VacuSIP, שיטת INEX משופרת<em> באתרו</em> מדידה של חלקיקים מומס תרכובות מעובד על ידי האכלת השעית Active

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

ניזונים ההשעיה benthic לשחק תפקידים חיוניים לתפקוד של מערכות אקולוגיות ימיות ^1. על ידי סינון כמויות גדולות של מים ^2,3, מסלקים ומפרישות חלקיקים (פלנקטון שאריות) ופזרו תרכובות ¹ (והפניות בו) והם סוכן חשוב של צימוד benthic-פלגי ^4,5 ו מזין אופניים ^6,7. מדויק למדידת החלקיקים ותרכובות מומסות מוסר מופרש על ידי האכלת השעית benthic (כגון ספוגים, ascidians, ורב-שעירים, ו צדפות) היא יסוד להבין אקולוגית הפיסיולוגיה, מטבוליזם, ההאכלה שלהם. יחד עם שאיבת מדידות קצב, הוא גם מאפשר כימות של והנתיבים המזינים בתיווך אורגניזמים אלה ההשפעה האקולוגית שלהם על איכות מים וכן על תהליכים בקנה מידה אקולוגית.

בחירת השיטה המתאימה של מדידת שיעורי הסרה וייצור של חלקיקי com מומספאונד על ידי ניזונים מסנן השעיה הוא חיוני להשגת נתונים אמינים בנוגע לפעילות ההאכלה שלהם ^8. כפי שצוין על ידי Riisgård ואחרים, תוצאות הטית מתודולוגיות הולמות, לעוות תנאי ניסוי, לייצר הערכות שגויות של בליעה והפרשה של חומרים מסוימים, ויכול להוביל כימות המוטעית של והנתיבים המזינים מעובד על ידי אורגניזמים אלה.

שתי השיטות הנפוצות ביותר למדוד חלקיקים ונתיבים מזינים מומסים ניזונים מסננים לכלול הן דגירה (טכניקות עקיפות) או אוסף סימולטני של סביבה ומי נשף (טכניקות ישירות). טכניקות דגירה מבוססות על מדידת קצב השינוי בריכוז החלקיקים וחומרים המזינים המומסים במים וטופחו, והערכת קצב ההפקה או הסרה בהשוואה לקבוצת ביקורת נאותה ^8. עם זאת, מצרף אורגניזם בתא דגירה יכול לשנות feedin שלהg ושאיבת התנהגות עקב שינויים במשטר הזרימה הטבעי, בשל ירידת חמצן ו / או בריכוז מזון, או בשל הצטברות של תרכובות הפרשה ב ^7,9 מי דגירה (והפניות בו). בנוסף להשפעות של כליאה ואספקת מים שונה, הטיה גדולה של טכניקות דגירה נובעת תופעות מחדש סינון (ראה למשל ^10). למרות שחלק בעיות מתודולוגיות אלה הוכרעו באמצעות הנפח והצורה התקין של כלי הדגירה ¹¹ או עם כניסתה של מערכת פעמון-צנצנת הסירקולציה המחודשת באתרו ^12, טכניקה זו לעתים קרובות ממעיטה בערך שיעורי הסרה והפקה. כימות מטבוליזם של תרכובות מומסות כגון חנקן אורגני מומס (דון) ופחמן (DOC) או חומרים מזינים אורגניים, הוכיח להיות מועדים במיוחד להטיות נגרמות על ידי טכניקות דגירת ^13.

בשנות ה -60 המאוחרות וה -70 המוקדמות, הנרי Reiswig^9,14,15 חלוץ ביישום של טכניקות ישירות לכמת הסרת חלקיק ידי ספוגי הקאריביים ענקים, על ידי בנפרד דגימת המים השואפים ונושפת ידי האורגניזמים באתרו. בשל הקושי ליישם את הטכניקה של Reiswig על ניזונים השעיה קטנים בתנאים תת מאתגרים יותר, את חלק הארי של מחקר בתחום זה הוגבל במעבדה (in vitro) שימוש בטכניקות דגירה עקיפות בעיקר ^16. יהל ועמיתיו שהותאמו Reiswig של ישיר בטכניקה באתרו לעבוד בתנאים בקנה מידה קטן יותר. שיטתם, כינת INEX ^16, מבוסס על דגימה מתחת למים סימולטני של המים בשאיפה (ב) ונשף (Ex) על ידי אורגניזמים באין מפריע. ריכוז שונה של חומר (למשל, חיידקים) בין זוג דגימות (INEX) מספק מדד של שימור (או ייצור) של החומר הזה על ידי החיה. טכניקת INEX מעסיקה צינורות פתוחיםמסתמך על סילון excurrent המיוצר על ידי פעילות השאיבה של האורגניזם למד כדי להחליף את מי הסביבה פסיבית בצינור האיסוף. בעוד יהל ועמיתיו בהצלחה יישמו טכניקה זו במחקר של מעל 15 השעיה שונה וקינון מינים (למשל, ^17), השיטה מוגבלת על ידי הרמה הגבוהה של עשייה וניסיון הנדרשת, לפי הגודל הזעיר של כמה פתחי excurrent, ועל ידי תנאי ים.

כדי להתגבר על המכשולים הללו, פיתחנו טכניקה חלופית המבוססת על שאיבה מבוקרת של מים שנדגמו דרך צינורות דקות (קוטר חיצוני <1.6 מ"מ). מטרתנו הייתה ליצור מכשיר פשוט, אמין, ולא יקר שיאפשר נקי ומבוקר דגימת מים באתרו מנקודת מבט ספציפי מאוד, כגון נקב excurrent של מתקני האכלת השעית benthic. כדי להיות יעיל, השיטה צריכה להיות בלתי פולשניות כדי לא להשפיע על משטר זרימת הסביבה או לשנות את behavior של היצורים שנחקרו. המכשיר המוצג כאן נקרא VacuSIP. זהו פישוט של מערכת SIP שפותח על ידי יהל et al. (2007) ¹⁸ לדגימה נקודה מבוססת ROV במעמקי הים. VacuSIP הוא הרבה יותר זול מאשר SIP המקורי וזה הותאם לעבודה מבוססת SCUBA. המערכת תוכננה על פי העקרונות המוצגים ונבדקו על ידי רייט סטיבנס (1978) ¹⁹ ו Møhlenberg ו Riisgård (1978) ²⁰ עבור הגדרות במעבדה.

למרות שמערכת VacuSIP תוכנן עבור במחקרים באתרו של חילוף החומרים של מתקני האכלה ההשעיה benthic, זה יכול לשמש גם עבור במחקרי מעבדה ובכל מקום מבוקר ונקי, דגימת מים-מקור הצבע נדרש. המערכת שימושית במיוחד כאשר שילוב לאורך תקופות ממושכות (דקות שעות) או filtrations באתרו נדרש. VacuSIP שימש בהצלחה במעבדה יהל מאז 2011, ויש לו גםהועסק בשני מחקרים אחרונים של ונתיבים מזינים בתיווך מינים ספוגים הקאריביים והים תיכוניים ²¹ (Morganti et al.) שנמסר.

שימוש דוגמים ספציפיים, משך הדגימה הממושך, ותנאי השטח, שבו VacuSIP מוחל, כרוך סטיות כמה מן הפרוטוקולים האוקיינוגרפי תקן לאיסוף, סינון, ואחסון דגימות עבור analytes הרגיש. כדי להפחית את הסיכון של זיהום על ידי מערכת VacuSIP או את הסיכון של שינוי של מים שנדגמו על ידי פעילות חיידקית לאחר איסוף, בדקנו שונים הליכי סינון ואחסון באתרו. התקני סינון שונים, כלי איסוף, ונהלים לאחסון נבחנו על מנת להשיג את הטכניקה המתאימה ביותר לניתוח אורגני המומס (PO ₄ ^3, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ ואורגני (DOC + DON) תרכובות, ואת-פלנקטון אולטרה (<1081; מ ') ו- (POC האורגני חלקיקים + דגימת PON). כדי לצמצם עוד יותר את הסיכון של זיהום, במיוחד בתנאי שדה, את מספר צעדי טיפול צומצם למינימום ההכרחי. הפורמט החזותי, שבו שיטת המוצג מכוון להקל שחזור כדי לצמצם את הזמן הדרוש כדי ליישם את הטכניקה בצורה יעילה.

סקירת מערכת

כדי לדגום במים הנשאבים באתרו מן ניזונים השעיה עם נקבי exhalant קטנים כמו 2 מ"מ, פעילות השאיבה כל דגימה היא מדמיינת ראשונה על ידי שחרור מסונן צבוע והעמסה מי ים ליד פתח נשימתית (הים) והתבוננות זרימתו מ פתח excurrent ¹⁶ (ראה גם איור 2b ב ^18). המים שהיא שואפת ונושפים על ידי דגימת המחקר (incurrent ו excurrent) אז הם שנדגמו בד בבד עם השימוש של זוג צינורות דקות מותקנים על מניפולטור שהותקן או על שתיים "The ARms "של חצובה ניידת גמישה הפוכה (איור 1 משלים וידאו 1). המים שאנו נושמים האורגניזם המחקר נאספו על ידי מיצוב הקצה הפרוקסימלי בקפידה של צינור אחד בתוך או ליד הצמצם נשימתית של האורגניזם המחקר. זהה צינור ממוקם אז בתוך פתח excurrent. פעולה זו דורשת טיפול טוב כדי להימנע ממגע או הפרעה של החיה, למשל, על ידי resuspension משקעים. כדי להתחיל את הדגימה, צוללן מפלח מחצה בתוך כלי איסוף עם מחט מזרק מצורף קצה הדיסטלי של צינור אחד, המאפשרים לחץ החיצוני של המים כדי להוציא את המים שנדגמו לתוך הכלי דרך צינור הדגימה. היניקה היא שיזמה את הריק שנוצר בעבר הצלוחיות ידי פרש לחצים בין המים החיצוניים ואת מכל המדגם פונה .

כדי להבטיח אוסף נקי של מי נשף וכדי למנוע שאיבה בשוגג של Ambiמים אף אוזן גרון ^16, קצב הדגימה מים צריך להיות כל הזמן בקצב נמוך משמעותית (<10%) משיעור זרימת excurrent. שיעור היניקה נשלט על ידי האורך של הצינור וקוטרו הפנימי שלה (ID). הקוטר הפנימי הקטן גם מבטיח נפח מת זניח (<200 μl למטר של צינורות). דגימה לאורך תקופות ממושכות (דקות עד שעות) עושה את זה אפשרי לשלב את מעשה הטלאים הטבועים של רוב החומרים של עניין. כדי להבטיח כי דגימות נשמרות כראוי בפגישות דגימה מתחת למים ממושכות וכן לתחבורה למעבדה, גידול סינון באתרו מומלץ עבור analytes הרגיש. הבחירה של כלי דגימה, הרכבת סינון, צינורות מוכתבים על ידי אורגניזמים מחקר ושאל המחקר הספציפי. הפרוטוקול המתואר להלן מניח כי הפרופיל המטבולי מלא הוא בעל עניין (עבור סקירה ראה איור 2). עם זאת, האופי מודולרי של הפרוטוקול מאפשר fאו שינוי קל להכיל פשוטות או אפילו מאוד תוכניות דגימה שונות. במשך פרופיל המטבולי מלא, פרוטוקול הדגימה צריך לכלול את הצעדים הבאים: (1) הצגת נתוני זרימה; (2) הזנה אולטרה-פלנקטון דגימה (פלנקטון <10 מיקרומטר); (3) דגימה ספיגת חומרים מזינים אורגניים הפרשה (באמצעות מסננים אונליין); (4) דגימה מומסת ספיג והפרשה אורגניות (באמצעות מסננים אונליין); (5) חלקיקי האכלה והפרשה (באמצעות מסננים אונליין); (6) חזור על שלב 2 (האכלה אולטרה-פלנקטון כמו בדיקת איכות); (7) זרימה ויזואליזציה.

כאשר מבחינה לוגיסטית ריאלי, מומלץ כי מדידות הפרופיל המטבולי משולבות עם שאיבת שיעור (למשל, שיטת המהירות מול לצבוע, ב ¹⁶⁾ וכן עם מדידות נשימה. מדידות אלה נלקחות טובים ביותר בתחילה בסוף פגישת הדגימה. למדידת נשימה, optodes מתחת למים או-אלקטרודות מיקרו עדיפים.

Protocol

1. נהלי צעדים וניקיון המכינה תְמִיסָה לנִיקוּי ללבוש ציוד מגן, חלוק מעבדה וכפפות בכל עת. לבצע צעדי ההכנה האלה בחלל נקי ללא אבק ועשן. </li…

Representative Results

אופטימיזציה של שיטות איסוף מי ים מבחר צלוחיות אספן הליך הניקוי VacuSIP תואמים כלי איסוף צריכים מחצה המאפשר דגימה שא?…

Discussion

פעולות הכנה

אספן בקבוקונים עבור DOM וניתוח מזין

מאז כלי אספן עשוי אינטראקציה עם המרכיבים מיקרו מומס והקירות סמפלר עשוי להיות מצע לחיידקים צמיחה ^30-34, בקבוקונים שונ…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181