Summary
Этот протокол описывает скальпель погрузо-флуоресцентный краситель метод передачи, который измеряет межклеточной коммуникации через щелевых контактов каналов. Gap узловой межклеточной связи является одним из основных клеточный процесс, с помощью которого гомеостаз ткани сохраняется и нарушение этой клеточной сигнализации имеет неблагоприятные последствия для здоровья.
Abstract
Этот протокол описывает погрузо-флуоресцентный перенос красителя скальпель техника (SL-DT), который измеряет межклеточной коммуникации через щелевых каналов, который является одним из основных межклеточное процесс, с помощью которого поддерживается гомеостаз ткани. Прерывание разрыва соединительного межклеточной коммуникации (GJIC) путем токсикантов, токсинов, лекарств и т.д. было связано с многочисленными неблагоприятными последствиями для здоровья. Многие генетические основе заболеваний человека были связаны с мутациями в генах щелевых контактов. Техника SL-DT представляет собой простой функциональный тест для одновременной оценки GJIC в большой популяции клеток. Анализ включает в себя предварительное нагружение клеток с флуоресцентным красителем, кратко возмущающее клеточную мембрану с скальпелем через популяцию клеток. Флуоресцентный краситель затем дают возможность пройти через щелевых каналов в соседних сотах в течение указанного времени. Анализ затем останавливали добавлением формалина к клеткам. Распространение флуофлуоресцентным красителем через популяцию клеток оценивают с помощью микроскопа эпифлуоресцентной и изображения анализируются с любым количеством морфометрических программных пакетов, которые доступны, в том числе свободных программных пакетов, найденных на свободном доступе. Этот анализ был также адаптирован для исследований в естественных условиях с использованием срезов тканей из различных органов у обработанных животных. В целом, анализ SL-DT может служить широкий спектр экстракорпорального фармакологических и токсикологических потребностей, а также потенциально могут быть адаптированы для высокой пропускной способности, установленных планом систем с автоматизированной флуоресцентной микроскопии визуализации и анализа для выяснения больше образцов в более короткие сроки.
Introduction
Общая цель этого метода является обеспечение простой, всеобъемлющий и относительно недорогой метод для оценки потенциальной токсичности соединений. Это подход , в пробирке , который может быть использован в нескольких клеточных линиях. Стандартная клеточная биология лаборатории, оснащенные эпифлуоресцентной микроскопов можно проводить исследования с помощью этого теста.
Наши базовые знания клеточных функций была сильно зависит от биопроб в пробирке, и стал одним из важнейших компонентов в токсикологических оценках лекарственных средств , загрязняющих окружающую среду, а также пищевых продуктов родился загрязняющих веществ. К сожалению, нет ни одного в пробирке системы биоанализа , которые могут комплексно удовлетворить требованиям всех токсикологических оценок. Многие в анализах пробирке разработаны и оптимизированы для оценки, а также оценки конкретного биохимического или молекулярной конечной точки. Они довольно часто в сочетании с высокой пропускной способностью, созданной для отражения возмущенияопределенный пути передачи сигнала, такие как эстроген-рецептор сигнализации 1. Эта стратегия была довольно успешной, но обширное количество путей передачи сигнала, участвующих в экспрессии генов делает задачу выбора конкретного сигнального пути для оценки достаточно сложной. Высокие сквозные протоколы, поставленные в настоящее время разрабатываются и используются для одновременного измерения многочисленных сигнальных путей, который был один из подходов к преодолению некоторых ограничений единичных анализов. Тем не менее, не все сигнальные пути были успешно включены в более всеобъемлющие подходы, а также новые сигнальные пути постоянно обнаружили, что еще больше усложняет этот процесс оценки. Используя обширные количества подходов в пробирке, в частности , высокой пропускной поставленных систем, для комплексных токсикологические оценки также являются очень дорогими и не способствуют большей одного исследователя под руководством научно - исследовательских проектов.
GJIC представляет собой процесс ВИГhtly контролируется изменением напряжения, концентрации кальция, рН, окислительно - восстановительного баланса, регулируемые основными трансдукции внутриклеточного сигнала путей и взаимодействия с мембраной и цитоскелета белков 2,3. Таким образом, ингибирование GJIC могут отражать различные типы клеточного стресса, нарушение функций различных клеточных функций, или возмущения различных путей передачи сигналов. Другой подход к преодолению использования ограниченных биопробы трансдукции сигнала , чтобы воспользоваться биологическими явлениями , что многие, если не большинство, пути передачи сигналов дополнительно модулируется кооперативных межклеточных сигнальных систем через щелевых контактов каналов 4-8. Несмотря на то, межклеточные системы сигнализации также многочисленные и при многократном управления токопровода, межклеточное передача сигналов через щелевых каналов в конечном счете, зависит от каналов открываются, частично закрытое или полностью закрыта. Это обеспечивает конечную точку, которая может быть легко измерить с помощью различногов пробирке биопроб систем 7. Учитывая , что гомеостатическое набор точка ткани требует открытых каналов, определения влияния соединений на разрыв соединительного межклеточной коммуникации (GJIC) представляет собой более комплексный подход при определении потенциальных токсических эффектов соединений 4,8. По сути, это критическое биологическое явление, которое играет центральную роль в координации нескольких событий передачи сигналов, контролирующих экспрессию генов обеспечивает широкую оценку токсических эффектов. Таким образом, биопробы, которые оценивают GJIC являются отличной отправной точкой для оценки токсичностью соединений.
Наиболее обширные методы, используемые для оценки GJIC основаны на предварительной загрузки клеток с флуоресцентным зондом, а затем мониторинга миграции красителя из загруженной клетки или клеток на соседние ячейки. Методы для предварительной загрузки красителя вовлекли микроинъекции 9, царапать загрузки 10, и метиловых эфиров зондов 11 10. Вместо того , чтобы более инвазивной передряги, метод скальпель загрузки этого отчета включает в себя нежный рулон скальпелем с круглым лезвием через монослой клеток , которые сводят к минимуму повреждения инвазивный (рисунок 1). Преимущества этого метода являются токсикологическая оценка популяции клеток, а не отдельных клеток анализа микроинъекции. Кроме того, простота данного метода позволяет быстро выявить нескольких пластин в течение короткого времени, тогда как методы, использующие методы микроинъекции и методы, которые используют метиловые эфиры флуоресцентных зондов потребляют значительно больше времени и требует значительно более высокий уровень квалификации.
Хотя не существует ни одного метода, чтобы удовлетворить все потребности изучения GJIC; анализ SL-DT представляет собой простой, достаточно недорогой и универсальный тест, который можетудовлетворения многих потребностей для первоначальных оценок токсичности различных соединений. Основные преимущества включают в себя: простота, отсутствие особой необходимости в оборудовании или навыков, которые необходимы для других методов, таких как микроинъекции, флуоресцентного восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) анализа и локальной активации молекулярных флуоресцентных анализов зондов, быстрой и одновременной оценки GJIC в большой количество клеток, способствует высокой пропускной способности установки с автоматизированной флуоресцентной микроскопии визуализации и анализа, а также возможности его адаптации для исследований в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол данного исследования был одобрен уходу за животными и использованию комитета Национальных институтов здравоохранения наук Японии, который является , где в естественных условиях эксперименты были сделаны, чтобы гарантировать , что крысы относились гуманно и с учетом облегчения страданий.
1. SL-DT биопроб
- Семя 3 х 10 5 WB-F344 эпителиальные печени крысы клеток на 35 мм диаметр культуральные планшеты , содержащие орлов модифицированной среде плюс 5% эмбриональной телячьей сыворотки, и культивирования клеток в инкубаторе при 37 ° С , 100% относительной влажности (RH), 5% CO 2.
- Культуры клеток, пока они не достигают 100% слияния (как правило, 2 дня) и провести нужные экспериментальное лечение клеток, как описано ниже.
- Проведение экспериментов доза реагирования
- Добавляют 10 мкл и 20 мкл 2 мМ исходного раствора фенантрена в 100% ацетонитрила и 4 мкл, 6 мкл и 8 мкл 20 мМ маточного раствора phenanthrene в 100% ацетонитрила до трех пластин клеток, содержащих 2 мл среды роста для каждого добавленного объема исходного раствора.
- Добавляют 4 мкл, 6 мкл, 8 мкл, 10 мкл и 20 мкл 100% -ного раствора ацетонитрила с трех пластин клеток, содержащих 2 мл среды роста для каждого добавленного объема раствора ацетонитрила, чтобы служить в качестве управления транспортным средством.
- Инкубируйте пластины в течение 15 мин в термостате при 37 ° C, 100% относительной влажности и 5% СО 2.
- Перейдите к шагу 1.3.
- Проведение экспериментов Время отклика
- Добавить 7 мкл 20 мМ маточного раствора фенантрена в 100% ацетонитрила до трех пластин клеток , содержащих 2 мл ростовой среды для каждой временной точки (то есть, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 мин).
- Добавить 7 мкл 100% ацетонитрила до трех пластин клеток, содержащих 2 мл ростовой среды, для каждой временной точки, чтобы служить в качестве управления транспортным средством.
- Инкубируйте пластины для каждого указанного времени рoint в термостате при температуре 37 ° С, 100% относительной влажности и 5% СО 2.
- Перейдите к шагу 1.3.
- Провести эксперименты Время восстановления
- Добавить 7 мкл 20 мМ маточного раствора фенантрена в 100% ацетонитрила до трех пластин клеток, содержащих 2 мл ростовой среды в течение 15 мин.
- Добавить 7 мкл 100% ацетонитрила до трех пластин клеток, содержащих 2 мл ростовой среды в течение 15 мин, чтобы служить в качестве управления транспортным средством.
- Декантируйте среду, содержащую либо фенантрен или ацетонитрил и полоскание 3-кратный каждый с 3 мл фосфатно-буферного раствора (PBS).
- Добавляют 2 мл свежей среды для роста к каждой пластине и инкубировать нужное время для восстановления (то есть, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 мин) в термостате при температуре 37 ° С, 100 % относительной влажности и 5% СО 2.
- Перейдите к шагу 1.3.
- Проведение экспериментов Механизм
- Добавьте ингибитор трансдукции сигнала, т.е.
- Добавьте 5 мкл 100% ацетонитрила до трех пластин клеток, содержащих 2 мл ростовой среды в течение 15 мин, чтобы служить в качестве управления транспортным средством.
- Добавить 7 мкл 20 мМ маточного раствора фенантрена в 100% ацетонитрила до трех пластин клеток, содержащих 2 мл среды для роста плюс D609 в течение еще 15 мин.
- Добавить 7 мкл 100% ацетонитрила до трех пластин клеток, содержащих 2 мл среды для роста, плюс 100% ацетонитрила в течение еще 15 мин, чтобы служить в качестве управления транспортным средством.
- Перейдите к шагу 1.3.
- Проведение экспериментов доза реагирования
- Откажитесь культуральной среды либо осторожно наливая от среды или с помощью вакуумного отсоса.
Примечание: Утилизировать культуральной среды, содержащей опасные отходы надлежащим образом. - Прополощите клетки трижды, каждый раз с 3 мл PBS и либо сцеживать или аспирата betweeп полосканий.
- Пипетка 1 мл 1 мг / мл Люцифер желтого красителя, растворенного в PBS (LY) в каждую ячейку пластины.
- Поджать красителя в клетки, осторожно прокатки # 20 из хирургической стали лезвие с закругленным краем с помощью популяции клеток в трех различных областях пластины.
- Начнем с размещения скальпель перпендикулярно ( под углом 90 °) и 5 мм от края культурального планшета, а затем катить скальпелем с этим пр мым углом примерно под углом 15 ° (см рисунок 1).
Примечание: Это достигается за счет защемления скальпель между указательным и большим пальцем. Используйте тяжести, чтобы позволить скальпель, чтобы аккуратно перейти от 90 ° до 15 ° положение (как закругленная лезвие просто зашкаливает клетки). Это движение оставит визуально заметный отступа линии.
- Начнем с размещения скальпель перпендикулярно ( под углом 90 °) и 5 мм от края культурального планшета, а затем катить скальпелем с этим пр мым углом примерно под углом 15 ° (см рисунок 1).
- Инкубируйте клетки с раствором LY в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Слейте или аспирата LY и промыть три раза с 3 мл PBS, чтобы удалить все extracellular краситель для устранения внеклеточный фоновой флуоресценции.
- Добавьте 0,5 мл 10% -ного раствора формалина, забуференном фосфатом, чтобы зафиксировать клетки.
Примечание: После фиксации в формалине, воздух сухой клетки и хранить в темноте в течение до двух лет с минимальным фотообесцвечивания красителя LY. При необходимости повторной гидратации с 10% -ным раствором формалина, чтобы визуализировать переднюю флуоресцентный краситель. - Просмотр фиксированные клетки, используя эпифлуоресцентной микроскопа, снабженного дихроичным кубом для пиков возбуждения / испускания 428/536 нм при увеличении 200Х. Align все пластины так, чтобы отступы линия параллельна горизонтальной поля зрения.
Примечание: FITC дихроичных куб хорошо работает.- Захват изображения с ПЗС-камерой и поддержкой программного обеспечения.
- Откройте поддерживающее программное обеспечение для ПЗС-камеры и использовать настройки для автоматической экспозиции. С помощью кнопки «захват» в цифровом приобрести изображение. Сохранить изображение как .tif файлов с помощью кнопки "Сохранить".
2. Адаптация SL-DT анализа для ткани печени
- Удалить около сантиметра кусочек 2 х 2 из левой доли печени от 5 недель, самцы Fischer 344 крыс с использованием рассечение ножницами и поместить его на пластиковую взвешивании плита , покрытая влажной марлей 12.
- Пипетка 0,5 мл раствора ПБС, содержащего 1 мг / мл каждого из Lucifer желтый и родамина-декстрана (РД) на поверхность среза печени в пластике взвешивать пластины.
Примечание: RD представляет собой краситель, который не может пройти щелевых каналов и отметит ячейки, которые были загружены. - Сделать от трех до пяти надрезов длиной около 1 см на поверхности среза печени, который имеет раствор красителя в взвешивании пластины с острым лезвием, а затем добавить дополнительный краситель является достаточным для заполнения надрезы.
- Инкубируйте ткани в течение 3 мин при комнатной температуре на пластиковой взвешивании пластины.
- Промыть три раза с 5 мл PBS.
- Закрепить Ove тканиrnight в 30 мл 10% -ного фосфатно-буферном формалине в 50 мл коническую центрифужную пробирку в темноте при комнатной температуре.
- На следующий день, мыть ломтики с водой, обрезать ткань вокруг разреза с рассечения ножницами в 1 х 1 х 0,5 см 3 полоски , а затем использовать стандартные методы для встраивания ломтики в парафиновой 13.
- Раздел ломти перпендикулярно к линии разреза по толщине 5 мкм и хранить образцы в темноте до готовности быть визуализируют с помощью стандартных методов секционирования с микротома 13.
- Используйте эпифлуоресцентной микроскопа , оборудованного цифровой камерой CCD для визуализации и захвата изображений флуоресцентного красителя фронтов в соответствии с разделом 1.10 7.
3. Количественная GJIC
- Измерьте распространение флуоресцентного красителя с использованием морфометрического пакет программного обеспечения (например, ImageJ).
- Перейдите на вкладку "Файл" и нажмите кнопку "Открыть", чтобы открытьсохраненное изображение.
- Нажмите на кнопку "Free Hand Tool" в панели инструментов Tab, чтобы проследить контур фронта красителя.
- Перейдите на вкладку "Анализ" и нажмите кнопку "Measure".
Примечание: При этом генерируется значение площади разворота листа, который можно скопировать в другие программы распространения листа, если это необходимо.
- С помощью программы работы с электронными таблицами, вычислить долю контроля (ВОК) путем деления площади распространения красителя в экспериментальной пластине области краситель пройденное в контрольной пластине, используя следующее уравнение:
А е = площадь распространения красителя в клетках , подвергнутых экспериментальной переменной, например, клетки , обработанные химическим веществом при определенной дозе или во времени
А С = площадь распространения красителя в контроле, которые являются клетки , обработанные транспортное средство , используемое для растворения химический интерес
Примечание: Для определения влияния транспортного средства,А е будет площадь распространения красителя в клетках , обработанных транспортным средством и С будет площадь распространения красителя в клетках , не обработанных транспортным средством. Влияние транспортного средства предпочтительно должно быть менее 10%.
- Захват изображения с ПЗС-камерой и поддержкой программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Прерывание GJIC широко используется в качестве биомаркеров для идентификации токсичных соединений на nongenotoxic, эпигенетической уровень контроля гена , который вызывает неблагоприятные последствия для здоровья 14. Например, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) вездесущи загрязнители окружающей среды , но различаются по их эпигенетическими токсичностью в зависимости от их молекулярных структур 15. Нижние ПАУ молекулярная масса обычно находятся на относительно более высоких концентрациях , чем выше ПАУ молекулярного веса во многих различных средах , таких как загрязненных речных отложений к тому , что от сигаретного дыма 15,16. Фенантрен является примером веса PAH низкой молекулярной, которые обладают тремя бензольных кольца с угловым карманом называется областью бухты. Рисунок 2 представляет собой серию SL-DT изображений WB-F344 эпителиальных клеток печени крыс , получавших с увеличением дозы фенантрена. Обратите внимание на уменьшение миграции Oе флуоресцентным красителем, Lucifer желтый, с увеличением дозы. Области сканированных изображений может быть определена как часть контроля (ВОК). Контроль за фиг.2 , являются клетки , обработанные растворителем , что ФАГ растворяли в, а именно ацетонитрил. Обычно эксперименты SL-DT производятся в двух или трех повторностях для каждого испытания с минимум трех независимых испытаний для каждого экспериментального параметра, которое было бы доза в этом эксперименте. Значения FOC могут быть усреднены, статистический анализ, а затем рентгенографического (смотри рисунок 3).
Подобные эксперименты также обычно проводит для установления времени для токсиканта-индуцированного ингибирования GJIC, а период времени, необходимый для восстановления после этого токсиканта-индуцированного ингибирования GJIC после того, как клетки переносят в токсиканта среде без. Рисунок 4 показывает , как время отклика и восстановления от ингибирования по фенантрена (Phe). Анализ SL-DT также могут быть использованы для определения лежащих в основе механизмов , с помощью которых токсикант и токсинов dysregulate GJIC 4,16. Это делается с помощью предварительно инкубирование клеток с фармацевтическим ингибитором выбранного сигнального пути до добавления токсиканта или токсина, который dysregulates GJIC. не Если токсикант или токсин, больше не dysregulates GJIC в присутствии выбранного фармацевтического препарата, который блокирует сигнальный путь, то этот путь определяется быть регуляторным путем из GJIC, в то время как такие пути могут быть исключены, если ядовитая продолжает dysregulate GJIC. На рисунке 5 демонстрирует этот принцип , в котором 1-метилантрацен (1-MEA), еще три кольчатых ФАГ , который ингибирует GJIC, но не в присутствии D609, который является довольно специфическим ингибитором фосфатидилхолина специфической фосфолипазы C (PC-PLC). Таким образом, PC-PLC управляет в качестве кандидата сигнализации фермента, участвующего в 1-MEA-индуцированного ингибирования GJIC. Роль PC-PLC была подтверждена с Further экспериментирование 4,16. В целом, SL-DT анализы вполне способствует, чтобы начать процесс картирования сигнальных сетей, участвующих в механизмах, как токсиканты и токсины ингибируют (dysregulate) GJIC. Этот подход также может быть использован для скрининга натуральных продуктов, которые могут блокировать токсиканта или токсин из dysregulating GJIC. Например, ресвератрол, антиоксидант найден в высоких концентрациях в красном вине и продукты арахиса может предотвратить 1-MEA от ингибирования GJIC (рисунок 6).
Анализ SL-ДТ был адаптирован к срезах тканей у животных, в частности , в печени 17. Перфтороктановой кислоты (PFOA) представляет собой 8-углеродную фторируется жирная кислота , которая является стойким загрязнителем окружающей среды , как известно, вызывают раковые заболевания печени 12,17. С помощью метода SL-DT PFOA было показано, ингибирует GJIC в экстракорпоральное WB-F344rat модель печени системы 18. В естественных условиях последующие исследования Determined , что PFOA также ингибирует GJIC в печени крыс , обработанных F344 с PFOA, что подтверждает систему 12,17 модели в лабораторных условиях . Рисунок 7 флуоресцентные изображения из этого дополнительного эксперимента , показывающие распространение красителя в тканях печени крыс , обработанных с транспортным средством и PFOA.
Рисунок 1: Мультфильм изображение стадии скальпель загрузки красителя. Иллюстрация, показывающая, что процесс скальпель нагрузка включает прокатку лезвие, а не горизонтально, нарезка через клетки, чтобы свести к минимуму повреждения клеток.
Рисунок 2: Типичные флуоресцентные микроскопические изображения красителя распространяться через щелевые контакты. WB-F344 печени крысы эпителиальные клетки обрабатывали в течение 15 мин с вбиговки дозы фенантрена, распространенной PAH встречаются в окружающей среде. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Доза ответа кривая фенантрена обработанного WB-F344 печени крыс эпителиальных клеток. Области SL-DT изображения были вычислены и затем приводится в виде доли контроля, которые были клетки, обработанные наполнителем (ацетонитрил). Каждая точка данных представляет собой среднее из трех независимых экспериментов и планки погрешностей являются стандартные отклонения при 95% доверительном интервале для каждой дозы после времени выдержки 15 мин. Четыре параметра логистическая функция была использована, чтобы соответствовать линии, проходящей через точки данных. Пожалуйста Cliск здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Время и время отклика кривой восстановления фенантрена обработанного WB-F344 печени крыс эпителиальных клеток. После того, как полное ингибирование GJIC через 10 мин экспозиции, среда, содержащая фенантрена (Phe) переключали на Phe-свободной среде, а затем клетки наблюдали на восстановление после торможения. Области SL-DT изображения были вычислены и затем приводится в виде доли контроля, которые были клетки, обработанные наполнителем (ацетонитрил). Каждая точка данных представляет собой среднее из трех независимых экспериментов и планки погрешностей стандартные отклонения на 95% доверительного предела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
her.within-страница = "1"> 
Рисунок 5: Ингибирование GJIC 1-метилантрацен зависит от конкретных фосфатидилхолин фосфолипазы C. 1-метилантрацен (1-MEA) является распространенным ПАУ в окружающей среде обнаруживается. На левой панели представляют собой клетки, обработанные наполнителем (ацетонитрил, 0,35% об / об). Средняя панель представляет WB-F344 печени крысы эпителиальные клетки, обработанные в течение 15 мин с 70 мкМ 1-MEA. На правой панели представляют собой клетки предварительно обработанных в первую в течение 20 минут с 50 мкМ D609, фосфатидилхолин специфического ингибитора фосфолипазы С с последующим добавлением 70 мкМ 1-MEA в течение еще 15 мин. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
281fig6.jpg "/>
Рисунок 6: Ресвератрол предотвратить ингибирование GJIC 1-метилантрацен. На левой панели представляют собой клетки, обработанные наполнителем (ацетонитрил, 0,35% об / об). Ресвератрол является антиоксидантом, содержится в красном вине и продукты арахиса. Средняя панель представляет собой клетки, обработанные в течение 15 мин с 70 мкМ 1-MEA. Правая панель представляет собой клетки, в первую очередь предварительно обрабатывают в течение 20 мин с 50 мкМ ресвератрола с последующим добавлением 70 мкМ 1-MEA в течение еще 15 мин. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Ex естественных условиях SL-DT анализы GJIC в срезах печени от самцов F-344 крыс. Левая панель представляет собой кусочек TISS печениUE от крыс, обработанной контрольным носителем, диметилсульфоксид, в течение 24 часов. Правая панель представляет собой кусочек ткани печени у крыс после внутрибрюшинного введения 100 мг / кг перфтороктановой кислоты (ПФОК) через 24 часа. PFOA, превалирующей окружающей среды загрязнителем, является опухоль содействия пролиферации пероксисом , который индуцирует гепатомегалия и продемонстрировал блокировать щелевые соединения с использованием модели в лабораторных условиях . Разрез загружены красителя было сделано на срезах печени от автомобиля и PFOA обработанных животных, которые затем были фиксированными, отделанные и секционного. Воспроизводится по экологической перспективы здравоохранения 12. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ SL-DT представляет собой простой и универсальный метод измерения GJIC, но есть несколько важных проблем, которые должны быть учтены при разработке соответствующих экспериментальных протоколов. Для получения надежных измерений GJIC с помощью анализа SL-DT должно быть хорошее распространение красителя из LY через щелевые контакты клеток. Как минимум, достаточное время должно быть выбрано, чтобы гарантировать, что краситель распространяется через восемь или более рядов ячеек из скальпель загружены клеток в обоих направлениях. Кроме того, для удобства измерения расстояния, что краситель мигрировали из скальпелей загружены клеток, выбрать коэффициент увеличения, который гарантирует распространение красителя контрольных пластин заполняет 70 до 90% поля зрения. Для WB-F344 эпителиальные клетки печени крысы, три минуты инкубации с раствором LY достаточно для фронта красителя, чтобы выйти за пределы четырех рядов клеток, а также увеличение 200Х является оптимальным. Клетки выращивают на пластинах диаметром 35 мм, что вполне исправимо к loadiнг красителя в клетки с помощью скальпеля. Тем не менее, клетки могут быть выращены в небольших скважинах, но использование скальпелем не представляется возможным, в частности, в 96-луночные планшеты для культуры. Для небольших скважин, используйте небольшой круглый наконечником режущей кромки, который может поместиться в колодец, и снова использовать прокатный действие. Это действие прокатки является важным шагом, поскольку это является минимально инвазивной и обеспечивает очень чистую линию нагрузки, которая предотвращает клетки от разрывается и создавая большой бесклеточной разрыв типичный оригинального метода очищающего. В качестве альтернативы, иглоукалывание игла может быть использован, в котором небольшое скручивание иглы делает хорошую работу красителем в клетки.
Другие типов клеток могут быть использованы в данном анализе. Тем не менее, выбор ячеек и понимания роли GJIC в определенном типе клеток играет важную роль в обрамление соответствующих гипотез и проектирование экспериментов. Первый и самый очевидный шаг заключается в разработке условий культивирования клеток, в которых функциональные щелевые соединения являются ExpresSED. В хорошо дифференцированных типов клеток, которые выполняют специфические метаболические функции, щелевые соединения, как правило, играют роль в координации метаболических путей между смежными клетками. Хорошо дифференцированные типы клеток ограничены, если таковые имеются, пролиферативные возможности и каналы, вероятно, играют ткани специфическую метаболическую роль, которая часто зависит от морфологии и специфическим расположением клеток. Например, кардиомиоцитов являются удлиненные клетки, где щелевые соединения преимущественно выровненные интеркалированных дисков, таким образом, используя метод SL-DT потребует выравнивания клеток, которые могут быть сделаны в рифленой тарелке. Таким образом, тщательные соображения должны быть сделаны для каждого типа клеток. Исследования с использованием нейронных клеточных культур, как правило, не сливающийся, а также требуют особых точек контакта, что делает использование неприемлемое и альтернативных GJIC анализов SL-DT должен быть использован.
В пролиферативных типах клеток, таких как стволовые и ранние клетки-предшественники, GJIC играет более важную рольв координации ячейки сигнальных событий, которые контролируют экспрессию генов, регулирующее митогенные события. Эпителиальные клетки печени крысы WB-F344, используемые в настоящем протоколе попадает в эту категорию. Гены щелевых имеют решающее значение в процессе развития и поддержания тканей 19-21. Несмотря на то, щелевых каналов выражены и сформированы на всех поверхностях мембраны клеток плазмы, пролиферативные клетки очень чувствительны к факторам роста, которые ингибируют GJIC. Критические соображения для пролиферативных клеточных типов, как правило, ориентированы более на состав средств массовой информации. Факторы роста часто в избытке, в частности, в неопределенной среде, содержащей эмбриональной бычьей сыворотки, а клетки "щелевые соединения могут находиться в закрытом состоянии. Самый простой способ установить GJIC в этих клетках, чтобы уменьшить или удалить сывороточные уровни для 4 до 24 часов до того эксперимента, хотя 24 часа в сутки было бы слишком долго для клеток, без сыворотки, как они будут Apoptose. Эпителиальные клетки WB-F344 печени, используемые для экспериментов, представленных в тего работа не слишком чувствительны к сывороточным без необходимости снижения уровней в сыворотке. В противоположность этому , эксперименты с использованием С10 клеточной линии мыши должен быть в первую сыворотку лишен установить GJIC 22. Несмотря на то, что уровни различаются между двумя типами клеток, что интересно, клетки C-10 ответили очень аналогично метиловых изомеров антрацена 22,23.
Другие соображения качества результатов включают проведение экспериментов на не-цитотоксических дозах. Клетки должны быть проверены с фазовой контрастной микроскопии, чтобы определить здоровые морфологические особенности, ожидаемые от типа клеток до и после лечения. Для того, чтобы гарантировать, что эффекты соединения на функцию щелевых не из-за общей цитотоксической реакции, цитотоксичности для каждого соединения должно быть сделано в то же время и доза, используемая в анализе SL-DT. Проведение экспериментов с целью определить, является ли ингибирующий эффект соединения на GJIC обратима также хороший эксперимент, по крайней мере, по двум причинам. MoST тестируемые соединения обратимо ингибируют GJIC, но если нет восстановление GJIC, то цитотоксичность может быть потребуется фактором и дальнейшее тестирование. Однако, если GJIC восстанавливается затем дозу и время испытания, вероятно, были не цитотоксическим. Есть биологические последствия для обратимого ингибирования GJIC. Отрицательное воздействие на здоровье многих экологических и пищевых токсинов и токсинов является обратимым процессом. Поэтому понимание этого обратимость на молекулярном уровне имеет важное значение. Если неизвестное соединение не обратимо ингибирует GJIC, то последствия для здоровья организма может быть довольно сильно отличается от большинства других агентов и должна быть частью расчетов риска.
Определение дозы и времени, необходимого для ингибирования GJIC является повторяющимся процессом. Чтобы сэкономить время и деньги для поставок культуры, лучший подход должен начаться при высокой дозе, которая зависит от растворимости и времени (как правило, через час, так как большинство торможенияпроисходит менее чем за 15 минут), а затем сократить время и дозу наполовину мудром процесса шаг, пока не будет никакого эффекта. Если нет никакого ингибирования при высокой дозе в течение часа, а затем два раза период времени в благоразумному Стадию. Первоначальные эксперименты можно сделать на одной пластине. После того, как общие оценки времени и дозы устанавливаются, а затем более тщательного исследования могут быть эффективно разработаны с соответствующими размерами выборки для статистического анализа. Одна экспериментальная функция, конструкция будет использовать дозу и время, которые достигают 75% ингибирования до 100. Очевидно, что окончательное интерпретации результатов будет фактором из указанных выше параметров. Тем не менее, сначала определяют биологический эффект, даже если доза и время не могут быть актуальны в естественных условиях, установленные дозы могут играть определенную роль в ситуациях профессионального облучения, или общих популяций , подвергшихся воздействию других факторов , которые также влияют на GJIC с потенциальной добавкой или синергетические эффекты.
Ингибирование GСИК большинство соединений, как правило, не сильно варьирует и 2:58 повторностей (каждой повторности будет культуральный планшет или хорошо) достаточно для создания кривых зависимости реакции от дозы и времени. Однако, если изменчивость высока, то больше повторности будет необходимо, чтобы получить точное значение для данной зависимой переменной одного независимого суда. Конечно же, по крайней мере, три независимые испытания должны быть сделаны для статистического анализа.
Простота этого анализа и оценки значительных размеров популяций клеток является преимуществом для многих приложений. Это особенно полезно во многих токсикологических оценок. Тем не менее, существуют ограничения СР-DT анализов, которые могут зависеть от нескольких факторов. Одним из них является ли этот метод подходит к клеткам исследуемого. Этот анализ не будет хорошо работать для клеток, которые не достигают высоких слитности с спорадических контактов по всей культуре пластины или хорошо. Альтернативные методы, такие как микроинъекции должны быть совместноnsidered. В качестве альтернативы, для анализа SL-DT может быть изменен. Успех в загрузке отдельных клеток было достигнуто с акупунктурной иглой, которая требует слабое действие вращательным при загрузке красителя 7. Распространение красителя будет радиальное в более сливающихся ситуациях или аморфный через культуру клеток с спорадических контактов клеток. Добавление родамина декстрана (RD, 1 мг / мл) в раствор красителя LY рекомендуется для экспериментов, где определение загруженных клеток было бы трудно без маркера (например, как RD). RD слишком велик, чтобы пройти через щелевых каналов, таким образом, определить, какие клетки были загружены. РД также может быть использован во всех SL-DT анализе, но скальпель оставляет углубление на дне чашки, идентифицирующей, где клетки погружали. Анализ SL-ДТ также не способствует измерения изменений в GJIC между различными типами клетки как красителем не будет проводиться различие между типами клеток. Опять микроинъекции является методом выбора, но метод МИГ акупунктуры иглыХТ также работать, если можно настроить таргетинг на конкретную ячейку с помощью микроскопа.
Анализ метаболического сотрудничества является еще одним методом для измерения GJIC. Этот метод был одним из первых стандартизированных биопроб для GJIC 24. В этом анализе, дикого типа клеток V79 китайского хомячка (6-тиогуанину-чувствительные) и 6-тиогуанину-резистентные клетки культивировали при высокой плотности, в которых 6-тиогуанин (6-TG) резистентные клетки не метаболизуют 6-TG в токсичный метаболит, таким образом, придающий устойчивость. Совместное культивирование с 6-TG чувствительных клеток приводит к передаче токсического метаболита через щелевые контакты, что приводит к гибели клеток, где ингибирование результатов GJIC в спасении 6-TG резистентных клеток, предотвращая передачу токсичных 6-TG метаболита от чувствительных клеток 6-TG. Хотя преимуществом этого анализа является то, что она является минимально инвазивной, основным недостатком является то, что она требует одной недели для завершения, что делает обширные дозы и зависящих от времени оценок ТОКСИканты, а также механистические исследования и т.д. непрактичные для оценки многих химических веществ.
Анализ SL-DT не способствует механистических исследований, которые должны проследить миграцию красителей с помощью различных типов клеток, в которых микроинъекции является предпочтительным методом. В качестве альтернативы, клетки могут быть предварительно загружены с метиловым эфиром флуоресцентных красителей. Загрузку красителя является функцией внутриклеточных метильных эстеразы, которые гидролизуют липофильный краситель в его более гидрофильным форме, таким образом, захват красителя в клетках. Это менее инвазивный способ предварительной загрузки флуоресцентного зонда, но наиболее распространенным способом для измерения межклеточной коммуникации , где все клетки предварительно загружены с помощью этого метода является анализ FRAP 11. Преимущество FRAP снова способность оценивать щелевые контакты в одиночных камерах, который отлично подходит для механистических исследований. Однако недостаток FRAP заключается в: неспособность измерить популяции клеток для токсикологических оценок,потребность в сложных и очень дорогих микроскопов / лазерных цитометрами, потребность в высококвалифицированной технической экспертизы, умеренно инвазивный от свободных радикалов, образующихся лазером, и не способствует высокой пропускной способности.
Совсем недавно другая методика была разработана; локальная активация метода молекулярного флуоресцентного зонда (LAMP) 25, которая основана на новом поколении проарретированных кумарин-подобных флуорофоров. По аналогии с анализом FRAP, все клетки с предустановленными красители, содержащие метиловый эфир, однако, эти красители становятся флуоресцентный при последующем локализованном освещении лазерами с небольшой дозой ультрафиолетового света, которая, вероятно, производит значительно более низкие, чем ROS FRAP. Опять же, этот метод имеет те же ограничения анализа FRAP. Другие недавние достижения для измерения GJIC являются предзагрузку и парашютная методы, которые также связаны с использованием метилового эфира-флуоресцентных красителей. Методика предзагрузка включает суспендированиеклетки предварительно загружены с флуоресцентным зондом вместе с выгруженных коллегами и затем высевали и позволили сформировать сливающийся монослой. Распространение красителя затем можно наблюдать с помощью микроскопа эпифлуоресцентной 26. В анализе парашютной клетки поджат с флуоресцентным зондом накладываются друг на друга на монослой разгруженных клеток, а также распространение красителя наблюдается с эпифлуоресцентной микроскопом 27. Опять же, приведенные выше методы являются технически более сложным для анализа с высокой пропускной способностью, и должна быть немедленно высевают при ближайшем слияния и требует промежутка времени для реплантации клеток.
В целом, анализ SL-DT является относительно недорогой, простой и универсальный метод , который использует оборудование, такие как инкубаторы СО 2 для культивирования клеток, шкафы биологической безопасности и эпифлуоресцентной микроскопом, как правило , можно найти в большинстве лабораторий клеточных культур. С минимальным опытом много пластин могут быть обработаны в день, что способствует Fили скрининга соединений на токсичность, а также для натуральных продуктов, которые предотвращают или полностью изменить эффекты токсикантов и токсинов. Кроме того, адаптируя этот анализ для высокой пропускной способности анализа с использованием робототехники, с помощью автоматизированных систем флуоресцентной микроскопии изображений и анализа будет иметь потенциал на экран большого количества токсикантов и токсинов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
