Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación
Summary
Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.
Abstract
Durante la última década ha habido un resurgimiento en el uso de protoplastos de plantas que van desde especies modelo para recortar las especies, para el análisis de las vías de transducción de señales, redes de regulación transcripcional, la expresión de genes, genoma de edición, y el silenciamiento de genes. Por otra parte, se ha hecho un progreso significativo en la regeneración de plantas a partir de protoplastos, que ha generado aún más interés en el uso de estos sistemas para la genómica de las plantas. En este trabajo, un protocolo ha sido desarrollado para la automatización de aislamiento de protoplastos y la transformación de 2 (A-2) un cultivo en suspensión de tabaco 'amarillo brillante' usando una plataforma robótica. Los procedimientos de transformación se validaron utilizando una proteína fluorescente de color naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) bajo el control del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (35S). expresión OFP en protoplastos se confirmó por microscopía de epifluorescencia. Los análisis también incluyen métodos de eficiencia de producción de protoplastos utilizando propidium yoduro. Por último, se utilizaron enzimas de grado alimenticio de bajo costo para el procedimiento de aislamiento de protoplastos, eludiendo la necesidad de enzimas de laboratorio de grado que son un costo prohibitivo en automatizada de alto rendimiento de aislamiento y análisis de protoplastos. Basado en el protocolo desarrollado en este trabajo, el procedimiento completo de aislamiento de protoplastos a la transformación puede llevarse a cabo en menos de 4 horas, sin ninguna entrada por parte del operador. Mientras que el protocolo desarrollado en este trabajo se validó con el cultivo de células BY-2, los procedimientos y métodos deben ser traducible a cualquier sistema de cultivo en suspensión planta / protoplastos, que debería permitir la aceleración de la investigación genómica de cultivos.
Introduction
En los últimos años ha habido un importante impulso colocado en el diseño de los cultivos transgénicos para superar diversas enfermedades 1, dotar de resistencia al herbicida 2, conferir sequía 3,4 y tolerancia a la sal 5, prevenir herbivoría 6, aumentar la producción de biomasa 7, y disminuir la obstinación pared celular 8. Esta tendencia se ha visto favorecido por el desarrollo de nuevas herramientas moleculares para la generación de plantas transgénicas, incluyendo genoma de edición utilizando CRISPR y Talens 9, y el silenciamiento de genes a través de dsRNA 10, 11 miRNA y siRNA 12. Si bien estas tecnologías han simplificado la generación de plantas transgénicas, también han creado un cuello de botella, donde la gran cantidad de plantas transgénicas generadas no pueden ser examinados utilizando los sistemas tradicionales que se basan en la regeneración de plantas. En relación con este cuello de botella, mientras que el silenciamiento y construcciones de edición de genoma se pueden insertar rápidamente en plantas, muchos de losrasgos específicos no producen el efecto deseado, que a menudo no se descubre hasta que las plantas se analizan en el invernadero. En este trabajo, hemos desarrollado un método para la rápida detección automatizada, y de alto rendimiento de protoplastos de plantas, específicamente para hacer frente al actual bloqueo en la detección precoz de un gran número de genoma de edición y silenciamiento de genes objetivos.
El uso de protoplastos, en oposición a las células vegetales intactas, tiene varias ventajas para el desarrollo de una plataforma automatizada. En primer lugar, los protoplastos se aislaron después de la digestión de la pared celular vegetal, y con esta barrera ya no está presente, la eficiencia de transformación se incrementa 13. En las células vegetales intactas sólo hay dos métodos bien establecidos para la transformación biolística, 14 y transformación mediada por Agrobacterium 15. Ninguno de estos métodos se puede traducir fácilmente a plataformas de manejo de líquidos, como biolística requiere equipo especializado para transfoconfirmación, mientras transformación mediada por Agrobacterium requiere co-cultivo y la posterior eliminación de las bacterias. Tampoco son susceptibles de métodos de alto rendimiento. En el caso de protoplastos, la transformación se lleva a cabo rutinariamente utilizando polietilenglicol (PEG) transfección mediada por 16, que sólo requiere varios intercambios de solución, y es ideal para las plataformas de manejo de líquidos. En segundo lugar, los protoplastos, por definición, son cultivos de una sola célula, y por lo tanto los problemas asociados con la formación de grumos y de la cadena en cultivos de células vegetales, no se observan en los protoplastos. En cuanto a la detección rápida utilizando un espectrofotómetro basado en placas, agrupación de células o células en múltiples planos dará lugar a dificultades en la adquisición de mediciones consistentes. Desde protoplastos son también más denso que su medio de cultivo, que sedimentan en el fondo de los pozos, la formación de una monocapa, que es propicio para la espectrofotometría a base de placa. Por último, mientras que los cultivos en suspensión de células vegetales son primarily derivado de callus 17, los protoplastos se pueden cosechar a partir de un número de tejidos de la planta, dando lugar a la capacidad de identificar la expresión específica de tejido. Por ejemplo, la capacidad de analizar Raíz o expresión de hoja específica de un gen puede ser muy importante a la predicción fenotipo. Por estas razones, los protocolos desarrollados en este trabajo se validaron utilizando protoplastos aislados del tabaco utilizado ampliamente (Nicotiana tabacum L.) 2 (A-2) cultivo en suspensión 'amarillo brillante'.
El cultivo en suspensión BY-2 se ha descrito como la célula "HeLa" de las plantas superiores, debido a su uso ubicuo en el análisis molecular de las células vegetales 18. Recientemente, AP-2 células se han utilizado para estudiar los efectos de los factores de estrés vegetal 19-22, intracelular localización de la proteína 23,24, y la biología celular básica 25-27 demuestra la amplia utilidad de estas culturas en biología vegetal. Una ventaja adicional de la AP-2 culturas es lacapacidad de sincronizar los cultivos con afidicolina, que puede conducir a la reproducibilidad mejorada para la expresión génica estudia 28. Además, se han desarrollado métodos para la extracción de BY-2 protoplastos usando enzimas de bajo coste 29,30, como enzimas utilizadas tradicionalmente para generar protoplastos son costo prohibitivo para los sistemas de alto rendimiento. Como tal, el protocolo descrito a continuación ha sido validado con el cultivo en suspensión BY-2, pero debe ser modificable a cualquier cultivo en suspensión de células vegetales. Experimentos de prueba de concepto se realizan utilizando una proteína de la fluorescencia naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) de los Porites de coral Porites duros 31 bajo el control del promotor CaMV 35S.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito anteriormente ha sido validado con éxito para el aislamiento de protoplastos, enumeración, y la transformación mediante el cultivo de células de tabaco suspensión BY-2; Sin embargo, el protocolo puede ampliarse fácilmente a cualquier planta de cultivo en suspensión. En la actualidad, el aislamiento de protoplastos y la transformación que se ha logrado en numerosas plantas, incluido el maíz (Zea mays) 10, la zanahoria (Daucus carota) 32, el álamo <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Materials
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
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