, Vortex für 20 Sekunden und Zentrifuge bei 11.000 g für 3 min. Den Überstand in die Fliehkraftvorrichtung und Zentrifuge bei 1000 × g für 4 min. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal.
- Entfernen des Wassers aus den vereinigten wässrigen Lösungen bei 0,1 mbar und 25 ° CO / N Zentrifugieren.
3. "Ein Klick" Verfahren
- Zugabe von 50 & mgr; l doppelt destilliertem Wasser, 25 ul einer Natriumascorbat-Lösung (0,4 M in Wasser), 34 & mgr; l Tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 & mgr; l des Azids (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) und 17 ul eines Tetrakis (acetonitril) kupfer (I) hexafluorophosphat-Lösung (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) mit dem lyophilisierten Alkin-modifizierte DNA-Probe. Inkubieren der Probe bei 60 ° C für 1,5 Std.
- Abkühlen auf RT.
- Zugabe von 150 & mgr; l Na 2 EDTA (0,05 M in Wasser) und 450 & mgr; l Natriumacetat (0,3 M in Wasser) zu der DNA - Probe und in ein 10 ml Röhrchen.
- In 10 ml Ethanol (100%) und halten bei -32 ° C für 16 Stunden.
- Zentrifugengefäß für 15 min bei 1000 xg Überstand und zu entfernen.
- Waschen DNA-Pellet mit 2 ml kaltem Ethanol (80%).
- Trocknen des Pellets unter vermindertem Druck.
4. HPLC-Reinigung
Hinweis: Vor dem Trennen der DNA-Stränge sicher, dass die HPLC ordnungsgemäß funktioniert, ist genügend Lösungsmittel vorhanden, und die Säule ist sauber. Spülen Sie Spalte mit der Ausgangskonzentration des Puffers / Acetonitril.
- Man löst das rohe DNA-Pellet in 250 & mgr; l zweifach destilliertem Wasser aufgelöst und in eine HPLC-Fläschchen.
- Starten HPLC-Lauf von 45 min mit einem Gradienten von 0% Acetonitril bis 15% Acetonitril für Farbstoff 1 und einem gradi ent von 0% Acetonitril bis 17% Acetonitril für Farbstoff 2. Lauf durch Prüfen 260 nm (DNA-Absorption) und 459 nm (Farbstoff 1) oder 542 nm (Farbstoff 2) Monitor. Sammeln Sie diese Fraktionen, die Absorption in den beiden Wellenlängenkanälen zeigen.
- Überprüfen Sie die gesammelten Fraktionen für die rechte Masse durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie eine Matrix, bestehend aus 3-Hydroxypicolinsäure (3HPA) und diammoniumhydrogencitrate.
- Bereiten Sie die Matrix durch Mischen von 900 ul einer gesättigten 3-HPA-Lösung in 1: 1-Gemisch aus Acetonitril und Wasser mit 100 ul einer diammoniumhydrogencitrate Lösung (100 g / l) in Wasser.
- Pipettieren 1-2 ul der DNA-Sonde auf dem Ziel und lassen Sie es trocken auf Luft.
- In 0,2 ul der 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate Matrix auf die Probe und mischen, bis es kristallisiert.
- Führen Sie MALDI-Massenspektrometrie.
- Kombinieren Sie diese HPLC-Fraktionen, die die richtige Masse aufweisen.
Anmerkung: Unter Verwendung eines UV / Vis - Spektrophotometer, basierend auf den Extinktionskoeffizienten (ε 260) der DNA - Basen und den Farbstoff Die Konzentration wird bestimmt , indem die Absorption bei 260 nm gemessen wird .
- Lösen Sie die DNA in 100 bis 200 & mgr; l doppelt destilliertem Wasser.
- Anwenden 1 ul der DNA-Lösung auf dem UV / Vis-Spektrophotometers.
- Messen der Absorption bei 260 nm. Dreimal wiederholen.
- Nehmen den Mittelwert der Konzentration der Lösung zu berechnen. Für die Berechnung der Extinktionskoeffizienten, verwenden & egr 260nm der vier natürlichen Basen 12 und die ε 260nm des gekauften Baustein cU (als natürliche Uridin betrachtet) 12 , um die ε 260nm des gesamten DNA - Strang erhalten. Für Farbstoff 1, Verwendung ε 260nm = 10.200 L * mol -1 * cm -1 und Farbstoff 2, Verwendung ε 260nm = 13.100 L * mol <sup> -1 * cm -1. Berechnen Sie die Konzentration der Lösung nach Lambert-Beers Gesetz basiert auf den Extinktionskoeffizienten und gemessenen Extinktionen. 13
6. Probenvorbereitung und Spektroskopie
- Herstellung von Einzelstrang - Proben
- Bereiten getrennt 1 ml von 2,5 & mgr; M Lösungen von jedem der modifizierten DNA1 und DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i, pH = 7.
- Herstellung von Doppelstrang - Proben
- Vorbereitung 1 ml einer Lösung , die 2,5 uM und 2,5 uM DNA1 von DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i, pH = 7 in einem Reaktionsgefäß.
- Befestigen Sie den Deckel mit einer Schutzkappe und Hitze bis 90 ° C für 10 min. Dann Heizung ausschalten und lassen RT O / N abzukühlen.
- Absorptionsspektroskopie
Hinweis: Um die Anregungswellenlänge für die Fluoreszenz-Spezifikation bestimmentroskopisch Absorptionsspektren aufgezeichnet.- Einzelstrang - Messungen
- Nehmen Sie eine leere Messung mit nur 200 mM NaCl, 50 mM NaP i - Puffer, pH = 7.
- Übertragen Sie die vorbereitete Lösung von DNA1 in eine 1 cm Quarzglaskuvette und notieren Sie die Absorption. Korrigieren Sie die Messung gegen die leeren Daten. Bestimmen Sie den maximalen Wert der Farbstoffabsorption.
- Wiederholen Sie dies für DNA2.
- Einzelstrang - Messungen
- Fluoreszenzspektroskopie
- Einzelstrang - Messungen
- Nehmen Sie eine leere Messung mit nur 200 mM NaCl, 50 mM NaP i - Puffer, pH = 7; mit der Anregungswellenlänge des Farbstoffes 1.
- Übertragen Sie die DNA1 Lösung in eine 1 cm Quarzglaskuvette.
- Nehmen Sie das Fluoreszenzspektrum.
- Doppelstrang - Messung
- Übertragen Sie die Doppelstrang-Lösung in eine Quarzglaskuvette. Nehmen Sie das Fluoreszenzspektrum mit der Anregungswellenlänge von Farbstoff 1.
- Einzelstrang - Messungen
- Visualisierung Experimente
Achtung: Geeignete Schutzbrille getragen werden UV-Schäden an den Augen zu vermeiden!- Um ein besseres Verständnis dessen , was die aufgenommenen Spektren zeigen, bestrahlen die Küvetten mit Hand UV-Lampen (Abbildung 5). Beachten Sie die Veränderung der Fluoreszenzfarbe von der einzigen zur doppelsträngigen DNA.
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Representative Results
Absorptions- und Fluoreszenzspektren des Einzel- und Doppelstrang - DNA, wie in Figur 4 gezeigt aufgezeichnet.
Die aufgezeichneten Absorptionsspektren (Abbildung 4 rechts) zeigen Absorptionsmaxima λ max bei 465 nm für einsträngige DNA1 (Farbstoff 1) und 546 nm für einsträngige DNA2 (Farbstoff 2). Das angelagerte DNA1_2 (Farbstoff 1 Farbstoff 2) zeigt Maxima bei sowohl 469 nm und 567 nm. Beide Absorptionsmaxima zeigen eine bathochrome Verschiebung, 4 nm für Farbstoff 1 und 21 nm für Farbstoff 2. Diese kleinen spektroskopischen Veränderungen das Ergebnis exzitonischer Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffen in der DNA-Doppelhelix-Architektur sind.
Die entsprechende Fluoreszenzspektren (Abbildung 4 links) zeigen Maxima λ max bei 537 nm für einsträngige DNA1 (Farbstoff 1, Anregung bei 435 nm), bei 607 nm für einzelne-litzen DNA2 (Farbstoff 2, Anregung bei 535 nm) und bei 615 nm für geglüht DNA1_2 (Farbstoff 1 Farbstoff 2, Anregung bei 435 nm). DNA1_2 zeigt lediglich den Emissionsmaximum von Farbstoff 2 obwohl Farbstoff 1 selektiv angeregt wird, die beweist, dass die Energieübertragung 1 effizient von Farbstoff tritt 2. färben Daraus ergibt sich ein Emissionskontrastverhältnis von 1.57.
Der Unterschied zwischen Einzel- und Doppelstrang ist offensichtlich durch die Emissionsfarbe in der Küvette während der Anregung mit einem Standard - UV-Lampe zu vergleichen , wie in Figur 5 gezeigt.
Abbildung 1. Grundkonzept eines Energietransfer in DNA. Der Spender modifizierte DNA - Strang (grün) zeigt Fluoreszenz bei 535 nm bei Bestrahlung bei 435 nm. Wenn es mit dem Akzeptor-modifizierten Gegenstrang (rot) die resultierende Doppelstrang s hybridisiertHows nur die rote Fluoreszenz des Akzeptor - Farbstoff bei 610 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figure 2. Synthese Überblick Farbstoff 1 und Farbstoff 2 Die Synthese der zwei Cyaninfarbstoffen 1 (A) und 2 (B) wird in drei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. 9 (A) a) 1,3-Diiodpropan, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) K 2 CO 3, Dimethylcarbonat, DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-Diiodpropan, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 93%; c) K 2 CO 3, Dimethylcarbonat, DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 Stunden, 44%. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Struktur von cU-Baustein, Farbstoffe 1 und 2 und Sequenzen von DNA1 und DNA2. Die Farbstoffe 1 und 2 an der 2' - Position verknüpft sind der Ribose durch ein Triazol Linker innerhalb der vorgegebenen Sequenzen von DNA1 und DNA2. 9 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Fluozenz von Einzel- und Doppelstrang - DNA - Stränge (links) und die Aufnahme von Einzel- und Doppelstrang - DNA - Stränge (rechts). Die Emissionsspektren von DNA1 (schwarz) angeregt bei 464 nm, DNA2 (rot), angeregt bei 535 nm und 435 nm (pink ) und DNA1_DNA2 hybrid (blau), gezeigt bei 435 nm angeregt werden. Die Absorptionsspektren des einsträngigen DNA1 (schwarz), DNA2 (rot) und der hybridisierten Doppelstrang DNA1_DNA2 (blau) sind auf der rechten Seite zeigen gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Emissionsfarbe der Einzelstrang - DNA mit Donorfarbstoffes (links) und doppelsträngige DNA mit Donator und Akzeptor - Farbstoff (rechts) bei der Anregung durch eine UV-Lampe. Das Bild der Küvette die einsträngige DNA1 enthält (left Seite) zeigt helle grüne Fluoreszenz, und das Bild von doppelsträngigen DNA1_DNA2 (rechte Seite) zeigt rote Fluoreszenz bei Anregung durch einen Handheld - UV-Lampe bei 366 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll zeigt die komplette Prozedur DNA post-synthetisch über CuAAC durch Azid-modifizierte fluoreszierende Farbstoffe zu kennzeichnen. Dies schließt die Synthese der Farbstoffe und Alkin-modifizierte DNA als auch die Markierungsverfahren.
Die Synthese der Farbstoffe folgende vier Schritte. Alle Produkte können durch eine recht einfache Fällung erhalten werden aufgrund ihrer positiven Ladung und nicht zeitaufwendig Säulenchromatographie benötigt. Die Einführung der Azid-Funktionalitäten vor den zentralen Kupplungsschritte verkürzt die Synthese der Farbstoffe zu vier statt fünf aufeinanderfolgenden Reaktionsschritten. Die Anwendung von 1,3-Diiodpropan anstelle von 3-iodopropanol für den Alkylierungsschritt, der Appel-Reaktion und die folgenden Reaktionen Finkelstein die Hydroxylfunktion in die iod Funktionalitäten umgewandelt wurden vermieden. Diese Veränderungen im Vergleich zu den veröffentlichten Verfahren ermöglichen es uns, die Farbstoffe in größeren Maßstäben und kürzere Zeiträume zu synthetisieren.
DNA1 wird von Farbstoff 1, der Donor-Farbstoff und DNA2 von Farbstoff 2, der Akzeptor-Farbstoff markiert. Wenn DNA1 und DNA2 geglüht werden erhalten beide Farbstoffe in unmittelbarer Nähe. Eine effiziente Energieübertragung beobachtet wird, wenn Farbstoff 1 angeregt wird. kann mit einer effizienten Energieübertragung stören excitonische Wechselwirkung zwischen den beiden Farbstoffen Prinzipiell da dieser Prozess die abgekoppelt und erregen erfordertd Farbstoff 1 und Farbstoff abgekoppelt 2. Anregung der gekoppelten Farbstoffe würden unterschiedliche photophysikali- Wege initiieren. 14 Unsere bisherigen Studien 9,15 ergab , dass die angelegte 3'-5'-diagonale Anordnung von Farbstoffen für die nur wenig excitonische Wechselwirkungen die strukturelle Basis bietet zwischen die Farbstoffe und effiziente Energieübertragung.
Die hohe Effizienz der nachgewiesenen Energietransfer ermöglicht eine präzise Fluoreszenzanzeige in in vitro und in - vivo - Experimenten. Dies bietet eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich Sichtbarmachung von DNA-Hybridisierung in molecular beacons, Bindung von Zielmolekülen in Nukleinsäure basierend Aptamere sowie die Visualisierung der Integrität small interfering RNA (siRNA) in Zellen. Die größte Einschränkung ist die Forderung, die beiden DNA-Stränge zu beschriften. In Zukunft wollen wir unsere Arbeit auf die Entwicklung von zweifach markierten Oligonukleotidsonden trägt beide Farbstoffe in einen Strang zu fokussieren.
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Acknowledgments
Die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), das Graduiertenkolleg GRK 2039 (gefördert von der DFG) und KIT gedankt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I.
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
