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Genetics

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Published: September 27, 2016
doi:
10.3791/54300
, ,
1Department of Plant Sciences,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon,University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.

Abstract

Durante a última década tem havido um ressurgimento do uso de protoplastos vegetais que variam de espécie para espécie vegetal modelo, para análise de vias de sinal de transdução, redes reguladoras da transcrição, a expressão do gene, genoma, e de edição de gene silenciador. Além disso, o progresso significativo tem sido feito para a regeneração de plantas a partir de protoplastos, o que tem gerado ainda mais o interesse na utilização destes sistemas para genoma das plantas. Neste trabalho, um protocolo tem sido desenvolvido para a automatização de isolamento de protoplastos e transformação de cultura em suspensão de tabaco um 'amarelo brilhante' 2 (A-2), utilizando uma plataforma robótica. Os procedimentos de transformação foram validados utilizando um gene repórter da proteína fluorescente laranja (OFP) (pporRFP) sob o controlo do promotor 35S do mosaico da couve-flor vírus (35S). OFP expressão em protoplastos foi confirmada por microscopia de epifluorescência. As análises também incluiu métodos de eficiência de produção de protoplastos usando propidium iodeto. Finalmente, as enzimas de grau alimentar de baixo custo foram usadas para o procedimento de isolamento de protoplastos, evitando a necessidade de enzimas laboratório-grade que são um custo proibitivo em high-throughput automatizado isolamento de protoplastos e análise. Com base no protocolo desenvolvida no presente trabalho, o procedimento completo de isolamento de protoplastos para transformação pode ser realizada em menos de 4 horas, sem qualquer entrada a partir do operador. Embora o protocolo desenvolvido neste trabalho foi validado com a cultura de células A-2, os procedimentos e métodos podem ser traduzidas a qualquer sistema de cultura em suspensão planta / protoplasto, o que deverá permitir a aceleração da pesquisa genómica de culturas.

Introduction

Nos últimos anos tem havido um impulso significativo colocado sobre a concepção de culturas transgênicas para superar várias doenças 1, dotar resistência a herbicida 2, conferem seca 3,4 e tolerância ao sal 5, evitar herbivoria 6, aumentar a produção de biomassa 7, e diminuir a recalcitrância da parede celular 8. Esta tendência foi ajudada pelo desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para a geração de plantas transgénicas, incluindo genoma de edição utilizando CRISPR e TALENS 9, e silenciamento de genes por meio de ARNcd de 10, 11 miARN, e ARNsi 12. Embora estas tecnologias simplificaram a geração de plantas transgênicas, eles também criaram um gargalo, onde o grande número de plantas transgénicas gerada não podem ser rastreados usando sistemas tradicionais que dependem de regeneração de plantas. Relacionado com este gargalo, enquanto que o silenciamento e de edição de genoma construções podem ser rapidamente inserido em plantas, muitos doscaracterísticas visadas não conseguem produzir o efeito desejado, o que muitas vezes não é descoberto até que as plantas são analisados ​​na estufa. Neste trabalho, nós desenvolvemos um método para o rápido rastreio automatizado, de alto rendimento de protoplastos de plantas, especificamente para lidar com o gargalo de corrente no rastreio inicial de um grande número de genoma de edição e silenciamento de genes alvos.

O uso de protoplastos, em oposição às células de plantas intactas, tem várias vantagens para o desenvolvimento de uma plataforma automatizada. Em primeiro lugar, os protoplastos são isolados após a digestão da parede celular de plantas, e com isso já não presente barreira, a eficiência de transformação é aumentada 13. Nas células vegetais intactas há apenas dois métodos bem estabelecidos para a transformação biolística, 14 e 15 de transformação mediada por Agrobacterium. Nenhum desses métodos podem ser facilmente convertidos para plataformas de manipulação de líquidos, como biolistics exige equipamento especializado para transformação, enquanto transformação mediada por Agrobacterium requer a co-cultura e a subsequente remoção das bactérias. Nem são passíveis de métodos de alto rendimento. No caso de protoplastos, a transformação é realizada rotineiramente utilizando polietileno-glicol (PEG) a transfecção mediada por 16, que só requer várias trocas de solução, e é especialmente adequado para plataformas de manipulação de líquidos. Em segundo lugar, os protoplastos, por definição, são as culturas de uma única célula, e assim os problemas associados com a acumulação e a formação da cadeia em culturas de células de plantas, não são observados em protoplastos. Em termos de rastreio rápida utilizando um espectrofotómetro de placa-base, a aglutinação de células, ou células em planos múltiplos irá conduzir a dificuldade em adquirir medições consistentes. Uma vez que os protoplastos são também mais denso do que o seu meio de cultura, eles sedimentar para o fundo dos poços, a formação de uma monocamada, o que é favorável para espectrofotometria à base de chapa. Finalmente, enquanto que as culturas em suspensão de células de plantas são Primarily derivado do calo 17, os protoplastos podem ser colhidas a partir de uma série de tecidos de plantas, conduzindo-se à capacidade para identificar a expressão específica de tecido. Por exemplo, a capacidade de analisar raiz- ou expressão específica de folha de um gene pode ser muito importante para a predição fenótipo. Por estas razões, os protocolos desenvolvidos neste trabalho foram validados utilizando protoplastos isolados do tabaco amplamente utilizado (Nicotiana tabacum L.) cultura em suspensão "amarelo brilhante" 2 (BY-2).

A cultura em suspensão BY-2 foi descrito como a célula "HeLa" de plantas superiores, devido ao seu uso disseminado em análise molecular de células de plantas 18. Recentemente, BY-2 de células têm sido usadas para estudar os efeitos da planta estressores 19-22, localização da proteína intracelular 23,24, biologia celular e de base 25-27 demonstrando a ampla utilidade destas culturas na biologia das plantas. Uma vantagem adicional de a-2 é a culturascapacidade para sincronizar as culturas com afidicolina, que pode levar a reprodutibilidade melhorada para a expressão do gene 28 estuda. Além disso, têm sido desenvolvidos métodos para a extracção de 2-POR protoplastos utilizando enzimas de baixo custo 29,30, como as enzimas utilizadas tradicionalmente para gerar protoplastos são de custo proibitivo para sistemas de alto rendimento. Como tal, o protocolo descrito abaixo foi validado usando a cultura em suspensão BY-2, mas deve ser modificável com qualquer cultura em suspensão de células de plantas. Experimentos de prova de conceito são realizadas utilizando um gene repórter da proteína de fluorescência laranja (OFP) (pporRFP) a partir dos Porites de coral Porites rígidos 31 sob o controlo do promotor CaMV 35S.

Protocol

1. Estabelecimento de culturas de células em suspensão Prepara-líquido, por 2 meios adicionando 4,43 g Linsmaier e Skoog, meio basal de 30 g de sacarose, 200 mg de KH 2 PO 4, e 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 mL de água destilada de água e o pH para 5,8 com 0,1 M KOH. Depois de ajustar o pH, ajustar o volume final a 1000 mL com água destilada e autoclave. Os meios podem ser armazenado até 2 semanas a 4 ° C. Inocular um frasco Erlenmeye…

Representative Results

No presente estudo, a taxa de duplicação de BY-2 variou entre dependente da temperatura à qual as culturas foram incubadas, consistente com relatórios anteriores de uma duração do ciclo celular médio de 15 h 14-18 h. Com esta taxa de duplicação, de 1: 100 a partir de inoculo foi utilizado para iniciar culturas, levando a culturas com um volume empacotado de células (PCV) de 50% em 5-7 dias. No protocolo actual, em que as culturas foram cultivadas em 200 ml de meio, o hematócri…

Discussion

O protocolo acima descrito foi validada com êxito para o isolamento de protoplastos, enumeração e transformação usando a cultura de células em suspensão BY-2 de tabaco; No entanto, o protocolo pode ser facilmente estendida a qualquer planta de cultura em suspensão. Actualmente, o isolamento e transformação de protoplastos foi alcançado em numerosas plantas, incluindo o milho (Zea mays) 10, cenoura (Daucus carota) 32, álamo (Populus euphratica) 33, d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Materials

Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4 dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly (ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
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References

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. . Plant Biology and Biotechnology. , 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

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Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).
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