VacuSIP、のための改良INEX方法<em>その場で</em>微粒子と溶解した化合物の測定は、アクティブサスペンションフィーダによって処理します
Summary
We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.
Abstract
Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.
Introduction
底生サスペンションフィーダは、海洋生態系1の機能に重要な役割を果たしています。水2,3の大ボリュームをフィルタリングすることにより、それらは削除して、微粒子（プランクトンやデトリタス）及び（およびその中の参考文献）溶解した化合物1を排泄し、底生-遠洋カップリング4,5と栄養循環6,7の重要な薬剤です。正確に微粒子および溶解した化合物を除去し、（そのようなスポンジ、ホヤ、多毛類、および二枚貝など）底生サスペンションフィーダによって排泄を測定することは、その生理機能、代謝および摂食生態を理解することが基本です。一緒に速度測定をポンピングして、それはまた、これらの生物とその生態水質への影響だけでなく、生態系の規模の方法にすることによって媒介される栄養フラックスの定量化を可能にします。
微粒子の除去および生産速度を測定する適切な方法を選択し、溶解コムサスペンション濾過摂食によりポンドは彼らの摂食活動8に関する信頼性の高いデータを得るために重要です。 Riisgårdと他の人が指摘したように、不適切な方法論は、特定の物質の摂取と排泄の不正確な推定値を生成、実験条件を歪める、結果にバイアスをかけると、これらの生物によって処理された栄養フラックスの誤った定量化につながることができます。
二つの最も頻繁に使用される方法は、インキュベーション（間接技術）や周囲の同時収集と吐き出される水（直接技術）のいずれかを伴う濾過摂食中の微粒子や溶解栄養フラックスを測定しました。インキュベーション技術をインキュベート水中の微粒子の濃度と溶解栄養素の変化率を測定し、適切なコントロール8と比較して、製造又は除去の速度を推定に基づいています。しかし、インキュベーションチャンバー内の生物を囲むと、そのfeedinを変更することができますグラム起因および/ または食品の濃度で、またはによる排泄のインキュベーション水7,9中の化合物（およびその中の参考文献）の蓄積への酸素の減少に起因自然流況の変化に行動をポンピング。閉じ込め変性給水の効果に加えて、培養技術の主要なバイアスは、再濾過効果（実施例10を参照のこと）に由来します。これらの方法論的な問題のいくつかは、インキュベーション容器11の右のボリュームや形状を使用するか、 その場 12 における循環鐘システムの導入により克服されてきたが、この技術は、多くの場合、除去し、生産速度を過小評価します。このような溶存有機窒素（DON）と炭素（DOC）または無機栄養素として溶解した化合物の代謝を定量化、インキュベーション技術13によって引き起こされるバイアスに特に傾向があることが証明されています。
60年代後半と70年代初頭、ヘンリーReiswigで9,14,15は、別途その場で生物によって吸入および吐き出さ水をサンプリングすることにより、巨大なカリブ海スポンジによって粒子除去を定量化するために、直接技術の適用を開拓してきました。小さ いサスペンションフィーダー上で、より挑戦的な水中の条件でReiswigの技術を適用する難しさに起因して、この分野の研究の大部分は、主に間接的なインキュベーション手法16を採用した （in vitroでの ）実験室に制限されていました。 Yahelらは、小規模な条件で動作するようにその場技術で Reiswigのダイレクトを改装しました。彼らの方法は、INEX 16と呼ばれる、乱されていない生物によって（例）（中）吸入および吐き出さ水の同時水中サンプリングに基づいています。動物によるその物質のサンプル（INEX）の対の間の物質（ 例えば 、細菌）の異なる濃度が保持（または生産）の尺度を提供します。 INEX技術は、オープンエンドチューブを採用し、受動的に捕集管に周囲の水を交換するために研究生物のポンプ活動によって生成流出するジェットに依存しています。 Yahelや同僚が正常に15以上の異なるサスペンションの研究にこの手法を適用しているが分類群（ 例えば 、17）フィーダ、この方法は、いくつかの突出形のオリフィスの微小サイズによって、およびにより、必要な実践と経験のハイレベルによって制約されます海の状態。
これらの障害を克服するために、我々は、微小管を通るサンプリング水の制御された吸引（外径<1.6ミリメートル）に基づいて、別の技術を開発しました。私たちの目標は、このような底生サスペンションフィーダの流出性のオリフィスとして清潔で、非常に具体的な点から、 その場で採水して制御できるようになり、シンプルで信頼性が高く、安価なデバイスを作成することでした。有効であるために、この方法は、周囲の流動様式に影響を与えるまたはbを変更しないように、非侵入である必要があります研究生物のehavior。ここで提示デバイスがVacuSIPと呼ばれています。これはYahel らによって開発されたSIPシステムの単純化です。深海におけるROVベースのポイント・サンプリングのための（2007）18。 VacuSIPは、元のSIPよりもかなり安価であり、それはSCUBAベースの作業に適応されています。システムは、実験室の設定のためのライトとスティーブンス（1978）19とMøhlenbergとRiisgård（1978）20によって提示され、テストの原則に基づいて設計されました。
VacuSIPシステムは底生サスペンションフィーダの代謝のインサイチュ研究にするために設計されたが、それはまた、実験室での研究のために使用することができ、制御された、きれいな、点源水のサンプルが必要とされる場所。 その場での濾過または長期間（分-時間）にわたって統合が必要とされると、システムは特に便利です。 VacuSIPは2011年以来Yahelラボで正常に使用し、また持っているされていますカリブ海と地中海スポンジ種21によって媒介される栄養フラックスの2の最近の研究で採用されて（Morganti ら提出）。
VacuSIPが適用される特定のサンプラーの使用、長時間のサンプリング期間、およびフィールド条件は、収集、フィルタリング、および敏感な分析物についてサンプルを保存するための標準的な海洋プロトコルからいくつかの偏差を伴います。収集後の細菌活動によってVacuSIPシステムまたはサンプリング水の変形の危険性により、汚染のリスクを低減するために、我々は、in situ濾過および記憶手順で種々の試験しました。異なるフィルタリング装置、収集容器、および保存の手順は、溶存無機（PO 4 3-、NO X – 、NH 4 +、のSiO 4）の分析のために最も適切な技術を達成するために検討した有機（DOC + DON）を化合物は、超プランクトン（<1081; m）および粒子状有機（POC + PON）のサンプリング。さらに、特に野外条件下で、汚染の危険性を低減するために、処理ステップ数は、最小限に減少しました。方法が提示された視覚的なフォーマットは、再現性を促進するために、かつ効率的な技術を適用するのに要する時間を短縮するように配向されています。
システム概観
2ミリメートルほどの小さな出水口付サスペンションフィーダからその場揚水にサンプリングするために、各試験片のポンプ活性は、最初の吸入口（複数可）の横にフィルタリングフルオレセイン染色された海水を放出し、流出する開口部16からその流れを観察することによって可視化されます（18にも図2Bを参照してください）。研究試料（水が流れ込むと流出する）によって吸入および吐き出される水が同時にカスタムビルドのマニピュレータにインストールされている微小管のペアを使用して、または「ARの2でサンプリングされています逆さま柔軟なポータブル三脚のミリ秒」（ 図1及び補足ビデオ1）。研究生物によって吸入水を注意深く研究生物の吸入開口部の中や近く1チューブの近位端を配置することによって収集されます。同一次に、チューブを一本幹のオリフィスの内側に配置されている。この操作では、堆積物の再懸濁によって、 例えば 、動物の接触や外乱を避けるために良いケアを必要とする。サンプリングを開始するには、ダイバーが接続注射針で回収容器内のセプタムを穿刺サンプリングチューブを介して容器内にサンプリングされた水を強制的に外部の水圧を可能にする、各チューブの遠位端は、吸引は、以前のバイアルに生成された真空によって、外部の水と排気試料容器との間の圧力差によって開始されます。
吐き出された水のきれいなコレクションを確保するため、およびアンビの偶然の吸引を避けるために、ENTの水16は 、水のサンプリングレートは、流出する流量よりも有意に低い割合（<10％）に維持する必要があります。吸引速度は、管の長さおよびその内径（ID）によって制御されます。小さな内径も無視できるデッドボリューム（<チューブのメートル当たり200μl）を保証します。長期間（数分から数時間）にわたってサンプリングは、対象のほとんどの物質の固有のパッチ状に統合することができます。サンプルは十分に、ラボへの輸送のためだけでなく、長時間の水中サンプリングセッション中に保存されていることを確認するには、その場のろ過に感度の分析物のために推奨されます。サンプリング容器、濾過アセンブリと、チューブの選択は、試験生物および特定の研究の質問によって決定されます。以下に記載されているプロトコルは、完全な代謝プロファイルは（概要については、 図2を参照）関心があることを前提としています。しかし、プロトコルのモジュール性がfを許可しますまたは単純な、あるいは非常に異なるサンプリング方式に対応するために簡単に修正。完全な代謝プロファイルの場合、サンプリングプロトコルは、次の手順含まれている必要があります（1）フローの可視化を、 （2）サンプリング超プランクトン送り（プランクトン<10ミクロン）。 （3）（インラインフィルターを使用して）無機栄養素の摂取と排泄をサンプリング。 （4）サンプリング有機取り込みと排泄を溶解した（インラインフィルターを使用）。 （5）粒子状供給および排泄（インラインフィルターを使用）。 （6）ステップ2を繰り返し（品質チェックなどの超プランクトン送り）。 （7）流れの可視化。
ロジスティック実現可能な、それは代謝プロファイルの測定は速度をポンプと組み合わされることが推奨されている場合（ 例えば、色素の先端速度方法、16）だけでなく、呼吸測定と。これらの測定は、最高のサンプリング・セッションの開始時と終了時に採取します。呼吸測定のために、水中オプトードまたは微小電極が好ましいです。
Protocol
Representative Results
Discussion
準備の手順
DOMおよび栄養分析のためのコレクターバイアル
収集容器は、溶解した微小成分と相互作用し得るとサンプラ壁は30-34成長細菌のための基板であってもよいので、DOMおよび栄養素収集のための別のバイアルを試験しました。サンプルはすぐに30を凍結されていない場合、ガラスびんは、最大2…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、フィールドワークの彼の援助のためマネルボリバルに感謝します。私たちは、研究とサンプリング権限への支援のための「パルクナチュラル・デル・モングリ、レメデス島IエルBaixのテル」に感謝しています。水中マニピュレータはAyelet Dadon-Pilosofによって設計され、氏Pilosofにより作製しました。この作品は、スペイン政府のプロジェクトCSI-コーラル[RCおよびMRへの助成金番号CGL2013-43106-R]によって、およびTMに「MINISTERIOデEducaciòn、文化のy Deporte（MECD）」からFPUの交わりによってサポートされていました。これはG. Yahelへカタロニア政府が資金を提供海洋生物地球化学と地球変動研究グループからの寄与[助成金番号2014SGR1029]とISF助成金1280から1213とBSFの助成金2012089です。
Materials
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (250µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA VIALS | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09) |
| HDPE VIALS | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42) |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter, pore size 0.7µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 2000 Solution | Decon Labs | E123FH | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7mm x 30mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 |
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