VacuSIP, un método mejorado para InEx<em> In Situ</em> Medición de las partículas y compuestos disueltos procesada por Alimentadores Active Suspension

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Suspensívoros bentónicos juegan un papel esencial en el funcionamiento de los ecosistemas marinos ^1. Al filtrar grandes volúmenes de agua ^2,3, se quitan y excretan partículas (plancton y detritus) y los compuestos disueltos ¹ (y las referencias en él) y son un importante agente de acoplamiento pelágico-bentónico ^4,5 y ^6,7 ciclo de nutrientes. La medición precisa de las partículas y compuestos disueltos retirados y excretados por suspensívoros bentónicos (tales como esponjas, ascidias, poliquetos y bivalvos) es fundamental para entender su fisiología, metabolismo, y la ecología de la alimentación. Junto con el bombeo de medidas de la velocidad, sino que también permite una cuantificación de los flujos de nutrientes mediadas por estos organismos y su impacto ecológico sobre la calidad del agua, así como en los procesos a escala del ecosistema.

Elegir el método adecuado para la medición de las tasas de extracción y producción de partículas y disuelto comlibras por organismos filtradores suspensión es crucial para la obtención de datos fiables en cuanto a su actividad de alimentación ^8. Como ha señalado Riisgård y otros, inapropiadas resultados metodologías de polarización, distorsionar las condiciones experimentales, producir estimaciones incorrectas de la ingestión y excreción de ciertas sustancias, y puede conducir a la cuantificación errónea de los flujos de nutrientes procesados ​​por estos organismos.

Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia para medir partículas y los flujos de nutrientes disueltos en filtradores implicar la incubación (técnicas indirectas) o la recogida simultánea de ambiente y agua exhalado (técnicas directas). Técnicas de incubación se basan en la medición de la tasa de cambio en la concentración de partículas y nutrientes disueltos en el agua se incubaron, y la estimación de las tasas de producción o la extracción en comparación con controles adecuados ^8. Sin embargo, encierra un organismo en una cámara de incubación puede alterar su feeding y el bombeo de comportamiento debido a los cambios en el régimen de flujo natural, debido a una disminución de oxígeno y / o de la concentración de la comida, o debido a la acumulación de compuestos de excreción en el ^7,9 agua de incubación (y sus referencias). Además de los efectos de confinamiento y de suministro de agua modificada, un importante sesgo de técnicas de incubación se debe a efectos de re-filtración (véase, por ejemplo ^10). Aunque algunos de estos problemas metodológicos se han superado mediante el uso de el volumen y la forma correcta de la recipiente de incubación ¹¹ o con la introducción de un sistema de campana de vidrio de recirculación in situ ^12, esta técnica a menudo subestima velocidades de eliminación y de producción. Cuantificar el metabolismo de los compuestos disueltos tales como nitrógeno orgánico disuelto (DON) y el carbono (DOC) o nutrientes inorgánicos, ha demostrado ser especialmente propensos a sesgos provocados por técnicas de incubación ^13.

A finales de los años 60 y principios de los 70, Henry Reiswig^9,14,15 pionero en la aplicación de las técnicas directas para cuantificar la eliminación de partículas por esponjas Caribe gigantes, mediante el muestreo por separado el agua inhalado y exhalado por los organismos en situ. Debido a la dificultad de aplicar la técnica de Reiswig en alimentadores de suspensión más pequeñas y en condiciones bajo el agua más desafiantes, la mayor parte de la investigación en este campo se limita a la de laboratorio (in vitro) empleando técnicas de incubación principalmente indirectos ^16. Yahel y sus colegas volver a montar Reiswig de directa técnica in situ para trabajar en condiciones de menor escala. Su método, denominado InEx ^16, se basa en un muestreo bajo el agua simultánea del agua inhalado (A) y exhalado (Ex) por organismos inalteradas. La diferente concentración de una sustancia (por ejemplo, bacterias) entre un par de muestras (InEx) proporciona una medida de la retención (o producción) de dicha sustancia por el animal. La técnica emplea tubos InEx abiertas yse basa en el chorro excurrent producido por la actividad de bombeo del organismo estudiado para reemplazar pasivamente el agua del ambiente en el tubo de recogida. Mientras Yahel y sus colegas han aplicado con éxito esta técnica en el estudio de más de 15 diferentes de suspensión alimentadores taxones (por ejemplo, ^17), el método está limitada por el alto nivel de la práctica y la experiencia requerida, por el tamaño minúsculo de unos orificios excurrentes, y por las condiciones del mar.

Para superar estos obstáculos, hemos desarrollado una técnica alternativa basada en la aspiración controlada de la muestra de agua a través de tubos minuto (diámetro externo <1,6 mm). Nuestro objetivo era crear un dispositivo simple, fiable y de bajo costo que permitiría limpio y controlado en el muestreo del agua situ a partir de un punto muy específico, como el orificio de excurrente filtradores bentónicos. Para ser eficaz, el método tiene que ser no intrusiva con el fin de no afectar el régimen de flujo ambiente o modificar el behavior de los organismos estudiados. El dispositivo que aquí se presenta se denomina VacuSIP. Es una simplificación del sistema SIP desarrollado por Yahel et al. (2007) ¹⁸ para el punto de muestreo basado en ROV en las profundidades del mar. El VacuSIP es considerablemente más barato que el SIP original y se ha adaptado para el trabajo a base de buceo. El sistema fue diseñado de acuerdo a los principios presentados y probados por Wright y Stephens (1978) ¹⁹ y Møhlenberg y Riisgård (1978) ²⁰ para entornos de laboratorio.

Aunque el sistema VacuSIP fue diseñado para estudios in situ del metabolismo de los alimentadores de suspensión bentónicos, también se puede utilizar para estudios de laboratorio y donde se requiere una, muestra de agua en el punto fuente controlada y limpio. El sistema es especialmente útil cuando se requiere la integración durante períodos prolongados (min-horas) o en filtraciones in situ. El VacuSIP ha sido utilizado con éxito en el laboratorio Yahel desde 2011, y tiene tambiénha empleado en dos estudios recientes de los flujos de nutrientes mediados por especies de esponjas del Caribe y el Mediterráneo ²¹ (Morganti et al. Presentado).

El uso de muestreadores específicas, la duración prolongada de muestreo, y las condiciones de campo, en el que se aplica VacuSIP, implica algunas desviaciones de los protocolos estándar oceanográficos para recoger, filtrar y almacenar muestras de analitos sensibles. Para reducir el riesgo de contaminación por el sistema VacuSIP o el riesgo de modificación de la muestra de agua por la actividad bacteriana después de la recogida, probamos varios en los procedimientos de filtración y de almacenamiento in situ. Diferentes dispositivos de filtrado, recipientes de recogida, y los procedimientos de almacenamiento se examinaron con el fin de lograr la técnica más adecuada para el análisis de inorgánico disuelto (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ y orgánica (DOC + DON) compuestos, y ultra-plancton (<1081; m) y partículas orgánicas (POC + muestreo PON). Para reducir aún más el riesgo de contaminación, especialmente en condiciones de campo, el número de etapas de manipulación se redujo al mínimo. El formato visual en el que se presenta el método está orientada para facilitar la reproducibilidad y de reducir el tiempo necesario para aplicar de manera eficiente la técnica.

Resumen del sistema

Para muestra en agua in situ bombeada desde los alimentadores de suspensión con orificios exhalantes tan pequeños como 2 mm, la actividad de bombeo de cada muestra se visualizó por primera vez por que liberan de forma filtrada fluoresceína teñido de agua de mar al lado del orificio (s) de inhalantes y observar su flujo desde la abertura excurrente ¹⁶ (ver también la Figura 2B en ^18). El agua inhalado y exhalado por la muestra de estudio (incurrente y excurrentes) son entonces muestras de forma simultánea con el uso de un par de tubos hora instalados en manipulador a la medida o en dos de los "arms "de un trípode portátil flexibles al revés (figura 1 y complementario de vídeo 1). El agua inhalado por el organismo estudio se recoge mediante el posicionamiento cuidadosamente el extremo proximal de un tubo en el interior o cerca de la abertura de inhalantes del organismo estudio. Un idéntica tubo se coloca dentro del orificio excurrent. Esta operación requiere un buen cuidado de evitar el contacto o perturbación del animal, por ejemplo, mediante resuspensión de sedimentos. para comenzar el muestreo, un buzo perfora un tabique en el recipiente de recogida con una aguja de jeringa unida a la extremo distal de cada tubo, permitiendo que la presión de agua externa para forzar el agua en la muestra en el recipiente a través del tubo de muestreo. la succión es iniciada por el vacío creado previamente en los viales y por la diferencia de presión entre el agua externa y el recipiente de muestra evacuado .

Para asegurar una colección de agua limpia exhalado y para evitar la aspiración accidental de Ambiagua ent ^16, la tasa de muestreo del agua debe mantenerse a una tasa significativamente más baja (<10%) que el caudal excurrente. La velocidad de aspiración se controla por la longitud del tubo y su diámetro interior (ID). El diámetro interno pequeño también asegura un volumen muerto insignificante (<200 l por cada metro de tubo). El muestreo durante períodos prolongados (minutos a horas) hace que sea posible la integración de la agregación inherente de la mayoría de las sustancias de interés. Para asegurarse de que las muestras se conservan adecuadamente en sesiones de toma de muestras submarinas prolongados, así como para el transporte al laboratorio, una en la filtración situ se recomienda para analitos sensibles. La selección de los vasos de muestreo, conjunto de filtración, y los tubos están dictadas por los organismos de estudio y la pregunta de investigación específica. El protocolo se describe a continuación asume que un perfil metabólico completo es de interés (para una revisión véase la Figura 2). Sin embargo, la naturaleza modular del protocolo permite fo modificación fácil para dar cabida a los planes de muestreo simples o incluso muy diferentes. Para un perfil metabólico completo, el protocolo de muestreo debe incluir los siguientes pasos: (1) la visualización de flujo; (2) El muestreo de alimentación ultra-plancton (plancton <10 micras); (3) El muestreo absorción de nutrientes inorgánicos y excreción (utilizando los filtros en línea); (4) El muestreo disuelto absorción orgánica y excreción (utilizando los filtros en línea); (5) se alimentan de partículas y la excreción (utilizando los filtros en línea); (6) Repita el paso 2 (ultra-plancton alimentación como control de calidad); (7) de flujo de visualización.

Cuando logísticamente factible, se recomienda que las mediciones de perfiles metabólicos se combinan con la velocidad de bombeo (por ejemplo, el método de velocidad frente de colorante, en ^16), así como con las mediciones de respiración. Estas mediciones se toman mejor al principio y al final de la sesión de muestreo. Para la medición de la respiración, optodes bajo el agua o micro-electrodos son preferibles.

Protocol

1. Los pasos preparatorios y de limpieza Procedimientos Solución de limpieza Use equipo de protección, una bata de laboratorio y guantes en todo momento. Llevar a cabo estos pasos preparatorios en un espacio limpio y libre de polvo y humo. Preparar una solución de ácido clorhídrico al 5-10% (HCl) con productos frescos y de alta calidad, agua doblemente destilada. Prepare un 5% de mezcla básica altamente soluble de solución de tensioactivo aniónico y…

Representative Results

La optimización de los métodos de recolección de agua de mar Selección de los viales de colección y procedimiento de limpieza recipientes colectores compatibles con VacuSIP deben tener un tabique que permite el muestreo a ser iniciado por la perforación con una aguja de la jeringa. Deben soportar la presión bajo el a…

Discussion

pasos preparatorios

Viales de colección para DOM y análisis de nutrientes

Desde vasos colectores pueden interactuar con el micro-constituyentes disueltos y las paredes de toma de muestras puede ser un sustrato para las bacterias de crecimiento ^30-34, se ensayaron diferentes viales para DOM y recogida de nutrientes. Borosilicato no se recomienda para la cuantificación de sílice ^33,35, desde botel…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181