VACUSIP, une méthode Inex améliorée pour<em> In Situ</em> Mesure des particules et composés dissous transformés par suspensivores actifs

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Suspensivores benthiques jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement des écosystèmes marins ^1. En filtrant grands volumes d'eau ^2,3, ils enlèvent et excrètent particules (plancton et détritus) et des composés dissous ¹ (et les références qui y sont) et sont un important agent de benthique-pélagique couplage ^4,5 et cycle des éléments nutritifs ^6,7. La mesure précise les particules et les composés dissous enlevés et excrétés par suspensivores benthiques (tels que les éponges, les ascidies, les polychètes et bivalves) est fondamentale pour comprendre leur physiologie, le métabolisme et l'écologie alimentaire. Ensemble avec le pompage de mesures de vitesse, il permet également une quantification des flux d'éléments nutritifs médiées par ces organismes et leur impact écologique sur la qualité de l'eau ainsi que sur les processus à l'échelle de l'écosystème.

Le choix de la méthode appropriée de mesure de retrait et les taux de production de particules et de com dissouslivres par suspension filtreurs est cruciale pour obtenir des données fiables concernant leur activité d'alimentation ^8. Comme l'a souligné Riisgård et d'autres, les résultats inappropriés méthodes de polarisation, fausser les conditions expérimentales, produire des estimations erronées de l'ingestion et l'excrétion de certaines substances, et peut conduire à une quantification erronée des flux de nutriments transformés par ces organismes.

Les deux méthodes les plus fréquemment employées pour mesurer les particules et les flux de nutriments dissous dans filtreurs impliquer soit incubation (techniques indirectes) ou la collecte simultanée de la température ambiante et de l'eau exhalé (techniques directes). Techniques d'incubation reposent sur ​​la mesure de la vitesse de variation de la concentration de particules et d' éléments nutritifs dissous dans de l'eau mis à incuber, et l' estimation des taux de production ou de retrait par rapport aux contrôles adéquats ^8. Cependant, enfermant un organisme dans une chambre d'incubation peut modifier sa feeding et le pompage de comportement en raison de changements dans le régime d'écoulement naturel, en raison d'une baisse de l'oxygène et / ou de la concentration de la nourriture, ou en raison de l' accumulation de composés d'excrétion dans le ^7,9 de l' eau d'incubation (et les références qui y sont). En plus des effets de confinement et de l' approvisionnement en eau modifié, un biais majeur des techniques d'incubation découle des effets re-filtration (voir par exemple ^10). Bien que certains de ces problèmes méthodologiques ont été surmontés en utilisant le bon volume et la forme de la cuve d'incubation ¹¹ ou avec l'introduction d'un système cloche recirculation in situ ^12, cette technique sous – estime souvent retrait et les taux de production. Quantifiant le métabolisme des composés dissous tels que l' azote organique dissous (DON) et du carbone (COD) ou de nutriments inorganiques, est avérée être particulièrement sujettes à des biais causés par des techniques d'incubation ^13.

À la fin des années 60 et au début des années 70, Henry Reiswig^9,14,15 pionnier de l'application de techniques directes pour quantifier l' élimination des particules par des éponges géantes des Caraïbes, en échantillonnant séparément l'eau inhalée et exhalée par les organismes in situ. En raison de la difficulté d'appliquer la technique de Reiswig sur les petits suspensivores et dans des conditions sous – marines les plus difficiles, la majeure partie de la recherche dans ce domaine a été limité au laboratoire (in vitro) employant principalement des techniques d'incubation indirectes ^16. Yahel et ses collègues réaménagées Reiswig de technique directe in situ pour travailler dans des conditions plus petite échelle. Leur méthode, appelée Inex ^16, est basée sur l' échantillonnage sous – marine simultanée de l'eau par inhalation (In) et exhalé (Ex) par des organismes non perturbées. La concentration différente d'une substance (par exemple des bactéries) entre une paire d'échantillons (iNEX) fournit une mesure de la rétention (ou la production) de cette substance par l'animal. La technique Inex emploie tubes ouvertes etrepose sur le jet excurrente produit par l'activité de pompage de l'organisme étudié pour remplacer passivement l'eau ambiante dans le tube collecteur. Alors que Yahel et ses collègues ont appliqué avec succès cette technique dans l'étude de plus de 15 suspension différents alimenteurs taxa (par exemple, ^17), la méthode est limitée par le niveau élevé de la pratique et l' expérience requises, par la taille minuscule de certains orifices de exhalant, et par les conditions de mer.

Pour surmonter ces obstacles, nous avons développé une technique alternative basée sur l'aspiration contrôlée de l'eau prélevée à travers des tubes minute (diamètre extérieur <1,6 mm). Notre objectif était de créer un dispositif simple, fiable et peu coûteux qui permettrait propre et contrôlée dans l' échantillonnage de l' eau in situ à partir d' un point très précis, tels que l'orifice exhalant des suspensivores benthiques. Pour être efficace, la méthode doit être non intrusive afin de ne pas affecter le régime d'écoulement ambiante ou modifier le behavior des micro-organismes étudiés. Le dispositif présenté ici est appelé VACUSIP. Il est une simplification du système SIP développé par Yahel et al. (2007) ¹⁸ pour l' échantillonnage de point de base-ROV dans la mer profonde. Le VACUSIP est beaucoup moins cher que le SIP original et il a été adapté pour le travail à base de SCAPHANDRE. Le système a été conçu selon les principes présentés et testés par Wright et Stephens (1978) ¹⁹ et Møhlenberg et Riisgård (1978) ²⁰ pour les paramètres de laboratoire.

Bien que le système VACUSIP a été conçu pour des études in situ du métabolisme des suspensivores benthiques, il peut également être utilisé pour des études de laboratoire et où, un échantillon d'eau de source ponctuelle contrôlée et propre est nécessaire. Le système est particulièrement utile lorsque l' intégration sur des périodes prolongées (min-heures) ou en filtrations in situ sont nécessaires. Le VACUSIP a été utilisé avec succès au laboratoire Yahel depuis 2011, et a égalementété employé dans deux études récentes de flux de nutriments médiées par espèces d'éponges des Caraïbes et de la Méditerranée ²¹ (Morganti et al. soumis).

L'utilisation des échantillonneurs spécifiques, la durée d'échantillonnage prolongée, et les conditions sur le terrain, dans lequel VACUSIP est appliqué, entraîne certains écarts par rapport à des protocoles standards océanographiques pour la collecte, le filtrage et le stockage d'échantillons pour les analytes sensibles. Pour réduire le risque de contamination par le système VACUSIP ou le risque de modification de l'eau prélevée par l' activité bactérienne après la collecte, nous avons testé différentes dans les procédures de filtration et de stockage in situ. Dispositifs différents de filtrage, des navires de collecte, et les procédures de stockage ont été examinés afin de parvenir à la technique la plus appropriée pour l'analyse des inorganique dissous (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ et organique (DOC + DON) composés et ultra-plancton (<1081; m) et organique particulaire (POC + PON) échantillonnage. Afin de réduire davantage le risque de contamination, en particulier dans des conditions de terrain, le nombre d'étapes de manipulation est réduite au strict minimum. Le format visuel dans lequel la méthode est présentée est orientée pour faciliter la reproductibilité et de réduire le temps nécessaire pour appliquer efficacement la technique.

Présentation du système

À échantillonner dans l' eau in situ pompée à partir alimentateur suspension avec des orifices exhalants aussi petits que 2 mm, l'activité de pompage de chaque échantillon est d' abord visualisée en libérant filtré fluorescéine teint l' eau de mer à proximité de l'orifice (s) de substances volatiles et en observant son écoulement depuis l'ouverture de excurrente ¹⁶ (voir aussi la figure 2B en ^18). L'eau inspiré et expiré par l'échantillon d'étude (incurrent et exhalant) sont ensuite échantillonnés en même temps que l'utilisation d'une paire de tubes minuscules installées sur manipulateur sur mesure ou sur deux de «arms "d'un trépied portable souple envers (Figure 1 et complémentaire vidéo 1). L'eau est inhalé par l'organisme d'étude est recueilli en positionnant soigneusement l'extrémité proximale d'un tube à l' intérieur ou à proximité de l'ouverture inhalant de l'organisme d'étude. Un identique tube est ensuite placé à l' intérieur de l'orifice exhalant. Cette opération nécessite bien soin d'éviter tout contact ou de perturbation de l'animal, par exemple, par la remise en suspension des sédiments. pour commencer l'échantillonnage, un plongeur perce une cloison dans le récipient collecteur avec une aiguille de seringue attachée à la l'extrémité distale de chaque tube, permettant à la pression externe de l'eau pour forcer l'eau prélevée dans le récipient à travers le tube d'échantillonnage. l'aspiration est initiée par le vide créé au préalable dans le flacon et par la différence de pression entre l'eau externe et le récipient d'échantillon évacué .

Afin d'assurer une collecte d'eau propre exhalé et d'éviter l'aspiration accidentelle de ambieau ent ^16, le taux d'échantillonnage de l' eau doit être maintenue à un taux significativement plus faible (<10%) que le débit exhalant. Le débit d'aspiration est commandé par la longueur du tube et son diamètre interne (ID). Le petit diamètre interne assure également un volume mort négligeable (<200 pi par mètre de tube). Échantillonnage sur des périodes prolongées (minutes à quelques heures) permet d'intégrer la microrépartition inhérente à la plupart des substances d'intérêt. Pour veiller à ce que les échantillons soient correctement conservés dans des séances d'échantillonnage sous – marines prolongées, ainsi que pour le transport au laboratoire, une filtration in situ est recommandé pour les analytes sensibles. La sélection des navires d'échantillonnage, l'assemblage de filtration, et les tubes sont dictées par les organismes d'étude et la question de recherche spécifique. Le protocole décrit ci – dessous suppose que le profil métabolique complet est d'intérêt (pour un aperçu voir la figure 2). Cependant, la nature modulaire du protocole permet fou une modification facile à adapter les régimes plus simples, voire très différents échantillonnage. Pour un profil métabolique complet, le protocole d'échantillonnage doit comprendre les étapes suivantes: (1) Visualisation de l'écoulement; (2) L'échantillonnage ultra-plancton alimentation (plancton <10 um); (3) Échantillonnage nutriments inorganiques absorption et de l'excrétion (en utilisant les filtres en ligne); (4) Échantillonnage dissous l'absorption biologique et de l'excrétion (en utilisant des filtres en ligne); (5) l'alimentation des particules et de l'excrétion (en utilisant les filtres en ligne); (6) Répétez l'étape 2 (ultra-plancton alimentation en contrôle de la qualité); (7) Visualisation de l'écoulement.

Quand logistiquement possible, il est recommandé que les mesures de profils métaboliques sont combinés avec des taux de pompage (par exemple, le procédé de teinture vitesse avant, en ^16), ainsi que des mesures de respiration. Ces mesures sont plus prises au début et à la fin de la session d'échantillonnage. Pour la mesure de la respiration, optodes sous-marines ou des micro-électrodes sont préférables.

Protocol

1. Etapes préparatoires et de nettoyage Procédures Solution de nettoyage Porter un équipement de protection, une blouse de laboratoire, et des gants en tout temps. Effectuer ces étapes préparatoires dans un espace propre exempt de poussière et de fumée. Préparer une solution chlorhydrique 5-10% d'acide (HCl) avec des produits frais, de haute qualité, de l'eau distillée deux fois. Préparer un mélange de 5% de base très soluble de la solu…

Representative Results

Optimisation des méthodes de collecte d'eau de mer Sélection des flacons de collection et de la procédure de nettoyage récipients collecteurs VACUSIP compatibles doivent avoir une cloison qui permet un échantillonnage à être engagée par perçage par une aiguille de seringue. Ils doivent…

Discussion

Les étapes préparatoires

Flacons de collection pour DOM et à l' analyse des éléments nutritifs

Comme les navires collecteurs peuvent interagir avec des micro-constituants dissous et les parois de l' échantillonneur peut être un substrat pour la croissance des bactéries ^30-34, différents flacons pour DOM et la collecte des éléments nutritifs…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181