Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54121
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology
* These authors contributed equally

Abstract

בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה לסינתזה של 2'-אלקין שונה חומצת deoxyribonucleic (DNA) גדילים בסינתזת שלב מוצק אוטומטית באמצעות כימית phosphoramidite סטנדרטית. Oligonucleotides מסומנים שלאחר סינטטי על ידי שני צבעים cyanine photostable חדשים באמצעות זרז-נחושת-כימיה קליק. הסינתזה של שניהם צבע תורם acceptor מתוארת והיא מבוצעת בשלושה שלבים רצופים. עם DNA כמו הארכיטקטורה שמסביב, הצבעים שני אלה עוברים מעבר אנרגיה כשהם מובאים לתוך בסמיכות ידי כלאה. לכן, חישול של שני גדילי DNA גדילי יחיד הוא מדמיין על ידי שינוי של צבע פלואורסצנטי. שינוי צבע זה מאופיין ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי אבל יכול להיות גם ציין ישירות באמצעות מנורת כף יד אולטרה סגול (UV). הקונספט של הודעת צבע פלואורסצנטי כפולה עושה בדיקות oligonucleotide אלה כלי מעולה עבור הדמיה מולקולרית במיוחד כאשר Pho תארצבעי tostable משמשים. ובכך, photobleaching של בדיקות ההדמיה נמנע, ותהליכים ביולוגיים ניתן לצפות בזמן אמת עבור תקופת זמן ארוכה יותר.

Introduction

הדמיה מולקולרית מייצגת טכניקה בסיסית להבנת תהליכים ביולוגיים בתוך תאי חיים. 1-3 פיתוח בדיקות מבוססות חומצת פלורסנט גרעין עבור יישומים כימיים-ביולוגית כזה הפך לשדה מחקר הרחבה. בדיקות ניאון אלו צריכים לעמוד בכמה דרישות הופכים לכלי שרת מתאים הדמיה תא. ראשית, צבעים מיושם צריך להפגין הקרינה עם תשואות קוונטית גבוהה, משמרות 'גדול סטוקס, והכי חשוב, photostabilities גבוה כדי לאפשר לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo. ושנית, הם צריכים להראות הודעת קרינה אמינה. כרומופור-מרווה-מערכות קונבנציונליות מבוססות על ההודעה של צבע פלואורסצנטי אחת על ידי שינויים פשוטים עוצמות קרינה. 4 גישה זו נושאה את הסיכון של תוצאות שליליות חיוביות או שקר שקר בשל autofluorescence של רכיבים תאיים או יחסי אות לרעש נמוכים בשל מרווה רצוי על ידי com האחרponents. 4

דיווחנו לאחרונה על הרעיון של "רמזור DNA" שמראה readouts צבע פלואורסצנטי הכפול באמצעות שני chromophores שונה. 5-6 התפיסה מבוססת על העברת האנרגיה (ET) מ צבען התורם כדי לצבוע acceptor אשר משנה את הקרינה צבע (ראה איור 1). זה מאפשר הודעה אמינה יותר ובכך מספק כלי רב עצמה עבור בדיקות דימות פלואורסצנטי. תוויות של oligonucleotides עם צבעי ניאון יכול להיות מושגת על ידי שתי גישות שונות. צבעים ניתן לשלב במהלך סינתזת ה- DNA הכימית על שלב מוצק באמצעות אובניים בניין phosphoramidite שונה בהתאם. 7 שיטה זו מוגבלת צבעים כי הם יציבים בתנאי phosphoramidite ו deprotection סטנדרטיים. כחלופה, מתודולוגיות שינוי שלאחר סינתטי הוקמו בכימיה oligonucleotide. הנה, אנחנו מדגימים את הסינתזה של אחד התמונות החדשות שלנושולחן אנרגיה העברת זוגות 8,9 ואת תיוג שלאחר סינתטי של דנ"א באמצעות-זרז נחושת 1,3-cycloaddition בין azides ו alkynes (CuAAC). 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

זהירות: יש להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כמה כימיקלים המשמשים סינתזות אלה הם רעילים ומסרטנים. השתמש כל נוהלי הבטיחות המתאימים הנדרשים בדרך כלל במעבדות כימיה אורגנית, כגון לבוש מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות.

סינתזה 1. של צבעים

הערה: שני הצבעים יכולים להיות מסונתזים על ידי אותם סוגי תגובת איור 2 מציג סקירה של תגובות אלו..

  1. סינתזה של 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-מתיל-1H-indol-3-י.ל) ויניל) pyridin-1-ium יודיד (צבע 1)
    1. סינתזה של 1- (3-iodopropyl) יודיד -4-methylpyridin-1-ium (איור 2 א, שלב א)
      1. ממיסים 466 מ"ג 4-picoline ו 5.91 גרם 1,3-diiodopropane ב 10 מ"ל של אצטוניטריל בבקבוקון אמיץ 20 מ"ל וסוגרים על ידי כובע מחצה.
      2. מחמם עד 85 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT, ולאחר מכן להסיר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד סבובי.
      4. הוסף 20 מ"ל של אתיל אצטט אל מזוט ולטפל התערובת באמבט 120 W קולי במשך 3 דקות.
      5. אסוף את המשקע שנוצר על ידי סינון ולשטוף חמש פעמים עם אתיל אצטט. ייבש את המוצר המוצק תחת N / הוואקום O.
    2. סינתזה של 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium (איור 2 א, צעד ב)
      1. ממיסים 900 מ"ג 1- (3-iodopropyl) יודיד -4-methylpyridin-1-ium ב 12 מ"ל של אצטוניטריל בבקבוקון אמיץ 20 מ"ל, להוסיף 376 מ"ג של אזיד הנתרן, וסוגרים על ידי כובע מחצה.
      2. מחמם עד 85 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT, ולאחר מכן להסיר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי.
      4. הוסף 15 מ"ל של dichloromethane אל שאריות.
      5. סנן ותשאיר המשקע שהתקבל.
      6. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות ריקבוןמאייד האר"י להשיג את המוצר כמו שמן חום.
    3. סינתזה של 1-מתיל-1H-אינדול-3-carbaldehyde (איור 2 א, צעד ג)
      1. תחת גז אינרטי (ארגון), לפזר קרבונט דימתיל 1.45 גרם אינדול-3-carbaldehyde, 1.52 גרם אשלגן פחמתי ו 2.70 גרם dimethylformamide 10 מ"ל מוחלט בתוך 50 מ"ל בבקבוק עגול תחתית מצויד הקבל ריפלוקס.
      2. מערבבים את התערובת ב 130 מעלות צלזיוס למשך 19 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT, ואז לשפוך את התערובת על קרח.
      4. חלץ את השכבה המימית שלוש פעמים עם אתיל אצטט 150 מ"ל.
      5. מערבב את השכבות האורגניות, לשטוף אותם עם מים, לייבש אותם מעל נתרן גופרתי ולהסיר הממס על 50 מעלות צלזיוס בלחץ מופחת באמצעות מאייד רוטרי.
    4. צימוד 1 (3-azidopropyl) -4- (2- (1-מתיל-1H-indol-3-י.ל) ויניל) pyridin-1-ium יודיד (צבע 1) (איור 2 א, בשלב ד)
      1. לעבוד תחת ארגון ותחת הדרת לחות. Dissol-4-Methylpyridin-1-ium ו -48 מ"ג 1-מתיל-1H-אינדול-3-carbaldehyde ve 90 מ"ג 1 (3-azidopropyl) ב 4 מ"ל אתנול 20 מ"ל עגול תחתית הבקבוק מצויד הקבל ריפלוקס.
      2. להוסיף 0.07 מ"ל piperidine וחום עד 80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT.
      4. אסוף את המשקע שהתקבל על ידי סינון ולשטוף שלוש פעמים עם דיאתיל אתר.
      5. להוסיף דיאתיל אתר כדי supernatant לאסוף את המשקע שהתקבל על ידי סינון. לשטוף שלוש פעמים עם דיאתיל אתר.
      6. מערבב את המשקעים.
  2. סינתזה של 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-מתיל-2-פניל-1H-indol-3-י.ל) ויניל) quinolin-1-ium יודיד (צבע 2)
    1. סינתזה של 1- (3-iodopropyl) יודיד -4-methylquinolin-1-ium (תרשים 2B, שלב א)
      1. ממיסים 715 מ"ג 4-methylquinoline ו 5.91 גרם 1,3-diiodopropane ב 10 מ"ל של אצטוניטריל בבקבוקון אמיץ 20 מ"ל וסוגרים על ידי כובע מחצה.
      2. חוֹםעד 85 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT, ולאחר מכן להסיר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי.
      4. הוסף 20 מ"ל של אתיל אצטט את השמן הנותר ולטפל התערובת באמבט 120 W קולי במשך 3 דקות.
      5. אסוף את המשקע שנוצר על ידי סינון ולשטוף חמש פעמים עם אתיל אצטט. ייבש את המוצר המוצק תחת N / הוואקום O.
    2. סינתזה של 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-ium (תרשים 2B, צעד ב)
      1. ממיסים 900 מ"ג 1- (3-iodopropyl) יודיד -4-methylquinolin-1-ium ב 12 מ"ל של אצטוניטריל בבקבוקון אמיץ 20 מ"ל, להוסיף 333 מ"ג של אזיד הנתרן, וסוגרים על ידי כובע מחצה.
      2. מחמם עד 85 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT, ולאחר מכן להסיר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי.
      4. הוסף 15 מ"ל של dichloromethane אל שאריות.
      5. סנן ותשאיר המשקע שהתקבל.
      6. הסר את u ממסnder מופחת לחץ באמצעות מאייד רוטרי להשיג את המוצר כמו שמן חום.
    3. סינתזה של 1-מתיל-2-פניל-1H-אינדול-3-carbaldehyde (תרשים 2B, צעד ג)
      1. תחת גז אינרטי (ארגון), לפזר קרבונט דימתיל 1.45 גרם 2-פניל-1H-אינדול-3-carbaldehyde, 0.996 גרם אשלגן פחמתי ו 1.77 גרם dimethylformamide 10 מ"ל מוחלט בתוך 50 מ"ל בבקבוק עגול תחתית מצויד הקבל ריפלוקס.
      2. מערבבים את התערובת ב 130 מעלות צלזיוס למשך 19 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT, ואז לשפוך את התערובת על קרח.
      4. חלץ את השכבה המימית שלוש פעמים עם אתיל אצטט 150 מ"ל.
      5. מערבב את השכבות האורגניות, לשטוף אותם עם מים, לייבש אותם מעל נתרן גופרתי ולהסיר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד רוטרי.
    4. צימוד 1 (3-azidopropyl) -4- (2- (1-מתיל-2-Phe nyl-1H-indol-3-י.ל) ויניל) quinolin-1-ium יודיד (תרשים 2B, בשלב ד)
      1. עבודה תחת argעל ותחת הדרת לחות. ממיסים 90 מ"ג 1 (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-ium ו -59.7 מ"ג 1-מתיל-2-פניל-1H-אינדול-3-carbaldehyde ב 4 מ"ל אתנול 20 מ"ל עגול תחתית הבקבוק מצויד קבל ריפלוקס.
      2. להוסיף 0.06 מ"ל piperidine וחום עד 80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
      3. אפשר להתקרר RT.
      4. אסוף את המשקע שהתקבל על ידי סינון ולשטוף עם שלוש פעמים דיאתיל אתר.
      5. להוסיף דיאתיל אתר כדי supernatant לאסוף את המשקע שהתקבל על ידי סינון. לשטוף שלוש פעמים עם דיאתיל אתר.
      6. מערבב את המשקעים.

2. סינתזה של גדילי דנ"א

הערה: סינתזה של גדילי דנ"א מתבצעת בשיטת phosphoramidite על שלב מוצק, כפי שתואר על ידי M. Caruthers 11 על סינתיסייזר DNA. תפקודם של סינתיסייזר נבחן לפני ההליך הסינטטי, ריאגנטים מתחדשים אםנחוץ.

  1. Prearrangements
    1. ממיסים את 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite זמינים מסחרית (CU) ב 1.2 מ"ל של diluent amidite (אצטוניטריל יבש במיוחד). זז פתרון בבקבוקון בקבוקון סינתיסייזר בורג לתוך סינתיסייזר.
    2. בצע "בדיקת דליפה" (על פי הוראות היצרן) כדי לוודא ששום דליפת גז ארגון קיימת. אם את "מבחן דליפה" נכשל, לדפוק בבקבוקון יותר בחוזקה.
    3. פתרון ממשלת המ"ק ידי מילוי הצינור המתחבר לתא סינתזת שלב המוצק.
    4. לשטוף את כל הקווים עם אצטוניטריל.
  2. סינתזה של גדילי דנ"א
    1. השתמש מחשב המחובר להיכנס רצף ה- DNA שיטת צימוד, ביצוע ההנחיות מן הפרוטוקול של היצרן. צעד הצימוד של אבן בניין CU לוקח 168 שניות עם 7 פולסים (דופק בכל 16 μl) לעומת 40 שניות עם 7 פולסים עבור קונבנציונליphosphoramidite כאבני בניין.
    2. הר את העמודה שמכילה את CPG (זכוכית נקבובית מבוקרת) כשלב מוצק כי הוא שונה עם 1 μmol של הבסיס הראשון (סינתזה של DNA מתבצעת מן 3 'ל 5') לתוך סינתיסייזר.
    3. התחל את הסינתזה על סינתיסייזר DNA 11.
  3. בדיקות של גדילי דנ"א מסונתזים
    1. יבש את העמודות עם גדילי דנ"א מסונתז תחת N / ואקום O.
    2. השתמש מלקחיים כדי לפתוח את הטור ולשחרר את CPG לתוך בקבוקון תגובה. הוסף 700 μl של פתרון אמוניה מימית מרוכזת deprotect oligonucleotide ולשחרר את גדיל ה- DNA של CPG.
    3. סגור את הבקבוקון ולהחיל מכסה אבטחה על כלי התגובה כדי למנוע ממנה להתפקע, חום עד 50 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
    4. הסר אמוניה על ידי צנטריפוגה בלחץ מופחת (100 mbar) על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. התחל סינון מ CPG: כלי צנטריפוגה ב 11,000 XG FOr 3 דקות. קח supernatant ולהעביר אותו לתוך מכשיר צנטריפוגלי עם גודל נקבובי של 0.45 מיקרומטר. צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 4 דקות.
    6. בינתיים להוסיף 300 μl של מים מזוקקים פעמיים אל CPG, מערבולת עבור 20 שניות ו צנטריפוגות ב 11,000 XG במשך 3 דקות. מעבירים את supernatant לתוך המכשיר צנטריפוגות צנטריפוגלי XG ב 1000 למשך 4 דקות. חזור על נוהל זה כביסה פעמיים.
    7. הסר את המים מן תמיסות מימיות המשולבות על ידי centrifuging ב -0.1 mbar ו -25 ° CO / N.

3. "בעת לחיצה על" נוהל

  1. הוסף 50 μl מים מזוקקים כפול, 25 μl של פתרון ascorbate נתרן (0.4 M במים), 34 μl טריס - [(1-בנזיל-1H-1,2,3-triazol-4-י.ל.) מתיל] אמין (0.1 M ב DMSO / tBuOH 3: 1), 114 μl של אזיד (0.01 M ב DMSO / tBuOH 3: 1) ו -17 μl של tetrakis (אצטוניטריל) נחושת (I) פתרון hexafluorophosphate (0.1 M ב DMSO / tBuOH 3: 1) אל דגימת DNA אלקין-modified lyophilized. דגירת המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
  2. מצננים RT.
  3. להוסיף 150 μl Na 2 EDTA (0.05 מ 'במים) ו -450 נתרן אצטט μl (0.3 M במים) אל דגימת DNA והעברת צינור 10 מ"ל.
  4. הוסף 10 מ"ל אתנול (100%) ולשמור על -32 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  5. צנטריפוגה כלי במשך 15 דקות XG ב 1000 ולהסיר supernatant.
  6. DNA-גלולה לשטוף עם אתנול קר 2 מ"ל (80%).
  7. גלולה יבשה בלחץ מופחת.

4. טיהור HPLC

הערה: לפני הפרדת גדילי דנ"א לוודא כי HPLC פועל כהלכה, מספיק ממס זמין והטור נקי. לשטוף טור עם ריכוז התחלתי של חיץ / אצטוניטריל.

  1. ממיסים את ה- DNA גלולה גולמי 250 μl של מים מזוקקים שבעתיים ולהעביר בקבוקון HPLC.
  2. התחל לרוץ HPLC של 45 דק 'עם שיפוע של אצטוניטריל 0% עד 15% של אצטוניטריל עבור צבע 1 ו gradi אף אוזן גרון של אצטוניטריל 0% ל -17% של אצטוניטריל עבור לצבוע 2. צג בטווח ידי סימון 260 ננומטר (קליטה דנ"א) 459 ננומטר (צבע 1) או 542 ננומטר (צבע 2). אסוף אותם שברי מראי קליטה בערוצי הגל השניים.
  3. בדקו את השברים שנאספו עבור המסה התקינה ידי יינון desorption הליזר סייע מטריקס (MALDI) ספקטרומטריית מסה באמצעות מטריצה ​​המורכבת של חומצת 3-hydroxypicolinic (3HPA) ו diammoniumhydrogencitrate.
    1. הכן את מטריקס על ידי ערבוב 900 μl של פתרון 3-HPA הרווי 1: 1-תערובת של אצטוניטריל ומים עם 100 μl של פתרון diammoniumhydrogencitrate (100 גר '/ ל) במים.
    2. פיפטה 1-2 μl של החללית DNA על היעד ולתת לו להתייבש באוויר.
    3. להוסיף 0.2 μl של מטריקס 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate המדגם ומערבבים עד שהוא מתגבש.
    4. בצע ספקטרומטריית מסה MALDI.
    5. אם תשלב אותן שברי HPLC כי תערוכת המסה התקינה.
_title "> 5. קביעת ריכוז

הערה: ריכוז נקבע על ידי מדידת ספיגת ב 260 ננומטר באמצעות UV / Vis ספקטרופוטומטר, בהתבסס על מקדמי הכחדה (ε 260) של הבסיסים בדנ"א ואת צבען.

  1. ממיסים את ה- DNA 100 - 200 μl מזוקקים שבעתיים מים.
  2. החל 1 μl של פתרון ה- DNA על UV / Vis ספקטרופוטומטר.
  3. מדוד את הספיגה ב 260 ננומטר. חזור שלוש פעמים.
  4. קח את הערך הממוצע כדי לחשב את הריכוז של הפתרון. לצורך חישוב מקדמי הכחדה, השתמש ε 260nm של ארבעת הבסיסים טבעי 12 ואת 260nm ε של Cu אבן הבניין נרכש (נחשב uridine טבעי) 12 להשיג את 260nm ε של גדיל DNA כולו. לקבלת צבע 1, השימוש ε 260nm = 10,200 L * mol -1 * -1 ס"מ ועבור צבע 2, השימוש ε 260nm = 13,100 L * mol <sup> -1 * -1 ס"מ. חשב את הריכוז של הפתרון הבא החוק "למברט-בירס מבוסס על מקדמי הכחדה absorbances נמדד. 13

לדוגמא 6. הכנה ספקטרוסקופיה

  1. הכנת דגימות גדיל בודד
    1. הכן בנפרד 1 מ"ל של 2.5 מיקרומטר פתרונות של כל אחת DNA1 משונות DNA2 ב 200 מ"מ NaCl, 50 מ"מ תנומה אני חיץ, pH = 7.
  2. הכנת דגימות גדיל כפולות
    1. הכן 1 מ"ל של תמיסה המכילה 2.5 מיקרומטר של DNA1 ו -2.5 מיקרומטר של DNA2 ב 200 מ"מ NaCl, 50 מ"מ תנומה אני חיץ, pH = 7 בתוך כלי התגובה.
    2. אבטח את המכסה עם כובע בטיחות חום עד 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז לכבות חימום ולאפשר להתקרר כדי RT O / N.
  3. ספקטרוסקופיה הקליטה
    הערה: כדי לקבוע את אורך גל העירור עבור מפרט הקרינהספקטרום הקליטה troscopy נרשם.
    1. מדידות גדיל יחידות
      1. הקלטת מדידה ריקה המכילה רק 200 המ"מ NaCl, 50 מ"מ תנומה אני חיץ, pH = 7.
      2. מעביר את הפתרון המוכן של DNA1 לתוך קובט זכוכית קוורץ 1 סנטימטר ולהקליט את הקליטה. תקן את המדידה מול הנתונים הריקים. לקבוע את הערך המרבי של ספיגת צבע.
      3. חזור על הפעולה עבור DNA2.
  4. ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי
    1. מדידות גדיל יחידות
      1. הקלטת מדידה ריקה המכילה רק 200 המ"מ NaCl, 50 מ"מ תנומה אני חיץ, pH = 7; באמצעות גל עירור של צבע 1.
      2. מעבירים את הפתרון DNA1 לתוך קובט זכוכית קוורץ 1 ס"מ.
      3. רשום את ספקטרום הקרינה.
    2. מדידת גדיל זוגית
      1. מעביר את פתרון הגדיל הכפול לתוך קובט זכוכית קוורץ. רשום את ספקטרום הקרינה באמצעות גל עירור של צבע 1.
  5. ניסויים ויזואליזציה
    זהירות: נאות להגנת העיניים צריך להיות משוחק כדי למנוע נזק UV לעיניים!
    1. כדי להשיג הבנה טובה יותר של מה הספקטרום רשם מראה, מקרין את cuvettes עם UV-מנורות כף יד (איור 5). שים לב לשינוי בצבע קרינת מהסינגל ל- DNA גדילים הכפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ספקטרום קליטת הקרינה של גדילי הדנ"א היחיד וכפול נרשם כפי שמוצג באיור 4.

ספקטרום הקליטה רשם (איור 4 מימין) מקסימום λ המקסימום קליט ​​להראות בבית 465 ננומטר עבור DNA1 חד גדילים (צבע 1) ו 546 ננומטר עבור DNA2 חד גדילים (צבע 2). DNA1_2 annealed (צבע 1 & צבע 2) מראה מקסימום הוא 469 ננומטר 567 ננומטר. שניהם המקסימום הקליט להראות שינוי bathochromic, 4 ננומטר עבור צבע 1 ו -21 ננומטר עבור לצבוע 2. השינויים ספקטרוסקופיות הקטנים האלה הם התוצאה של אינטראקציות excitonic בין הצבעים בתוך ארכיטקטורת DNA פעמי סליל.

ספקטרום הקרינה המתאים (איור 4 משמאל) מקסימום התערוכה λ מקסימום, ב 537 ננומטר עבור DNA1 חד גדילי (צבע 1, עירור ב 435 ננומטר), ב 607 ננומטר עבור יחידDNA2 -stranded (צבע 2, עירור ב 535 ננומטר) ועל 615 ננומטר עבור DNA1_2 annealed (צבע 1 & לצבוע 2, עירור ב 435 ננומטר). DNA1_2 תערוכות בלעדית מקסימלית הפליטה לצבוע 2 למרות צבען 1 מתרגש סלקטיבי אשר מעיד כי העברת האנרגיה מתרחשת ביעילות לצבוע 1 לצבוע 2. זה נותן יחס ניגודיות פליטת 01:57.

ההבדל בין גדיל יחיד וכפול ברור על ידי השוואת צבע הפליטה קובט במהלך עירור עם UV-מנורה רגילה כפי שמוצג באיור 5.

איור 1
מושג בסיסי באיור 1. של מעבר אנרגיה בדנ"א. גדיל DNA השונה התורם (הירוק) מראה קרינה ב 535 ננומטר על קרינה ב 435 ננומטר. אם הוא הכלאה עם הגדיל הנגדי שונה acceptor (אדום) שנתי ה הגדיל הכפולה הנובעhows הקרינה האדומה רק של צבע acceptor ב 610 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. סינתזה סקירה של צבע 1 וצבע 2. סינתזה של שני צבעים cyanine 1 (א) ו- 2 (ב) מתבצעת בשלושה שלבים רצופים. 9 (א)) 1,3-diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° C, 16 שעות, 94%; ב) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 שעות, 87%; ג) K 2 CO 3, קרבונט דימתיל, DMF, 130 ° C, 19 שעות, 89%; ד) piperidine, EtOH, 80 ° C, 4 שעות, 80%. (ב) א) 1,3-diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° C, 16 שעות, 49%; ב) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 שעות, 93%; גK) 2 CO 3, קרבונט דימתיל, DMF, 130 ° C, 19 שעות, 98%; ד) piperidine, EtOH, 80 ° C, 4 שעות, 44%. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
מבנה איור 3. של בלוק CU-בניין, צבעים 1 ו -2 רצפים של DNA1 ו DNA2. צבעים 1 ו -2 צמודות עמדת 2 של ריבוז ידי מקשר triazole בתוך רצפים נתונה DNA1 ו DNA2. 9 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. Fluorescence של גדילי DNA גדילי יחיד וכפול (משמאל) וספיגה של גדילי DNA גדילי יחיד וכפול (מימין). ספקטרום פליטה של DNA1 (שחור) מתרגש 464 ננומטר, DNA2 (אדום), מתרגש 535 ננומטר 435 ננומטר (ורוד ), ו היברידי DNA1_DNA2 (כחול), נרגש 435 ננומטר מוצגים. ספקטרה הקליטה של DNA1 התקוע היחיד (שחורה), DNA2 (אדום), ואת DNA1_DNA2 הגדיל הכפול ההכלאה (הכחולה) מוצגת על הצג בצד ימין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
צבע פליטת איור 5. של גדילי הדנ"א האחד עם צבע תורם (משמאל) ו- DNA גדילים כפול עם תורם לצבוע acceptor (מימין) במהלך עירור על ידי מנורת UV. הדימוי של קובט המכיל את DNA1 התקוע היחיד (LEFצד t) מראה פלואורסצנטי ירוק בהיר, ואת התמונה של DNA1_DNA2 גדילים הכפול (צד ימין) מראה קרינה אדומה במהלך עירור על ידי UV-מנורת כף יד ב 366 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מראה את הנוהל המלא לתייג DNA שלאחר סינטטי באמצעות CuAAC ידי צבעי ניאון-modified יזידו. זה כולל את הסינתזה של צבעים ואת DNA שונה-אלקין וכן הליך התיוג.

הסינתזה של צבעים כדלקמן ארבעה שלבים. כל המוצרים ניתן להשיג על ידי משקעים פשוטים למדי בשל המטען החיובי שלהם ולא כרומטוגרפיה עמודת זמן רב נדרשה. המבוא של פונקציות תזיד לפני מדרגות הצימוד המרכזיות מקצר את הסינתזות של הצבעים ארבעה במקום חמישה צעדי תגובה רצופים. היישום של 1,3-diiodopropane במקום 3-iodopropanol עבור שלב אלקילציה, התגובה האפלה לבין תגובות פינקלשטיין הבאות כדי להמיר את הפונקציה הידרוקסיל לתוך פונקציות iodo היה נמנע. שינויים אלה בהשוואה לנהלים שפורסמו מאפשרים לנו לסנתז את הצבעים בקשקשים גדולים ולפרקי זמן קצר יותר.

class = "jove_content"> הצבעים להחיל תערוכת photostability מעולה אבל לא היציבות ההכרחית במהלך סינתזת ה- DNA מוצק שלב ו בדיקות. לפיכך, אסטרטגית התיוג שלאחר הסינתטי נבחרה. לחלופין, תיוג עם צבעים יקרים כאלה במהלך סינתזת ה- DNA מייצג תנאי צימוד deprotection אולטרה-קלים (למשל, deprotection עם אשלגן פחם). זה מייצג אלטרנטיבה יקרה יותר באופן משמעותי ודורש את הסינתזה של phosphoramidites צבען השונה המתאים כאבני בניין DNA או תיוג על התמיכה המוצקה (על-חרוז).

DNA1 מסומן על ידי צבע 1, לצבוע התורם, DNA2 ידי לצבוע 2, לצבוע acceptor. כאשר DNA1 ו DNA2 הם annealed שני צבעים להיכנס בסמיכות. מעבר אנרגיה יעילה הוא ציין כאשר צבען 1 הוא נרגש. בעיקרון, אינטראקצית excitonic בין צבעי שניהם עלולה להפריע העברת אנרגיה יעילה מאז תהליך הדרישות המאוחר הזוגי ולרגשד לצבוע 1 וצבע זוגי 2. עירור של הצבעים בשילוב ייזמו מסלולי photophysical שונים. 14 המחקרים הקודמים שלנו 9,15 חשפו כי ההסדר 3'-5'-האלכסוני היישומית של צבעים מספק את הבסיס המבני עבור אינטראקציות excitonic קטנות ביניהם הצבעים והעברת אנרגיה יעילה.

היעילות הגבוהה של העברת האנרגיה הפגינה מאפשרת הודעת קרינה מדויקת במבחנה בניסויי vivo. זו מציעה מגוון רחב של יישומים, כולל ההדמיה של כלת דנ"א משואות מולקולריות, מחייב של מולקולות מטרת aptamers מבוסס חומצות גרעין כמו גם ההדמיה של שלמות RNA התערבות הקטנה (siRNA) בתוך תאים. המגבלה העיקרית היא הדרישה לתייג הוא גדילי דנ"א. בעתיד אנו שואפים להתמקד בעבודה שלנו על התפתחות בדיקות oligonucleotide שכותרתו כפליים נושאת שני הצבעים ב גדיל אחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

תמיכה כספית על ידי (DFG, ווה 1386 / 17-1), את GRK קבוצת הדרכת המחקר 2039 (ממומן על ידי DFG) והערכה היא הודתה בהכרת תודה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
synthesis
4-Picoline Sigma Aldrich 239615
1,3-Diiodopropane Sigma Aldrich 238414
Acetonitrile Fisher Scientific 10660131 HPLC grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10456870 technical grade
Sodium azide Sigma Aldrich 71290 p.a. grade
Dichloromethane Fisher Scientific 10626642 technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98% ABCR AB112969
Potassium carbonate, 99+% Acros 424081000
dimethylcarbonate Sigma Aldrich 517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve Acros 348435000
Sodium sulfate Bernd Kraft 12623.46
Ethanol, 99.5% Acros 397690010
Piperidine, 99% Acros 147181000
Diethylether Fisher Scientific 10407830 technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% ABCR AB125050
4-Methylquinoline ABCR AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer Applied Biosystems  -
DMT-dA(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich A111081
DMT-dT Phosphoramidite Sigma Aldrich T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite Sigma Aldrich G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma Aldrich L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis Sigma Aldrich L010400
Cap A Sigma Aldrich L840000
Cap B Sigma Aldrich L850000
CPG dT Column 1.0 µmole Proligo Reagents T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole Proligo Reagents G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents C461010
ammonia (aqueous solution)  Fluka Analytical 318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm Pall ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) Sigma Aldrich 75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite Chem Genes ANP-7754
workup
vacuum concentrator Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate Sigma Aldrich 346276
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich A7631
EDTA disodium salt Sigma Aldrich E5134
TBTA-ligand  -  - synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer Bruker Daltonics
LC-318 C18 column Supelcosil via Sigma Aldrich 58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio Varian
Fluoromax-3 fluorimeter Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 113 oligonucleotides העברת אנרגיה קרינה לחץ-כימיה צבעים photostable
סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arndt, S., Walter, H. K.,… More

Arndt, S., Walter, H. K., Wagenknecht, H. A. Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes. J. Vis. Exp. (113), e54121, doi:10.3791/54121 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter