Introduction
Proteinler hücrelerde en fazla yer alan makromoleküllerdir ve bunlar hemen hemen tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. çoğu proteinin biyolojik aktivitesi içine katlama gerektirmemekte ve doğal üç boyutlu yapılara muhafaza. Anormal yerleşimleriyle Proteinler sadece normal işlevlerini kaybeder, ama aynı zamanda sık sık diğer proteinlerin fonksiyonlarını bozar ve hücrelerin 1,2 toksik olan çözünebilir oligomerik türler veya agrega oluşturmaz. Protein yanlış katlanmasına karşı için hücreler yanlış katlanmış proteinleri 3 ortadan hem moleküler, kendi doğal şekillerinde ulaşmak için katlanmamış veya kısmen katlanmış polipeptidleri yardımcı şaperonlar ve degradasyon yollarını, kullanır. Karmaşıklığı ve katlama sürecinin stokastik doğası göz önüne alındığında, protein yanlış katlanması kaçınılmaz olduğunu ve mutasyonlar, biyosentetik hatalar, ve post-translasyonel zararların 1 durumunda ters olmayabilir. Bu nedenle, hücreleri sonuçta degradat itimatiyon yollar protein kalitesini korumak için.
hücresel protein kalite kontrol önemi (PQC) sistemleri, kanser, diyabet ve Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz, Huntington hastalığı (HD) gibi birçok nörodejeneratif rahatsızlıklar dahil olmak üzere protein yanlış katlayan hastalıklarının sıklığı altını, ve spinoserebellar ataksi (SCA) 4,5. Örneğin, tümör baskılayıcı p53'ün mutasyonlar her durumda 6% 50-70 ~ ilişkili tümörlerde, tek en sık genetik lezyondur. P53 mutasyonlarının önemli bir bölümüyle agrega 7 oluşumuna yol p53 yapısını değiştirmek yanlış anlamlı mutasyonlar vardır. Ayrıca, genişletilmiş polyQ uzanıyor sahip proteinler genetik ve patolojik HD ve SCA ile ilişkilidir. Etkilenen proteinlerde polyQ streç uzunluğu belli bir eşik dönemi aştığında bu ilerici ve genellikle ölümcül hastalıklar tezahürtutun ve polyQ streç uzunluğu 8 uzatır olarak giderek daha şiddetli hale gelir.
Bu hastalıkların tedavisi için çekici bir yaklaşım, terapötik olarak hücresel PQC sistemleri, özellikle de degradasyon yollarını yastığı sağlamaktır. Ancak bozuk proteinlerin memeli hücrelerinde özellikle parçalanması ile ilgili yollar, yeterince anlaşılamamıştır. o proteazom katlanan proteinlerin bozulması için kritik öneme olduğu kabul edilmiştir rağmen, hayati bir mesele tanımlanmamış kalır: Özellikle tanınan ve yıkım için hedeflenmiş nasıl katlanan proteinler. PQC sistemleri sitoplazma, endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi hücresel bölümlerinde tespit edilmiştir, ancak ayrıca, çekirdekte PQC sistemleri 2 tam olarak bilinmemektedir.
laboratuarımızda tarafından yapılan son çalışmalar çekirdekte yanlış katlanmış proteinler çeşitli tanır ve bozan bir sistem belirledikmemeli hücre, 9. Bu sistem, promiyelositik protein (PML), nükleer protein ve üçlü motif ihtiva eden (TRIM) protein ailesinin bir üyesi ve RNF4, protein ihtiva eden bir halka-etki oluşur. PML ve çeşitli diğer kesme proteinler, protein SUMOylation 10 özgünlüğünü ve verimliliğini kolaylaştırır SUMO (küçük ubikitin benzeri modifiye edici) ile E3 ligaz aktivitesi, sahiptirler. RNF4 onlara ubikuitin ligaz aktivitesinin 11 tanıyor HALKA etki ek olarak bir veya daha fazla sumo-etkileşim motifleri (SIMS) ihtiva SUMO hedefli ubikitin ligazlara (Stubl), küçük bir grup aittir. Biz PML özellikle yanlış katlanmış proteinlerle ilgili farklı özellikleri ayırt edebilir ayrık alt tabaka tanıma siteleri aracılığıyla katlanan proteinleri tanıdığı bulundu. bağlanma üzerine, PML etiketler dahili SUMOylation sitesinin varlığı nedeniyle poli-zincir oluşturabilirler SUMO2 / 3 poli-zincir, iki hemen hemen aynı memeli SUMO proteinlerle proteinleri yanlış katlanmış. SUMOylated katlanan proteinler daha sonra ubikuitinasyon ve proteozomal bozulmasına yol açar RNF4, tarafından tanınır. Biz daha PML yetersizlik SCA türü bir fare modelinde 1 (SCA1) 9 davranışsal ve nöropatolojik kusurları şiddetlendirir olarak PML-RNF4 sistemi, nörodejenerasyon karşı koruma için önemli olduğunu göstermiştir.
Protein düzeyleri düzenleyen diğer hücresel mekanizmaları protein parçalanmasını ayırt etmek için, protein ciro oranları 9 ölçüldü. Protein ciro belirlemek için en sık kullanılan yöntemler arasında nabız kovalamaca ve sikloheksimid (CHX) kovalamaca vardır. Bu iki yöntem zamanla incelemek, sırasıyla, çeviri-yetkin hücreleri ve çeviri-inhibe hücrelerde ilgi toplam önceden var olan proteinlerin ilgi radyoizotop işaretli proteinler. Ancak, patojen ve yanlış katlanması eğilimli proteinleri eğitim için önemli bir sorun bu proteinlerin yarı ömrü son derece lo olabilir olduğunung. Örneğin, ataksin-1, ataksin-7, Huntingtin, α-sinüklein ve TDP-43 24 saat 9,12-16 fazla 12 yarılanma ömürleri. bu proteinleri barındıran hücreler, uzun süreli çeviri inhibisyonunu hayatta olmayabilir, özellikle yanlış katlanmış proteinlerle çünkü kendileri hücreler için oldukça zehirli olabilir çünkü bu proteinlerin yavaş devir hızları CHX kovalamaca analizi kullanımını engellemektedir. izotopik etiketleme ile darbe kovalamaca analizi aynı zamanda son derece toplama eğilimli olan proteinler için zor olabilir. En çok darbe kovalayıcı deneyler, aynı zamanda, radyoaktif etiketli tüm diğer proteinlerden ilgili proteini ayırmak için immüno kullanır. Bu işlem, normal olarak, yanlış SDS-PAGE elektroforezi ile analiz yapmak SDS çözülmeyen agrega oluşturabilen sırasında uzun immünopresipitasyon ve yıkama işlemleri içerir.
Yavaş devir hızı 9 açıklanan burada bir protokol nükleer katlanan proteinleri analiz etmek. 82 glutaminler (Atxn1 82Q) bir kısım içeren ataksin-1 (Atxn1) patojenik bir şekilde, bu amaçla 8 kullanılır. Hücre içinde sentezlendiğinde, çekirdeği (Şekil 1A) Atxn1 82Q mikroskopik formları görebilir inklüzyonlar gelişmiş yeşil floresan proteini (GFP), füzyon. Darbe kovalamaca analizi Ataxn1 82Q yarı ömrü boyunca 18 saat 9 olduğunu ortaya koymaktadır. Atxn1 82Q doğal yapısındaki ile yanlış katlanmış farklı özelliklere konformasyonları, hem de türler ile türlerden oluşmaktadır. Tür farklı oranlarda degrade olması muhtemeldir ve bu nedenle ayrı ayrı analiz edilmesi gerekmektedir. gelen lizatlar Atxn1 82Q-GFP ifade eden hücreler, NP-40 çözülebilir (çözünebilir veya NS, büyük olasılıkla doğal proteinleri veya yanlış katlanmış oligomerik / monomer proteinleri temsil eder) ve NP-40 çözünmeyen (Nı, toplu / yanlış katlanmış) kısımlar halinde bölünür. (Büyük ihtimalle düzensiz agregalar SS) ya da (SDS-dirençli SR, ikincisi daha SDS çözünür ayrılabilir muhtemelen amiloid fibriller) Parçalar (Şekil 1B). SR fraksiyon immunoblotting, ardından filtre geriliği deneyleri ile tespit edilebilir iken, KG ve SS fraksiyonları Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile analiz edilebilir. CHX Chase deterjanla paya ayırma yöntemi ile bir araya getirilmiş ve SS Atxn1 82Q yarılanma ömrü SS fraksiyonu kolaylıkla tanınan ve bozulmuş belirten NS Atxn1 82Q toplam Atxn1 82Q (Şekil 2A) çok daha kısa olduğu ortaya çıkmıştır hücrelerin 9. Böylece, bu yöntem yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemek için ve onların yıkım desen karşılaştırmak için güçlü bir araç sağlar.
Ayrıca yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını modüle makromolekülleri veya küçük bileşiklerin belirlenmesi için yüksek miktarda madde taraması için uygun olan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ateşböceği lusiferaz (LucDM) 17 bir model şaperon alt-tabaka bir şekilsel olarak destabilize mutant dayanır. Biz sigorta varNükleer lokalizasyon sinyali (NLS) d LucDM algılama kolaylık olması için bu hücre bölmesine PQC sistemleri prob, ve GFP (NLS-LucDM GFP) için. Mikroskopik NLS-LucDM-GFP formları hücreleri (Şekil 3A) küçük bir yüzdesi görünür nükleer agrega. Atxn1 82Q, NLS-LucWT-GFP olduğu PML-RNF4 yolu 9'da SUMO2 / 3 tarafından değiştirilebilir ve regüle NLS-LucDM-GFP fakat vahşi tip muadili benzer. SS ve SR türlerin nispi miktarları NS göre minimum olmasına rağmen NLS-LucDM-GFP aşağıda protokol 3'te tarif edilen koşullar kullanılarak, SS ve SR türler oluşturur. tahlil basitleştirmek için, biz sadece SDS SDS-PAGE ve western blot ile (NS ve SS fraksiyonları hem dahil) çözünebilir LucDM analiz. Önemli olarak, CHX takip deneyi SDS çözünür NLS-LucDM-GFP yarı ömrü LucDM tanır ve dalgalanmalar sistemi için belirli bir alt-tabaka olduğunu düşündüren vahşi tip muadili (Şekil 3B) çok daha kısa olduğunu göstermiştirYanlış katlanmış proteinler.
LucDM-GFP bozulması genel flüoresan sinyalinde önemli bir düşüşe neden olur. Bu nedenle, aynı zamanda mikro floresans bazlı analiz kullamlarak hücresel LucDM-GFP gerçek zamanlı saptanması için bir protokol geliştirilmiştir. Bir çok yüksek girdi boyunca araştırma (HTS) sistemleri olarak anormal protein 18-20 neden olduğu hücre agregatları ve hücre canlılığı düzenleyici ilaçlar ya da gen için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, çok az HTSs özellikle memeli hücrelerinde bozulmasını hedefleme için tasarlanmıştır. Bu protokol, hücresel yanlış katlanmış protein parçalanması ile ilgili protein ifadesi, devirme ve ilaç tedavisinin etkileri hızlı ve büyük ölçekli analizi için sağlam bir sistem olarak hizmet vermektedir. Bu iki yanlış katlanmış proteinlerin analizi için protokoller tarif aşağıda, örnek olarak HeLa hücreleri kullanılarak. Transfeksiyon koşulları ve zaman süreci, her hücre hattı için optimize edilmesi gerekebilir, ancak deneyler ayrıca, diğer hücre çizgileri ile de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Reaktif hazırlanması 1.
- Hücre liziz tamponu (50 mM Tris, pH 8.8, 100 mM NaCI, 5 mM MgCI2,% 0.5 NP-40). Ek 2 mM DTT, 1 x tam proteaz kokteyli, 250 lU / ml kadar Benzonaz ile yıkanmıştır.
- Pelet tamponu hazırlayın (20 mM Tris, pH 8.0, 15 mM MgCI2). Ek 2 mM DTT, kullanımdan önce 1 x tam proteaz kokteyli ve 250 IU / ml kadar Benzonaz.
- 3x kaynama tamponu (% 6 SDS, 20 mM Tris, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce 150 mM DTT Supplement.
- mikroplak floresan okuyucu kullanarak deneyleri için düşük floresan DMEM ortamı hazırlayın. 25 mM glükoz, 0.4 mM glisin, 0.4 mM arjinin, 0.2 mM sistein, 4.0 mM glutamin, 0.2 mM histidin, 0.8 mM izolösin, 0,8 mM lösin, 0.8 mM lizin, 0.2 mM metionin, 0.4 mM fenilalanin, 0.4 mM serin, 0.8 karıştırın mM treonin, 0.078 mM triptofan, 0.4 mM tirosin, 0.8 mM valin, 1.8 mM CaCl2, 0.81 mM MgSO 4, 5.33 mM KCI, 44.0 mM NaHCO 3, 110 mM NaCI, 0.9 mMNaH 2 PO 4. pH 7.4'e HCI veya NaOH kullanılarak solüsyonun pH ayarlayın. süzme yoluyla orta sterilize edin.
NOT: Bu ortam o Fe dışında yüksek glukoz ile standart DMEM ortamı bileşenlerini içermektedir (NO 3) 3, vitaminler ve Fenol Kırmızısı ihmal edilir. Fenol kırmızı, riboflavin ve düzenli DMEM kültür ortamı içinde piridoksal belirgin bir floresan sinyali 21 tespiti engeller. Bu bileşenleri olmadan kültür ortamı, başarılı canlı hücre GFP görüntüleme için çok önemlidir. buzdolabında saklandığında orta 12 ay boyunca stabildir.
Atxn1 82Q GFP 2. Parçalanma Deneyi
- Plaka, yaklaşık% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi 35 mm tabak içine 3 x 10 5 HeLa hücreleri, O / N kültür hücreleri transfeksiyon zaman% 40-60 bir ortak akışa kadar büyümeye yapılabilmesi için,.
NOT: Gerekli plakaların sayısı zaman noktalarında ve tedavi d sayısına dayanırAşağıda escribed. - Üreticinin talimatlarına 9'a göre her bir transfeksiyon reaktifi olarak Atxn1 82Q-GFP / pRK5 plazmid 0.3 ug ile transfekt HeLa hücreleri. DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı yapın ve her bir kuyu için bölmeyin.
- 4-5 saat sonrası transfeksiyon, dalgaboyu 450-490 nm ile GFP ifade için ters bir floresan mikroskop altında canlı hücreleri incelemek. görüntüleme sonra inkübatör geri hücreleri dönün.
NOT: Şu anda çekirdekte hem de dağınık GFP sinyalleri ve GFP sinyalleri küçük benekler gözlemleyin. - Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 50 ug / ml CHX ihtiva eden 2 ml taze DMEM ekleyin. hasat öncesi CHX 0, 4, 8, 12 ve 16 saat için hücreleri tedavi. proteozomal bozulmasını incelemek için, bir kontrol olarak, 16 saat tedavi edilmemiş plaka proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir.
- Her bir zaman noktasında hücrelerin bir plaka hasat edilir. vakum aspirasyon An tarafından orta çıkarın3 ml buz gibi soğuk 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez tabakları yıkamak d. kuru buz üzerinde plaka Yapış-dondurma.
- Son zaman noktasında (16 saat) sonra, buz soğukluğundaki hücre parçalama tamponu 150 ul içinde (bütün zaman noktalarında gelen) Dondurulmuş hücreler kazıma ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de bir tezgah üstü santrifüj içinde hücre lizatları santrifüjleyin.
- bir pipet kullanılarak bir tüpe, NP-40 çözülebilir (NS) proteinleri içeren süpernatant aktarın.
Not: Gerekirse Bradford tahlili ile protein konsantrasyonlarını ölçmek için süpernatantlar kullanın. - nazikçe pelet bozmadan tüplere yaklaşık 200 ul 1x PBS ekleyerek pelet durulayın. Dikkatle vakum aspirasyon ya da pipetle PBS kaldırmak. Buz üzerinde 15-30 dakika inkübasyon, ardından 150 ul buz gibi soğuk tampon maddesi hücre topağı bunları yeniden askıya.
NOT: yeniden süspanse topak parçası NP-40 çözünmeyen (NI) proteinleri içerir. Bir diag Şekil 1B'ye bakınızDeterjan fraksiyonlaşması koç. - peletlerden yeniden süspansiyon haline NS fraksiyonları ve NP-40 çözünmeyen (NI) fraksiyonlara 3x kaynama tamponu 75 ul ekle. 5 dakika için bir ısı blokta 95 ° C'de numune ısıtın.
Not: NP-40 çözünmeyen fraksiyon Kümelenmeye ısıtılması ve numuneler belli olacak sonra eritilir. - kaynatıldı NS ve NI bir kısım SDS-jel yükleme tamponu ekleyin. SDS-PAGE jel tüm zaman noktalarında alınan örneklerin eşit miktarda yerleştirin. Zaman 0. NOT toplanan numuneden yaklaşık 20 ug NS hacim yüklenen karşılık gelir: NI hizip NS yanı sıra SDS-çözünür (SS) proteini, SDS ayıran jel ile çözülebilir. Buna karşılık, NI fraksiyondan SDS-dirençli (SR) agrega jel yükleme kuyuları (Şekil 1B) sıkışmış. Western blot algılama geliştirmek için, NI hacminin iki yüklenebilir.
- anti-GFP antikor ve zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma (ECL) ile western blot ile NS SS Atxn1 82Q-GFP algılar.
NOT: Bu protokol kullanıldığında SS fraksiyonunda Atxn1 82Q genellikle daha az NS fraksiyonu ile karşılaştırılır. Daha uzun ECL maruz uygun sinyaller için gereklidir. - Bir nokta leke cihazı (Şekil 1B) kullanarak filtre gerilik tahlilleri ile pelet fraksiyonu SR Atxn1 82Q inceleyin. Kısaca, bir 0.2 mikron selüloz asetat membran tutan bir nokta-benek aparatı ayarlayın. Nokta-blot cihazının her bir kuyunun içine kaynatıldı NI yük 80-120 ul.
Not: SR agrega sadece az miktarda hücrelerinde oluşan zamanda, nokta benek analizi için, Western blot analizi için kullanılan NS fraksiyonunun hacminin yaklaşık 10-15 kat SR fraksiyonunun bir hacim yükleyin.- Vakum ile membrandan örnekleri süzüldükten sonra, zar üzerinde kalmış Atxn1 82Q-GFP agrega anti-GFP immunoblotting 9,12,22 ile tespit edilebilir.
NOT: Filtre geriliği testinin ayrıntılı bilgi için önceki raporlarda 9,12,22 bakın. Bu adım isteğe bağlıdırSR Atxn1 82Q bu protokolü açıklanan kısa transfeksiyon aşağıdaki SS ve NS fraksiyonları ile karşılaştırıldığında çok az olduğu için. Buna ek olarak, SR Atxn1 82Q seviyeleri büyük ölçüde CHX Chase (Şekil 2B) aynı kalır. Ancak, SS Atxn1 82Q miktarları ilk deneylerde herhangi bir ilaç tedavisi veya gen ifadesi için zamanla etkilenip etkilenmediğini incelemek için hala çok önemlidir. SS protein türleri, western blot ile tespit edilebilir, SDS-PAGE jel yükleme kuyu içinde kalmak. Bununla birlikte, bu yöntem daha az hassastır ve daha değişken sonuçları (Şekil 1B) oluşturur.
- Vakum ile membrandan örnekleri süzüldükten sonra, zar üzerinde kalmış Atxn1 82Q-GFP agrega anti-GFP immunoblotting 9,12,22 ile tespit edilebilir.
SDS-PAGE ve Western blot NLS-lusiferaz-GFP 3. Parçalanma Deneyi
- Plaka, yaklaşık% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi 35 mm tabak içine 3 x 10 5 HeLa hücreleri. O / N kültürden sonra% 40-60 bir kesişme transfeksiyon zamanı ulaşılır. gerekli plakaların sayısı t sayısına dayanırime noktaları ve tedavileri aşağıda tarif.
- Üreticinin talimatlarına 9'a göre her bir kuyunun kullanarak transfeksiyon reaktif içine 1.0 mikrogram NLS-lusiferaz-GFP / pRK5 plazmid ile Transfect HeLa hücreleri. iyi her kısım için DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı olun.
- O / N transfeksiyon (saat 15 civarında) sonra, emisyon dalga boyu 450-490 nm GFP tanımı için bir ters flüoresan mikroskop altında, canlı hücreleri incelemek. görüntüleme sonra inkübatör geri hücreleri dönün.
Not: Dağınık çekirdek GFP sinyali hücreleri (% 70) büyük çoğunluğunda gözlenebilir. Hücrelerin küçük bir yüzdesi (% 5) Nükleer agrega var. - Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 50 ug / ml CHX ihtiva eden 2 ml taze DMEM ekleyin. hasat öncesi CHX 0, 1.5, 3, 4.5 ve 6 saat için hücreleri tedavi. proteozomal bozulmasını incelemek için, kontrol olarak 6 saat muamele bir plaka ek proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir.
- Her bir zaman noktasında hücrelerin bir plaka hasat edilir. Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 3 ml buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez plakaları yıkayın. kuru buz üzerinde plaka Yapış-dondurma.
- Son zaman noktasında (6 saat) sonra hücreler de tüm zaman noktaları buz soğukluğunda hücre parçalama tamponu 150 ul sıyrılmış ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir dondurulmuş, tamamlandı.
- bir son% 2 SDS konsantrasyonu ve 50 mM DTT için bütün hücre lizatları SDS jel yükleme tamponu ekleyin. 5 dakika boyunca 95 ° C'de sıcaklıkta bir blok üzerinde inkübe edin.
- SDS-PAGE ve anti-GFP antikoru kullanılarak Western blot ile NLS-lusiferaz GFP analiz edin. SDS-PAGE jel tüm zaman noktalarında alınan örneklerin eşit miktarda yerleştirin. hacmi yaklaşık 20 ug 0 zamanında toplanan numune alınan bütün hücre lizatları içinde tekabül yüklendi.
Floresan Mikroplaka Okuyucu Kullanılarak NLS-lusiferaz-GFP 4. Gerçek zamanlı Parçalanma Testi
- Tohum, yaklaşık 1 x 10 4Şeffaf alt siyah 96 oyuklu doku kültürü plakaları halinde HeLa hücreleri. O / N kültürden sonra% 50-70 bir kesişme transfeksiyon zamanı ulaşılır.
NOT: tamamen askıya HeLa hücreleri içeren ortam 60 ul her kuyuya doğrudan numaralı seribaşı. tohumlama sonra geri ve ileri ek orta veya kaya plakasını eklemeyin, aksi takdirde hücreler dengesiz dağıtılmış olabilir. - Üreticinin talimatlarına uygun olarak her bir transfeksiyon reaktifi olarak NLS-lusiferaz-GFP / pRK5 plazmid 9 0.05-0.1 ug Transfect HeLa hücreleri. DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı yapın ve her bir kuyu için bölmeyin. hücrelerle üç kuyu, her işlem koşulunda için arka plan flüoresan sinyali için bir kontrol olarak hizmet DNA ile transfekte değildir.
Not: transfeksiyon varyasyonu azaltmak için alternatif bir yol, tohumlamadan önce hücreleri transfekte etmektir. Bununla birlikte, hücrelerin büyük bir kısmı yanlış katlanmış protein ile transfektes eklemek veya bu yöntemi kullanarak azaltılmış canlılığı göstermek için başarısız. Bazı hücreler, toksik yanlış katlanmış proteinleri ifade ederken şekilde tripsin emdirme ile neden olduğu stres dayanamayıp olasıdır. Bunun bir sonucu olarak, genel olarak flüoresan sinyal önemli ölçüde azalır. - 20-24 saat transfeksiyondan sonra, emisyon dalga boyu 450-490 nm GFP tanımı için bir ters flüoresan mikroskop altında, canlı hücreleri incelemek.
- vakum aspirasyon ile orta çıkarın. her oyuğa PBS 1x yaklaşık 200 ul ekleyin ve sonra DMEM ortamı artık miktarını kaldırmak için aspire.
- % 5 FBS ve 50 ng / ml CHX, düşük floresan DMEM ortamında 60 ul ekle. proteozomal bozulmasını incelemek için, numune bir takım ek proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir. Her bir tedavi / durum için kuyu üç kopya olarak ayarlayın.
NOT: fluo bir düşüşe neden olabilir diğer faktörleri ekarte etmek çok önemlidir, çünkü MG132 tedavisi proteozomal bozulması için kontrol olarak dahil edilmiştirhücre ölümü ve floresans içeren rescence sinyali. - CHX ilave edildikten sonra bir flüoresan plaka okuyucusu üzerinde hemen GFP flöresan sinyalinin ölçülmesi.
NOT: Yazılım ölçüm ayarları Tablo 1'de gösterilmiştir. - kadar 8-10 saat boyunca plaka saatte okuyun. okuduktan sonra, hücre kültürü inkübatör geri plaka dönüş.
- tablo dosyası olarak veri ihracat. floresan yoğunluğu yanı sıra her biri için çoklu okur ortalama değerini kullanın. İlgili gruplar halinde Zamanda 0 ortalama değerleri her veri noktasının değerlerini normalleştirmek. Şekil 4A ve 4B ve Şekil 5'te sağ panellerinde gösterildiği gibi, zaman içinde normalleştirilmiş floresan yoğunluğu çizilir.
- Tekrarlı ölçümlerde 23 ile iki yönlü ANOVA kullanılarak iki durum arasındaki bozulma oranlarının istatistiksel analiz.
NOT: Bu analizde, "floresan yoğunluğu" "suların ise bağımlı değişkenent koşulları "ve" zaman "iki faktör vardır. Bunun yerine bireysel zaman noktalarında veri karşılaştırma, tekrarlı ölçümlerde iki yönlü ANOVA tüm zaman boyunca iki tedavi grubu arasındaki farkı analiz eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HeLa hücreleri% 50 transfeksiyon (Şekil 1A) sonra 20 saat - bir sabit durum analizinde, mikroskobik görünür Atxn1 82Q-GFP nükleer agrega 30 görülmektedir. Anti-GFP antikor kullanılarak ve NS SS fraksiyonların Western blot analizi, proteinin molekül ağırlığı (Şekil 1B) karşılık gelen, 100 kDa ve 150 kDa işaretleri arasında Atxn1 82Q-GFP bir tat bant göstermektedir. SR fraksiyonunda Atxn1 82Q-GFP filtresi geriliği tahlili ile, ya da SDS-PAGE ve istifleme jeli (Şekil 1B) üstünde türleri gibi western blot yoluyla tespit edilebilir. herhangi bir büyük nükleer agrega oluşur önce yukarıda açıklanan protokolünü kullanarak yarılanma ömrü analizi için, CHX kovalamaca ilk transfeksiyondan sonra 4-5 saat başlar. SS fraksiyonunda Atxn1 82Q-GFP yarı ömrü hafif ya da 16 saat (Şekil 2A) üzerinden NS fraksiyonda Atxn1 82Q-GFP hiç azalmadığı aksine, yaklaşık 5 saattir. degraAtxn1 82Q-GFP leştirilmiş kısmen MG132 (Şekil 2A) ile hücrelerin işlemden geçirilmesi ile inhibe edilir. Biz daha önce PML onların SUMOylation teşvik ederek yanlış katlanmış protein bozulmasını uyardığını göstermiştir. Burada değiştirilmiş bozunma yolunun bir örnek olarak PML demonte kullanımı. PML siRNA tedavisi SS fraksiyonu (Şekil 2a) Atxn1 82Q-GFP yarı ömrünü uzatmıştır. SR Atxn1 82Q-GFP hiçbir belirgin değişiklik kontrolü veya PML siRNA ile muamele edilmiş hücreler (Şekil 2B ve 2C) ya tespit edilir.
Yirmi saat transfeksiyondan sonra, NLS-LucDM-GFP agrega 5 mikroskopik görünür hale - HeLa hücrelerinde% 15, ancak bu (Şekil 3A) transfekte edilir DNA miktarına bağlı olarak değişebilir. 3 saat (Şekil 3B ve 3C) - SDS çözünebilir NLS-LucDM-GFP yarı ömrü 2'dir. Transfekte edilmiş hücrelerin floresans yoğunluğu, aynı zamanda içinde azalırCHX tedavisi (Şekil 4A ve 4B) üzerine süresi. Altı saat CHX tedavisinden sonra, floresan yoğunluğu istikrarlı bir aşamaya ulaşır ve azalan durdurur (Şekil 4A ve 4B). Aynı zaman noktasında çözünen NLS-LucDM-GFP kalan floresans bozmasına dirençli birleştirilmiş türler oluşturulur düşündürmektedir (Şekil 3B ve 3C), büyük ölçüde düşer. Tutarlı olarak, birleştirilmiş, ama dağınık GFP 9 saat CHX tedavisi (Şekil 4C) sonra hücrelerin kalır. Degradasyon oranı (Şekil 4A ve 4B) etkilenmez, ancak İlginç bir şekilde, NLS-LucDM-GFP plazmidi daha yüksek bir miktarı kullanılarak transfeksiyon, nükleer agrega gibi kalan floresans yüksek yoğunluğu oluşturur. Western blot veya floresans okuma ve ardından SDS-PAGE ya da kullanarak, MG132 tedavisi veya NLS-LucDM-GFP bozulmasının inhibisyonunu tespit etmek mümkün PML siRNA (Şekil 3C, 4A, 4B, 5).
Flüoresans mikroskopisi ve deterjan fraksiyonasyon Atxn1 82Q-GFP Şekil 1. Tespit. (A) HeLa hücreleri Atxn1 82Q-GFP ile transfekte edilmiş ve DAPI ile boyanmıştır. Bireysel ve birleştirilmiş görüntüler gösterilir. Ölçek çubuğu 10 mikron =. (B) 2. Moleküler ağırlık belirteçleri Atxn1-Atxn 82Q batı leke görüntüleri solda gösterilir protokol açıklandığı gibi Atxn1-82Q ifade eden hücrelerin deterjan ayırmasına gösteren bir diyagram. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .
66 / 54266fig2.jpg "/>
. (-) Veya PML siRNA (A ve C) veya un ile tedavi edilmiş (B) 'da deterjanla paya ayırma ile Atxn1 82Q-GFP Şekil 2. Parçalanma deney HeLa hücreleri, daha önce kontrol ile tedavi edildi. Hücreler Atxn1 82Q-GFP ile transfekte edilmiş ve yokluğunda veya MG132 mevcudiyetinde CHX ile tedavi edildi. Hücre lizat kesirler anti-GFP antikor kullanarak (NS ve SS fraksiyonları A) western blot takip SDS-PAGE veya (SR kısmı için B ve C) filtre gerilik testi ile analiz edilmiştir. Tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için bu figür.
NLS-LucDM-GFP bozunma analizi floresan MICR göre Şekil 3.NLS-LucDM-GFP ile transfekte edilmiş oscopy ve western blot (A). HeLa hücreleri DAPI ile boyanmıştır. Bireysel ve birleştirilmiş görüntüler gösterilir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Ok başı nükleer agrega ile bir hücreyi gösterir. (B ve C) HeLa hücreleri NLS-LucDM-GFP ile transfeksiyon (ardından NLS-LucDM-GFP ve vahşi tip lusiferaz füzyon proteininin NLS-LucWT-GFP (B) ile transfekte ya da kontrol veya PML siRNA ile transfekte edildi C). gösterildiği gibi hücreler CHX ve MG132 ile muamele edildi. Tüm hücre lisatları, anti-GFP antikoru kullanılarak Western blot ile analiz edilmiştir. Görüntü izni 9 önceki yayınından değiştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NLS-LucDM-GFP bozulması için Şekil 4. Floresan mikro-bazlı analiz. HeLa hücreleri, 96 gözlü levhalar üzerine ekildi 0.05 ug (A) ya da 0.1 ug (B ve C) NLS-LucDM-GFP ile transfekte edilmiş ve CHX ile muamele edildi varlığı ya da yokluğu MG132. (A ve B) kuyu floresans yoğunlukları (ortalama ± standart sapma değerleri, n = 3), belirtilen zaman noktalarında ölçülmüştür. Sağdaki paneller tedavi gruplarında Zaman 0 okumalarına normalize değerleri göstermektedir, oysa sol paneller, orijinal floresan okuma göstermektedir. MG132 olan ve olmayan tedavi edilen gruplar arasındaki fark tekrarlanan ölçümlerle iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. iki tedavi grubu arasındaki P değerleri gösterilir. (C) Wells floresan mikroskop ile, önce veya 9 saat CHX tedaviden sonra muayene veya CHX ve MG132 tedavisi sonrası bulundu. iyi hem parlak toplu NLC-LucDM-GFP hücreleri ve loş dağınık protein olan göstermek için 1.5 gama değeri tüm görüntülere uygulandı. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5 bir PML demonte hücrelerde NLS-LucDM-GFP degradasyon oranı azalır. HeLa hücreleri, daha önce kontrol ile muamele edilmiş ve PML siRNA, 96 gözlü levhalar içine ekilmiştir. Şekil 4'deki gibi NLS-LucDM-GFP yıkımı analiz edildi (iki yönlü ANOVA, p <0.0001). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
54266 / 54266fig6.jpg "/>
Atxn1 82Q-GFP Şekil 6. Floresan CHX Chase değişmeden kalır. HeLa hücreleri Atxn1 82Q-GFP ile transfekte edilmiştir. Şekil 4'te açıklandığı gibi 24 saat sonrası transfeksiyon, Atxn1 82Q-GFP bozulması analiz edilmiştir. Şekil orijinal floresan okuma gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
96 gözlü levhalar üzerine ekildi sitoplazmik LucDM-GFP. HeLa hücrelerinin bozulması için Şekil 7. Floresan mikro-bazlı analiz MG132 varlığında veya yokluğunda CHX ile muamele 0.1 ug LucDM-GFP ile transfekte edilmiştir. Şekil 4 de tarif edildiği gibi sonuçlar analiz edildi (iki yönlü ANOVA, p <0.0001).tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1 .: floresan mikroplaka okuyucuda ölçüm ayarları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını düzenleyen mekanizmaların hücresel proteinlerin dengesini sağlamaya yönelik olarak, ve muhtemelen, nörodejeneratif bozuklukların ve diğer protein yanlış katlayan hastalıkların tedavisi için değerli bir ilaç hedeflerini temsil eder. Burada, yanlış katlanmış proteinler bozunmasını incelenmesi deneyler, patojenik Atxn1 protein (Atxn1 82Q) ve örnek olarak bir nükleer lokalize lusiferaz mutant (NLS-LucDM) ile tarif edilmektedir.
Bozulmasını 18 saat boyunca bir yarı ömre sahiptir Atxn1 82Q, incelemek için, klasik CHX 9 hücre fraksiyonu birleştirerek yeni bir yöntem geliştirmiştir. Bu yöntem, zaman içinde Atxn1 82Q Yanlış katlanmış türlerin çok daha hızlı bir boşluk göstermiştir. Buna ek olarak, LucDM giriş yanlış katlanmış proteinleri genel degradasyon mekanizmaları incelemek için bir model yanlış katlanmış alt tabaka içerir. memeli hücresinde yanlış katlanmış protein parçalanmasını tespit etmek için bir HTS sistemi ihtiyacını karşılamak içins, biz LucDM floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak bir hızlı çözülmesi tahlili geliştirilmiştir. Sistem, kimyasal ve genetik ekranlar için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir.
Atxn1 82Q proteini NS, SS ve hücre lizatları SR fraksiyonları bulunur. SR fraksiyonlar bu saygı ya da bozunması, örneğin, amiloid fibril edilmesi zor olan bir formda olduğunu düşündüren transfeksiyondan sonra uzun kültür sırasında artan bir önem kazanmaktadır. Kolayca protein yıkımı yolları bloke edebilir bozulmuş olamaz toksik katlanan türlerin veya agrega üretilmesi, anormal proteinlerin 24, 25,26 kontrol endojen hücresel makine analizini engelleyen. SR büyük miktarda oluşumunu önlemek için, CHX Chase, ilk transfeksiyondan sonra 4-5 saat başlar. Bu SS fraksiyonunun parçalanmasını geciktirebilir hücresel şartlar analizi için önemli olduğunu bulduk. Transfeksiyon zaman ek olarak, aşırı için önemli daÇok yüksek seviyelerde Atxn1 82Q proteini ifade eden hücreleri whelm. hiç ya da çok yavaş bir degradasyon Tüm fraksiyonları gözlenirse, Atxn1 82Q plazmid az miktarda transfeksiyonu için kullanılır. apoptotik hücreler bu sefer noktasının ötesine fark edilir İdeal olarak, tahlil 12 saat içinde bitmiş olmalıdır. Şekil 2A'da, kontrol hücrelerinde SS Atxn1 82 miktarı, 8 saat kadar kısa PML siRNA ile muamele edilmiş hücrelerdeki arasında çarpıcı biçimde farklıdır. Dikkat tedavi edilen grupta bir fark sadece 12 saat ötesine çıkmış ise hücre canlılığını yerine protein parçalanmasını etkileyen diğer faktörler neden olabilir gibi alınması gerekir.
NS Atxn1 82Q karşılaştırıldığında, Atxn1 82Q SS fraksiyonunda hali hazırda proteazom (Şekil 2A) ile parçalanabilir bir yanlış katlanmış bir tür olduğu gösteren, hızlı bir şekilde ortadan kaldırılır. Bunun aksine, SR Atxn1 82Q seviyeleri teyit aynı zaman süreci (Şekil 2B) değişmeden kalırbir un-bozunur türü olduğunu. Yine de, SR fraksiyonunun analizi doğrudan sitoplazmik agrega (ör otofaji) kaldırır mekanizmalar analiz etmek için önemli ve bu agregatların oluşumunu etkiler. Gözle, MG132 SS fraksiyonunda Atxn1 82Q düşmesini engelleyen daha az etkili olduğu görülmektedir. Bu Atxn1 82Q agregasyonlar olabilir proteazom inhibisyonu 27 üzerine doğrudan olarak ROS seviyelerinde bölgesi yüksekliği neden olabilir.
LucDM-GFP deneyinin büyük bir avantajı, floresans plaka okuyucusu kullanılarak HTS analizi adapte edilebilir olmasıdır. Biz başlangıçta Atxn1 82Q için HTS sistemi geliştirmek için çalıştı. Genel Atxn1 82Q proteininin sadece küçük bir bölümü zamanla düşer Ancak, GFP-Atxn1 82Q ifade eden hücrelerin floresans CHX kovalama süresince (Şekil 6) üzerinde büyük ölçüde değişmez. Genel uzun yarılanma ömrü ile diğer katlanan proteinler gerçek zamanlı flor ile benzer sorunları olurduescent deneyi. Buna karşın, genel NLS-lucDM-GFP protein belirgin bir azalma gözlenmiştir (Şekil 3 ve 4). Bu özellik, birlikte kısa bir yarı-ömür (2-3 saat) ile birlikte, bu model şaperon alt-tabaka kolaylıkla floresans spektroskopisi ile tespit edilmesini sağlar. Daha önceki çalışmalarda, GFPu, GFP proteini, yapıcı bir bozulma sinyali (CL-1) kaynaşmış yaygın ubikuitin-proteazom sisteminin 28,29 işlevselliği için bir muhabir olarak görev almıştır. Ayrıca, hücre ve hayvan modellerinde 30 önemli bir vekil yanlış katlanmış bir proteindir. GFPu karşılaştırıldığında, burada tarif edilen bozunma tahlilinde bir avantajı, yanlış katlanmış lusiferaz ise yaygın olarak kullanılan model, şaperon alt-tabaka olmasıdır. Lusiferaz aktivitesi inceleyerek kolayca in vitro ve in vivo olarak lusiferaz, yerli denatüre ve tekrar katlanmış konformasyonlar değerlendirir. Böylece, sistemimiz ile protein bağlama ve katlama deneyleri bağlamak için son derece yararlı bir platform olarak hizmet vermektedirAynı substrat 9 kullanarak hücresel bozulma sistemi.
Başlangıç floresan yoğunluğu, sabit kalma floresan yoğunluğu, ve protein yarı ömrü: Aşağıdaki değerler elde edilebilir gerçek zamanlı flüoresan ölçümü yoluyla. Bu değerler, Chase önce genel protein miktarı, bozunmaya dirençli proteinin miktarı ve protein döngüsü oranı sırasıyla ilişkilidir. Bu nedenle, düzeyleri ve farklı yanlış katlanmış protein türlerinin dinamiklerinin kapsamlı bir analiz yapmak için gerçek zamanlı flüoresan deneyi kullanmak mümkündür. Bazen, çoğaltır arasında başlangıç flöresan nispeten büyük bir değişkenlik gözlenmektedir (örneğin, Şekil 5, sol panel). Bu hücre, tohumlama veya transfeksiyon değişkenliğe neden olması muhtemeldir. Bununla birlikte, başlangıç floresans yoğunluğundaki farklar dışında, her bir replika sinyal çok benzer bir oranda düşer. sinyallerin Normalleştirme fro0 zamanında yoğunluğu her zaman noktaları daha doğru hali-kuyu farklılıkları azaltmak ve olabilir m bozunma oranları (Şekil 4A, 4B ve Şekil 5, vs sağ paneller sol) yansıtır.
Nükleer formuna ek olarak, aynı zamanda sitoplazmik LucDM-GFP analiz edilmiştir. Sitoplazmik LucDM-GFP Protokolü 4 (Şekil 7) 'de tarif edildiği gibi aynı deney prosedürü uygulandığında diğer floresan yüksek yüzdesi gözlendi dışında benzer bir bozunma modeli vardır. bozunma tamamen bu deney proteozomal bozulması ile sitoplazmik protein kalitesi kontrol izlemek için kullanılabilir gösteren MG132 önlenebildi. Gelecekteki çalışmalar için, özel hücresel bölme lokalizasyon sinyallerine kaynaşık zaman LucDM-GFP, diğer hücre bölmeleri, örneğin, mitokondri ya da endoplazmik retikulum uygulanabilir olup olmadığını araştırmak için ilginç olabilir.
Floresan tabanlı test protokolüne de belirtildiği gibi, floresan arka plan azaltmak ve iyi-kuyu transfeksiyon varyasyonu azaltmak için DNA ve transfeksiyon reaktif ana karışımı kullanmak düşük floresan ortamını kullanmak için çok önemlidir. kazanç kontrolü bazı floresan plaka okuyucu üzerinde ayarlanabilir. Bunun yerine optimize kılavuzuna kazancını ayarlamak ve tüm tahlil (Tablo 1) boyunca aynı değeri kullanmak önemlidir. kazanç değeri okuma saptama sınırının ötesine geçmez sürece hücresel GFP floresan gelen okuma maksimize etmek ayarlanabilir.
Geçerli aşamada, hala LucDM ifade transfeksiyon güvenmek. varyasyonu azaltır ve HTS için tahlil basitleştirmek için, gelecekteki bir amacı LucDM endüklenebilir ifadesi ile kararlı bir hücre dizisi oluşturmak için. Her iki arka plan floresan sahip mikrolevha'sının ve kültür ortamı gibi Ancak, arka planda önemli ölçüde daha yüksek GFP sinyali için çok önemlidir. Unforyazık ki, biz yeni kurulan istikrarlı tüm hatları LucDM düşük bir ifade var. Böylece, daha yüksek protein ifadesi ile istikrarlı bir çizgi gelişimi önemli ölçüde tarama verimliliğini artıracaktır.
Burada anlatılan bozunma tahlilleri, diğer yanlış katlanmış proteinleri uygulanabilir. Bağlı yanlış katlanmış proteinler, dinamik özelliği, bu deneyler, protein kalitesi kontrol derinlemesine mekanizmaları ortaya çıkarmak için diğer analizi ile bağlanmış olması gerekir. Bu analizler, farklı hücre fraksiyonlarında sabit durum agrega seviyelerini ve bölümleri (Şekil 1) bir ölçüm ve saflaştırılmış rekombinant proteinleri kullanılarak katlama proteinleri veya toplama analiz içerir. Bu deneyler, protein yıkımı veya agregasyonu üzerinde ilaç ya da gen ifadesinin doğrudan ya da dolaylı etkileri ayırt yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
