ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول
Summary
يوصف منهجية الإنتاجية العالية، الآلي، إنتاج البروتوبلازم التبغ والتحول. النظام الآلي يمكن التعبير الجيني الموازي واسع والاكتشاف في نظام نموذجي BY-2 التي ينبغي أن تكون للترجمة للمحاصيل غير النموذجية.
Abstract
على مدى العقد الماضي كان هناك تجدد في استخدام جبلة مجردة النباتية التي تتراوح بين الأنواع نموذج لاقتصاص أنواع، لتحليل مسارات نقل الإشارة والشبكات التنظيمية النسخي، التعبير الجيني، الجينوم التحرير، والجينات إسكات. وعلاوة على ذلك، تم إحراز تقدم كبير في تجديد النباتات من جبلة مجردة، التي ولدت المزيد من الاهتمام في استخدام هذه النظم لعلم الجينوم المصنع. في هذا العمل، وقد تم وضع بروتوكول لأتمتة العزلة البروتوبلازم والتحول من 2 (BY-2) ثقافة تعليق التبغ "الأصفر الساطع" باستخدام منصة الروبوتية. تم التحقق من صحة إجراءات التحول باستخدام البرتقال ببروتين (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) تحت سيطرة المروج القرنبيط فيروس تبرقش 35S (35S). وأكد التعبير النفط مقابل الغذاء في جبلة مجردة بواسطة المجهر epifluorescence. شملت التحليلات أيضا الأساليب كفاءة الإنتاج البروتوبلازم باستخدام propidiuم يوديد. وأخيرا، تم استخدام منخفضة التكلفة الإنزيمات للمأكولات لإجراء البروتوبلازم العزلة، التحايل على الحاجة إلى مختبر الصف الانزيمات التي هي في الإنتاجية العالية الآلي العزلة البروتوبلازم وتحليل باهظة التكلفة. على أساس بروتوكول المتقدمة في هذا العمل، ويمكن إجراء الإجراء الكامل من العزلة البروتوبلازم إلى تحول في أقل من 4 ساعات، من دون أي مساهمة من المشغل. في حين تم التحقق من صحة بروتوكول المتقدمة في هذا العمل مع ثقافة الخلية BY-2، وينبغي أن تكون الإجراءات والأساليب للترجمة إلى أي ثقافة تعليق مصنع / نظام بروتوبلازمي، والتي ينبغي تمكين تسريع الأبحاث الجينومية المحاصيل.
Introduction
في السنوات الأخيرة كان هناك زخم كبير وضعت على تصميم المحاصيل المعدلة وراثيا للتغلب على الأمراض المختلفة 1، منح مقاومة مبيدات الأعشاب 2، منح الجفاف 3،4 والتسامح الملح 5، ومنع الحيوانات العاشبة 6، وزيادة العائد الكتلة الحيوية 7، وتقليل جدار الخلية عناد 8. وقد ساعد هذا الاتجاه من خلال تطوير أدوات جزيئية جديدة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الجينوم التحرير باستخدام كريسبر وTALENs 9، والجينات إسكات من خلال الرنا المزدوج الجديلة 10، ميرنا 11، وسيرنا 12. في حين أن هذه التقنيات وتبسيط جيل من النباتات المعدلة وراثيا، أنها خلقت أيضا عنق الزجاجة، حيث ولدت العدد الهائل من النباتات المعدلة وراثيا لا يمكن عرضه باستخدام الأنظمة التقليدية التي تعتمد على تجديد مصنع. تتعلق هذه العقبة، في حين إسكات ويبني الجينوم التحرير يمكن إدراج بسرعة إلى النباتات، والعديد منفشلت الصفات التي تستهدف إحداث التأثير المطلوب، والتي غالبا ما تكون غير المكتشفة حتى يتم تحليل النباتات في الدفيئة. في هذا العمل، وقد وضعنا طريقة لسريع وتلقائي وفحص عالية الإنتاجية من جبلة مجردة النبات، وعلى وجه التحديد لمعالجة عنق الزجاجة الحالي في الفحص المبكر أعداد كبيرة من الجينوم التحرير والجينات إسكات الأهداف.
استخدام جبلة مجردة، بدلا من الخلايا النباتية سليمة، لديها العديد من المزايا للتطوير منصة الآلي. أولا، يتم عزل جبلة مجردة بعد هضم جدار الخلية النباتية، ومع هذا الحاجز لم تعد موجودة، وزيادة كفاءة تحويل 13. في الخلايا النباتية سليمة لا يوجد سوى اثنين أساليب راسخة للتحول، biolistics 14 و الأجرعية التحول بوساطة 15. أيا من هذه الأساليب يمكن ترجمتها بسهولة إلى منصات المعالجة السائلة، كما biolistics يتطلب معدات متخصصة لtransformation، في حين الأجرعية التحول بوساطة يتطلب ثقافة مشتركة وإزالة اللاحقة من البكتيريا. ولا هي قابلة لأساليب إنتاجية عالية. في حالة جبلة مجردة، يجري التحول بشكل روتيني باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ترنسفكأيشن بوساطة 16، والتي تتطلب فقط عدة بورصات حل، ويعتبر مثاليا لمنصات المعالجة السائلة. ثانيا، جبلة مجردة، بحكم التعريف، هي ثقافات وحيدة الخلية، وبالتالي فإن المشاكل المرتبطة تشكيل تكتل وسلسلة في مزارع الخلايا النباتية، وليس لوحظ في جبلة مجردة. من حيث الفحص السريع باستخدام مقياس الطيف الضوئي، القائم على لوحة تكتل من الخلايا أو الخلايا في الطائرات متعددة سوف يؤدي إلى صعوبة في الحصول على قياسات متناسقة. منذ جبلة مجردة هي أيضا الأكثر كثافة من وسائل الاعلام ثقافتهم، والرواسب في قاع الآبار، وتشكيل أحادي الطبقة، والتي تفضي للالطيفي القائم على طبق من ذهب. وأخيرا، في حين أن الثقافات تعليق خلية النبات PRIMARالمستمدة إيلي من الكالس 17، جبلة مجردة يمكن حصاده من عدد من الأنسجة النباتية، مما يؤدي إلى القدرة على تحديد التعبير الأنسجة محددة. على سبيل المثال، القدرة على تحليل root- أو التعبير عن ورقة محددة من الجينات يمكن أن تكون هامة جدا للتنبؤ النمط الظاهري. لهذه الأسباب، ولم يتم التحقق من البروتوكولات وضعت في هذا العمل باستخدام جبلة مجردة معزولة عن التبغ تستخدم على نطاق واسع (النيكوتين تبغ L.) "برايت صفراء '2 (BY-2) ثقافة تعليق.
وقد وصفت ثقافة تعليق BY-2 باعتبارها الخلية "هيلا" من النباتات العليا، وذلك بسبب استخدام كل مكان في التحليل الجزيئي للخلايا النبات 18. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت خلايا BY-2 لدراسة الآثار المترتبة على مصنع الضغوطات 19-22، داخل الخلايا البروتين توطين 23،24، وبيولوجيا الخلية الأساسية 25-27 يدل على فائدة واسعة من هذه الثقافات في بيولوجيا النبات. ميزة إضافية لBY-2 الثقافات هيالقدرة على مزامنة مع الثقافات aphidicolin، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعزيز استنساخ للتعبير الجين دراسات 28. وعلاوة على ذلك، تم تطوير طرق لاستخراج BY-2 جبلة مجردة باستخدام أنزيمات منخفضة التكلفة 29،30، والإنزيمات التي تستخدم عادة لتوليد جبلة مجردة باهظة لأنظمة عالية الإنتاجية من حيث التكلفة. على هذا النحو، وقد تم التحقق من صحة البروتوكول هو موضح أدناه باستخدام ثقافة تعليق BY-2، ولكن يجب أن تكون قابلة للتعديل إلى أي ثقافة مصنع التعليق الخلية. وتجرى التجارب إثبات صحة مفهوم باستخدام البرتقال البروتين مضان (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) من Porites المرجانية الصلبة porites 31 تحت سيطرة المروج CAMV 35S.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم التحقق من صحة بروتوكول المذكورة أعلاه بنجاح لعزل البروتوبلازم، والعد، والتحول باستخدام التبغ زراعة الخلايا تعليق BY-2. ومع ذلك، يمكن بسهولة تمديد بروتوكول لأي ثقافة تعليق النبات. في الوقت الحاضر، وقد تم تحقيق العزلة والتحول البروتوبلازم في محطات عديدة، بما في …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Materials
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. . Plant Biology and Biotechnology. , 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
