JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Published: September 27, 2016
doi:
10.3791/54300
, ,
1Department of Plant Sciences,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon,University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Abstract

Son on yıl içinde, sinyal transdüksiyon yollarının, transkripsiyonel düzenleyici ağlar, gen ekspresyonu, genom düzenleme ve gen sessizleştirme analizi için, tür kırpmak için örnek türlerin arasında değişen bitki protoplastlarına kullanımında bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, önemli bir ilerleme bitki genomik için bu sistemlerin kullanımında bile daha fazla ilgi üretti protoplast bitkilerin rejenerasyonu, ilerleme kaydedilmiştir. Bu çalışmada, bir protokol bir robot platformu kullanılarak bir "açık san '2 (x 2), tütün süspansiyon kültüründen protoplast izolasyon ve dönüşüm otomasyonu için geliştirilmiştir. dönüşüm yöntemleri Karnabahar mozaik virüsü 35S promoteri (35S) kontrolü altında portakal renkli bir floresan protein (OFP) raportör geni (pporRFP) kullanılarak doğrulanmıştır. protoplastlarda OFP sentezleme epifloresans mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Analizler aynı zamanda propidiu kullanarak protoplast üretim verimliliği yöntemleri dahilm iyodür. Son olarak, düşük maliyetli bir yiyecek cinsi enzimler maliyet açısından çok pahalı protoplast izolasyon ve analizi otomatik yüksek verimli olan laboratuvar dereceli enzimler gerektiren gereksinimin ortadan kaldırılmasının, protoplast izolasyon prosedürü kullanılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen protokolüne göre, dönüşüm, protoplast izolasyon bütün yöntemi operatörün herhangi bir giriş olmadan 4 saat altında yapılabilir. Bu çalışmada geliştirilen protokol BY-2 hücre kültürü ile doğrulandı iken, prosedürler ve yöntemler ekin genomik araştırma ivmesini etkinleştirmeniz gerekir herhangi bir bitki süspansiyon kültürü / protoplast sistemine çevrilebilir olmalıdır.

Introduction

Son yıllarda, bitkisel beslenme 6 bilmek biyokütle verimi 7 geliştirmek, ve hücre duvarı rekalsitrantların azaltmak kuraklık 3,4 ve tuz tolerans 5 iletmektedir, herbisite karşı direnç 2 kavuşturulması, çeşitli hastalıkların 1 üstesinden gelmek için transgenik bitkileri tasarım yerleştirilen önemli ivme olmuştur 8. Bu eğilim dsRNA 10, miRNA 11 ve siRNA 12 üzerinden susturma CRISPR ve Talens 9 kullanarak genom düzenleme ve gen dahil olmak üzere transgenik bitkiler, üretmek için yeni moleküler araçlar geliştirilmesi ile yardım görmüştür. Bu teknolojilerin transgenik bitkilerin üretimini basitleştirilmiş olsa da, onlar da transgenik bitkilerin çokluğu bitki rejenerasyonu güveniyor geleneksel sistemler kullanılarak taranabilir olamaz oluşturulan bir darboğaz oluşturduk. Birçoğu susturma ve genom düzenleme konstruktları hızlı bitkilere sokulabilir ise, bu dar ilişkinhedeflenen özellikleri bitkiler serada analiz kadar sık ​​tespit edilmez arzu edilen etkiyi üretmek için başarısız olur. Bu çalışmada, özellikle hedef susturulması genom düzenleme ve genin çok sayıda erken tarama mevcut darboğaz gidermek için, bitki protoplast hızlı, otomatik, yüksek verimli tarama için bir yöntem geliştirdik.

sağlam bitki hücrelerine karşı protoplast kullanımı, otomatik bir platformun geliştirilmesi için pek çok avantajı vardır. İlk olarak, protoplastlar, bitki hücre duvarının sindirilmesinden sonra izole edilir, ve bundan sonra, bu, bu bariyer, dönüşüm etkinliği 13 arttırılır. Sağlam bitki hücrelerinde 14 ve Agrobacterium aracılı transformasyon 15 Biolistics transformasyonu için sadece iki yaygın olarak kullanılan yöntemler vardır. biyolistik TRANSFO için özel ekipman gerektirir olarak bu yöntemlerin hiçbiri kolayca sıvı taşıma platformları tercüme edilebilirım, Agrobacterium ise aracılı transformasyon ko-kültür ve bakterilerin sonraki çıkarılmasını gerektirir. Ne yüksek verimli yöntemleri için uygundurlar. Protoplast durumda, dönüşüm rutin ancak birkaç çözeltisi değişimini gerektiren ve ideal olarak sıvı kullanım platformlar için uygundur, polietilen glikol (PEG) aracılı transfeksiyon 16 kullanılarak yapılır. İkinci olarak, protoplastlar, tanımı gereği, tek hücre kültürleri, ve böylece bitki hücresi kültürlerinde topaklanma ve zincir oluşumu ile bağlantılı problemler, protoplastlarda gözlenmez. Bir plaka bazlı spektrofotometre hücre topaklanma kullanılarak süratle taranması açısından ya da birden çok sayıda düzlemde hücre tutarlı ölçümler elde zorluk yol açacaktır. protoplastlar kendi kültür ortamı daha da yoğun oldukları için, plaka tabanlı spektrofotometresi için elverişli bir tek tabaka oluşturan, kuyu dibine tortu. Son olarak, bitki hücre süspansiyon kültürleri Primar ikenily kallustan 17 türetilmiş, protoplastlar dokuya özgü ifade tespit etmek potensitesi, bitki dokularının bir dizi hasat edilebilir. Örneğin, özelliği fenotipi tahmin için çok önemli olabilir kök veya bir genin yaprağa özel ifadesini analiz etmek. Bu nedenlerle, bu işin geliştirilen protokol yaygın olarak kullanılan tütün (Nicotiana tabacum L.) parlak sarı bir '2 (x 2) süspansiyon kültüründen izole edilen protoplastlardan kullanılarak doğrulanmıştır.

X 2 süspansiyon kültürü, bitki hücrelerinin 18 moleküler analizlerde her yerde kullanımı sayesinde, daha yüksek bir bitki ", HeLa" hücre olarak tanımlanmıştır. Son zamanlarda, BY-2 hücreleri bitkinin etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur hücre içi protein lokalizasyonu 23,24 ve bitki biyolojisinde bu kültürlerin geniş bir kullanım gösteren temel hücre biyolojisi 25-27, 19-22 Stresörler. X 2 kültürlerin ilave bir avantajı, birGen ifadesi için geliştirilmiş tekrarlanabilirlik yol açabilir, aphidicolin ile kültürleri senkronize yeteneği 28 inceler. Ayrıca, araştırılan yöntemler, geleneksel protoplastlar üretilmesi için kullanılan enzimler, maliyeti yüksek olan sistemlerin için engelleyici olarak, düşük maliyetli enzimler 29,30 kullanarak-2 protoplast çıkarılması için geliştirilmiştir. Bu nedenle, aşağıda açıklanan protokol BY-2 süspansiyon kültürü kullanılarak valide edilmiş, ancak herhangi bir bitki hücre süspansiyonu kültürüne amendable olmalıdır. Korumalı kavram deneyleri sabit Poritesin turuncu bir flüoresan proteini (OFP) raportör geni (pporRFP) CaMV 35S promoterinin kontrolü altında 31 Porites kullanılarak gerçekleştirilir.

Protocol

Süspansiyon Hücre Kültürleri 1. kurulması BY-2 ortamı PO4 4.43 g Linsmaier ve Skoog bazal ortamı, sukroz, 30 gr, 200 mg KH 2 ekleyerek sıvı hazırlayın ve damıtılmış 200 ug ila 900 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) mi su ve 0.1 M KOH ile pH değeri 5.8'e. pH ayarlandıktan sonra damıtılmış su ve otoklav ile 1000 ml nihai hacim ayarlayın. Ortam, 4 ° C'de 2 hafta kadar saklanabilir. % 1 ilave By-2 ortamı, 250 ml'lik bir Erlenmeyer bir katı İ…

Representative Results

Bu çalışmada, x 2 iki katına çıkma oranı 15 saat bir ortalama hücre döngüsü uzunluğu bir önceki raporlar ile uyumludur kültürleri inkübe edildi sıcaklığa bağımlıdır 14-18 saat arasında değişmiştir. Bu katlama oranı ile, 1: 100 Başlangıç ​​aşı 5-7 günde% 50 bir paketlenmiş hücre hacmi (PCV) kültürlerin neden kültürlerini başlatmak için kullanılmıştır. Kültürler ortam 200 ml içinde büyütülmüştür içinde mevcut protokolde dokunun b?…

Discussion

Yukarıda açıklanan protokol başarıyla protoplast izolasyon, numaralandırma ve dönüşüm BY-2 tütün süspansiyon hücre kültürü kullanarak valide edilmiştir; Ancak, protokol kolayca herhangi bir bitki süspansiyon kültürü için uzun olabilir. Şu anda, protoplast izolasyon ve dönüşüm mısır (Zea mays), 10, havuç (Daucus carota) 32, kavak (Populus euphratica) 33, üzüm (Vitis vinifera) 34, palmiye yağı (Elaeis gui…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Materials

Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4 dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly (ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. . Plant Biology and Biotechnology. , 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Tags

Protoplast IsolationHigh-throughput ScreeningPlant BiotechnologyAutomated Protoplast ProductionProtoplast TransformationBY-2 Suspension CultureMicroplate MoverLiquid HandlerMulti-mode Plate ReaderMulti-mode DispenserPlate HeaterPlate ChillerRobotics SystemPlate Mover SoftwareLabwareContainer TypesStart And End Positions
check_url/54300?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image