VacuSIP, un metodo migliorato per Inex<em> In Situ</em> Misura di particolato e sciolto composti elaborati da Alimentatori sospensioni attive

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Alimentatori sospensione bentonici giocano un ruolo essenziale nel funzionamento degli ecosistemi marini ^1. Filtrando grandi volumi di acqua ^2,3, rimuovono e espellono particolato (plancton e detriti) e composti disciolti ¹ (e riferimenti) e sono un importante agente di bentonica-pelagica accoppiamento ^4,5 e il ciclo dei nutrienti ^6,7. Misurare accuratamente la presenza di particelle e composti disciolti rimossi ed escreto dal alimentatori sospensione bentonici (come spugne, ascidie, policheti, e bivalvi) è fondamentale per capire la loro fisiologia, metabolismo, e l'ecologia alimentazione. Insieme con pompaggio misurazione della frequenza, ma consente anche una quantificazione dei flussi di nutrienti mediate da questi organismi e il loro impatto ecologico sulla qualità delle acque, nonché sui processi scala ecosistema.

La scelta del metodo appropriato di misurazione di rimozione e di produzione tassi di particolato e com discioltochili di sospensione filtratori è fondamentale per ottenere dati affidabili relativi alla loro attività di alimentazione ^8. Come sottolineato da Riisgård e altri, non appropriate metodologie di polarizzazione risultati, falsare le condizioni sperimentali, la produzione di stime errate di ingestione ed escrezione di determinate sostanze, e può portare a quantificazione errata dei flussi di nutrienti elaborati da questi organismi.

I due metodi più frequentemente utilizzati per misurare le particelle e flussi di nutrienti disciolti in filtratori coinvolgere sia incubazione (tecniche indirette) o la raccolta simultanea di ambiente e acqua espirata (tecniche dirette). Tecniche di incubazione si basano sulla misura della velocità di variazione della concentrazione di particelle e nutrienti disciolti nell'acqua incubate, e stima dei tassi di produzione o rimozione rispetto ai controlli adeguati ^8. Tuttavia, allegando un organismo in una camera di incubazione può modificare la sua Feeding e pompaggio comportamento a causa di cambiamenti nel regime di flusso naturale, a causa di un calo di ossigeno e / o della concentrazione di cibo, o a causa di accumulo di composti di escrezione del ^7,9 acqua incubazione (e riferimenti). Oltre agli effetti di isolamento e fornitura di acqua modificato, una grande polarizzazione di tecniche di incubazione deriva da effetti ri-filtrazione (vedi ad esempio ^10). Sebbene alcuni di questi problemi metodologici sono stati superati utilizzando il giusto volume e la forma del recipiente di incubazione ¹¹ o con l'introduzione di un sistema di campana ricircolo in situ ^12, questa tecnica spesso sottostima asportazione e di produzione. Quantificare il metabolismo dei composti disciolti quali azoto organico disciolto (DON) e carbonio (DOC) o nutritivi inorganici, ha dimostrato di essere particolarmente inclini a distorsioni causate da tecniche di incubazione ^13.

Alla fine degli anni '60 e primi anni '70, Henry Reiswig^9,14,15 aperto la strada all'applicazione di tecniche dirette per quantificare la rimozione di particelle da giganti spugne caraibiche, campionando separatamente l'acqua inspirato ed espirato dagli organismi in situ. A causa della difficoltà di applicare la tecnica di Reiswig su sospensivori piccole e in condizioni subacquee più impegnative, la maggior parte della ricerca in questo campo è stata limitata al laboratorio (in vitro) impiegando lo più tecniche di incubazione indirette ^16. Yahel e colleghi rimontati Reiswig di diretta in situ tecnica di lavorare in condizioni di minori dimensioni. Il loro metodo, chiamato Inex ^16, si basa sul campionamento simultaneo subacquea dell'acqua per via inalatoria (In) e esalato (Ex) da organismi indisturbati. La diversa concentrazione di una sostanza (ad esempio, batteri) tra una coppia di campioni (INEX) fornisce una misura della ritenzione (o produzione) della sostanza da parte dell'animale. La tecnica Inex impiega tubi aperti esi basa sul jet excurrent prodotte dall'attività di pompaggio dell'organismo studiata per sostituire passivamente all'acqua ambiente nel tubo di raccolta. Mentre Yahel e colleghi hanno applicato con successo questa tecnica per lo studio di oltre 15 sospensione di diversi alimentatori taxa (ad esempio, ^17), il metodo è vincolato per l'elevato livello di pratica e l'esperienza necessarie, dalla dimensione minuscola di alcuni orifizi excurrent, e condizioni del mare.

Per superare questi ostacoli, abbiamo sviluppato una tecnica alternativa basata su aspirazione controllata dell'acqua campionato attraverso tubi minute (diametro esterno <1,6 mm). Il nostro scopo era quello di creare un dispositivo semplice, affidabile ed economico che consenta pulita e controllata di campionamento dell'acqua situ da un punto molto specifico, come l'orifizio excurrent di alimentatori sospensione bentonici. Per essere efficace, il metodo deve essere non-intrusivo in modo da non influenzare il regime di flusso ambiente o modificare il behavior degli organismi studiati. Il dispositivo presentato qui è chiamato VacuSIP. È una semplificazione del sistema SIP sviluppato da Yahel et al. (2007) ¹⁸ per il campionamento punto ROV-based nel mare profondo. Il VacuSIP è notevolmente più conveniente che il SIP originale ed è stato adattato per il lavoro SCUBA-based. Il sistema è stato progettato secondo i principi presentati e testati da Wright e Stephens (1978) ¹⁹ e Møhlenberg e Riisgård (1978) ²⁰ per le impostazioni di laboratorio.

Sebbene il sistema VacuSIP stato progettato per studi situ del metabolismo di alimentatori sospensione bentonici, può essere utilizzato anche per studi di laboratorio e ovunque sia richiesto un campione di acqua da sorgente puntiforme controllata e pulita. Il sistema è particolarmente utile quando è richiesto l'integrazione per periodi prolungati (min-ore) o di filtrazioni situ. Il VacuSIP è stato utilizzato con successo presso il laboratorio Yahel a partire dal 2011, e ha anchestato impiegato in due recenti studi dei flussi di nutrienti mediati da specie di spugne caraibiche e mediterranee ²¹ (Morganti et al. submitted).

L'utilizzo di campionatori specifici, la durata di campionamento prolungato, e le condizioni del campo, in cui si applica VacuSIP, comporta alcune differenze rispetto a protocolli standard di oceanografici per la raccolta, il filtraggio e la conservazione dei campioni per analiti sensibili. Per ridurre il rischio di contaminazione da parte del sistema VacuSIP o il rischio di modificazione dell'acqua campionata dall'attività batterica dopo la raccolta, abbiamo testato varie procedure di filtrazione e stoccaggio situ. Diversi dispositivi di filtraggio, recipienti di raccolta e procedure memorizzazione sono stati esaminati per conseguire la tecnica più adatta per l'analisi dei disciolto inorganico (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ ed organici (DOC + DON) composti, e ultra-plancton (<1081; m) e il particolato organico (POC + campionamento PON). Per ridurre ulteriormente il rischio di contaminazione, in particolare in condizioni di campo, il numero di fasi di manipolazione è stato ridotto al minimo. Il formato visivo in cui è presentato il metodo è orientato per facilitare riproducibilità e per ridurre il tempo necessario per applicare efficacemente la tecnica.

Panoramica del sistema

Per campionare in situ pompata acqua sospensivori con orifizi exhalant piccole 2 mm, l'attività di pompaggio di ciascun campione viene prima visualizzata rilasciando filtrata fluoresceina tinti acqua di mare accanto all'orifizio inalante (s) e osservando il suo flusso dall'apertura excurrent ¹⁶ (vedi anche figura 2B in ^18). L'acqua inalato ed espirato dal campione di studio (incurrent e excurrent) vengono quindi simultaneamente campionati con l'impiego di una coppia di tubi minute installati sul manipolatore fuoriserie o due dei "arms "di un treppiede portatile flessibile capovolta (Figura 1 e complementare Video 1). L'acqua inalata dall'organismo studio viene raccolto posizionando accuratamente l'estremità prossimale di un tubo all'interno o vicino all'apertura inalazione dell'organismo studio. Un identico tubo viene quindi posizionato all'interno dell'orifizio excurrent. Questa operazione richiede cura per evitare il contatto o disturbo dell'animale, per esempio, mediante risospensione dei sedimenti. per iniziare il campionamento, un subacqueo perfora un setto nel recipiente di raccolta con una siringa attaccata alla estremità distale di ciascun tubo, consentendo la pressione dell'acqua esterna di forzare l'acqua campionata nel vaso attraverso il tubo di campionamento. l'aspirazione viene iniziata dal vuoto creato in precedenza nei flaconi e dalla differenza di pressione tra l'acqua esterna e il contenitore del campione evacuato .

Per garantire una raccolta di acqua pulita espirata e per evitare l'aspirazione accidentale di ambiacqua ent ^16, la frequenza di campionamento dell'acqua deve essere mantenuto a un tasso significativamente più basso (<10%) rispetto alla portata excurrent. Il tasso di aspirazione è controllata dalla lunghezza del tubo e il diametro interno (ID). Il piccolo diametro interno garantisce inoltre un volume morto trascurabile (<200 ml per metro di tubo). Campionamento per periodi prolungati (minuti a ore) permette di integrare il patchiness intrinseca della maggior parte delle sostanze di interesse. Per assicurare che i campioni siano adeguatamente conservati in sessioni di campionamento subacqueo prolungati nonché per il trasporto al laboratorio, una in situ filtrazione è raccomandato per analiti sensibili. La selezione di vasi di campionamento, il montaggio di filtraggio, e tubi sono dettate dagli organismi di studio e la domanda di ricerca specifica. Il protocollo descritto di seguito presuppone che un profilo metabolico completo è di interesse (per una panoramica si veda la Figura 2). Tuttavia, la natura modulare del protocollo consente fo facile modifica per accogliere i metodi di campionamento più semplici o anche molto diverse. Per un profilo metabolico completo, il protocollo di campionamento dovrebbe comprendere le seguenti fasi: (1) la visualizzazione di flusso; (2) l'alimentazione di campionamento ultra-plancton (plancton <10 micron); (3) Il campionamento nutrienti inorganici assorbimento e l'escrezione (usando filtri in linea); (4) Campionamento disciolto assorbimento organico e l'escrezione (usando filtri in linea); (5) di alimentazione particolato e l'escrezione (usando filtri in linea); (6) Ripetere il punto 2 (ultra-plancton alimentazione come controllo della qualità); (7) Portata visualizzazione.

Quando logisticamente fattibile, si raccomanda che le misurazioni profilo metabolico sono combinati con pompaggio rate (ad esempio, il metodo a velocità fronte del colorante, in ^16), nonché con le misurazioni respirazione. Queste misure devono essere prese all'inizio e alla fine della sessione di campionamento. Per la misurazione della respirazione, optodes subacquee o micro-elettrodi sono preferibili.

Protocol

1. Operazioni preliminari e per la bonifica Procedure Soluzione detergente Indossare indumenti protettivi, un camice da laboratorio e guanti in ogni momento. Effettuare queste fasi preparatorie in uno spazio pulito privo di polvere e fumo. Preparare una soluzione al 5-10% di acido cloridrico (HCl) con fresco, di alta qualità, acqua bidistillata. Preparare un 5% altamente solubile mix di base della soluzione di tensioattivi anionici e tensioattivi non ionic…

Representative Results

L'ottimizzazione dei metodi di raccolta di acqua di mare Selezione di fiale da collezione e la procedura di pulizia recipienti di raccolta compatibili VacuSIP dovrebbero avere un setto che permette di campionamento venga avviata forando con una siringa. Essi dovrebbero resistere alla pressione sottomarina elevata (2-3 b…

Discussion

operazioni preliminari

Fiale Collector per Dom e analisi dei nutrienti

Dal momento che i vasi da collezione possono interagire con micro-costituenti disciolti e le pareti campionatore può essere un substrato per i batteri crescita ^30-34, sono stati testati diversi fiale per DOM e la raccolta dei nutrienti. Borosilicato non è raccomandato per la quantificazione silice ^33,35, dal momento che le bott…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181