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Genetics

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Published: September 27, 2016
doi:
10.3791/54300
, ,
1Department of Plant Sciences,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon,University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Abstract

Negli ultimi dieci anni c'è stata una recrudescenza nell'uso dei protoplasti vegetali che vanno da specie modello per ritagliare le specie, per l'analisi di trasduzione del segnale, reti di regolazione trascrizionale, l'espressione genica, del genoma-editing, e Gene-silenziamento. Inoltre, sono stati compiuti progressi significativi nella rigenerazione di piante da protoplasti, che ha generato ancor più interesse per l'uso di tali sistemi per genomica vegetale. In questo lavoro, un protocollo è stato sviluppato per l'automazione di isolamento protoplasti e trasformazione da 2 (BY-2) coltura in sospensione tabacco un 'giallo brillante' utilizzando una piattaforma robotica. Le procedure di trasformazione sono stati convalidati usando un gene reporter proteina fluorescente arancione (OFP) (pporRFP) sotto il controllo del promotore cavolfiore mosaic virus 35S (35S). espressione OFP in protoplasti stata confermata mediante microscopia in epifluorescenza. Le analisi inclusi anche i metodi di efficienza di produzione di protoplasti utilizzando propidium ioduro. Infine, a basso costo enzimi per alimenti sono stati utilizzati per la procedura di isolamento di protoplasti, eludendo la necessità di enzimi di laboratorio di grado che sono un costo proibitivo in high-throughput automatizzato isolamento di protoplasti e di analisi. Basato sul protocollo sviluppato in questo lavoro, la procedura completa dall'isolamento protoplasti di trasformazione può essere effettuata in meno di 4 ore, senza alcun intervento da parte dell'operatore. Mentre il protocollo sviluppato in questo lavoro è stato convalidato con la coltura cellulare BY-2, le procedure ei metodi dovrebbero essere traducibile a qualsiasi / sistema di coltura in sospensione di protoplasti impianto, che dovrebbe consentire l'accelerazione della ricerca genomica nel grano.

Introduction

Negli ultimi anni vi è stato significativo impulso posto sulla progettazione delle colture transgeniche per superare le varie malattie 1, dotare resistenza agli erbicidi 2, conferiscono alla siccità e 3,4 tolleranza al sale 5, prevenire erbivori 6, aumento della biomassa resa 7, e diminuire recalcitrance parete cellulare 8. Questa tendenza è stata aiutata dallo sviluppo di nuovi strumenti molecolari per la generazione di piante transgeniche, tra cui genoma di modifica utilizzando CRISPR e Talens 9, e silenziamento genico attraverso dsRNA 10, miRNA 11, e siRNA 12. Mentre queste tecnologie hanno semplificato la generazione di piante transgeniche, hanno anche creato un collo di bottiglia, dove il gran numero di piante transgeniche generate non possono essere sottoposti a screening con sistemi tradizionali che si basano sulla rigenerazione delle piante. In relazione a questo collo di bottiglia, mentre il silenziamento e del genoma di modifica costrutti possono essere rapidamente inseriti nelle piante, molte delletratti mirati riescono a produrre l'effetto desiderato, che spesso non è scoperto fino piante sono analizzati nella serra. In questo lavoro, abbiamo messo a punto un metodo per la rapida automatizzato, lo screening, high-throughput di protoplasti vegetali, in particolare per affrontare il collo di bottiglia attuale screening precoce di un gran numero di genoma-editing e silenziamento genico obiettivi.

L'uso di protoplasti, al contrario di cellule vegetali intatte, ha diversi vantaggi per lo sviluppo di una piattaforma automatizzata. Innanzitutto, protoplasti sono isolati dopo la digestione della parete cellulare, e questo non è più presente barriera, efficienza di trasformazione è aumentato 13. In cellule vegetali intatte ci sono solo due metodi consolidati per la trasformazione, biolistics 14 e Agrobacterium mediata trasformazione 15. Nessuno di questi metodi può essere facilmente tradotto per piattaforme gestione di liquidi, come biolistics richiede attrezzature specializzate per Transformazioni, mentre Agrobacterium trasformazione mediata richiede co-cultura e la successiva rimozione dei batteri. Né sono suscettibili di metodi di high throughput. Nel caso di protoplasti, trasformazione viene normalmente condotta utilizzando polietilene glicole (PEG) trasfezione mediata 16, che richiede solo alcuni scambi soluzione, ed è particolarmente adatto per le piattaforme gestione dei liquidi. In secondo luogo, protoplasti, per definizione, sono culture monocellulari e quindi i problemi associati con formazione di grumi e catena di formazione in colture cellulari vegetali, non sono osservati in protoplasti. In termini di screening rapido utilizzando uno spettrofotometro piatto a base di aggregazione delle cellule, o cellule in piani multipli porterà a difficoltà di acquisire misurazioni coerenti. Poiché protoplasti sono anche più densa loro terreni di coltura, essi sedimentare sul fondo dei pozzetti, formando un monostrato, che è favorevole per spettrofotometria piastra base. Infine, mentre colture in sospensione di cellule vegetali sono Primarily derivati da callo 17, protoplasti possono essere raccolte da un certo numero di tessuti vegetali, portando alla capacità di identificare l'espressione tessuto-specifica. Ad esempio, la capacità di analizzare root- o-specifico espressione foglia di un gene può essere molto importante fenotipo previsione. Per queste ragioni, i protocolli sviluppati in questo lavoro sono stati convalidati usando protoplasti isolati dal tabacco diffuso (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) cultura sospensione.

La coltura in sospensione BY-2 è stato descritto come la cella "HeLa" di piante superiori, grazie al suo uso diffuso in analisi molecolare di cellule vegetali 18. Recentemente, BY-2 le cellule sono state usate per studiare gli effetti delle piante di stress 19-22, la localizzazione della proteina intracellulare 23,24, e biologia cellulare di base 25-27 dimostrare l'ampio programma di utilità di queste culture in biologia vegetale. Un ulteriore vantaggio di BY-2 culture è ilpossibilità di sincronizzare le culture con afidicolina, che può portare ad una maggiore riproducibilità per l'espressione genica studia 28. Inoltre, sono stati sviluppati metodi per l'estrazione di BY-2 protoplasti utilizzando enzimi basso costo 29,30, come enzimi tradizionalmente utilizzati per generare protoplasti sono costi proibitivi per i sistemi ad elevata capacità. Come tale, il protocollo descritto di seguito è stato convalidato utilizzando la coltura in sospensione BY-2, ma dovrebbe essere modificabile a qualsiasi coltura in sospensione delle cellule vegetali. Proof-of-concept esperimenti vengono eseguiti utilizzando un arancio proteina a fluorescenza (OFP) gene reporter (pporRFP) dalle Porites di corallo duro Porites 31 sotto il controllo del promotore CaMV 35S.

Protocol

1. Istituzione di sospensione culture cellulari Preparare liquido BY-2 supporti aggiungendo 4,43 g Linsmaier & Skoog supporti basali, 30 g di saccarosio, 200 mg KH 2 PO 4, e 200 mg di 2,4-diclorofenossiacetico acido (2,4-D) a 900 ml di acqua distillata l'acqua e il pH a 5,8 con 0,1 M KOH. Dopo la regolazione del pH, regolare il volume finale a 1000 ml con acqua distillata e autoclave. I supporti possono essere memorizzati fino a 2 settimane a 4 ° C. Seminare un pallone…

Representative Results

In questo studio, il tasso di raddoppio BY-2 varia dai 14-18 hr dipendente dalla temperatura alla quale sono stati incubati le culture, coerente con le precedenti relazioni di media durata del ciclo cellulare delle 15 ore. Con questo tasso raddoppio, 1: 100 inoculo di partenza è stato usato per iniziare culture, portando a culture con un volume imballato cellulare (PCV) del 50% in 5-7 giorni. Nel protocollo attuale, in cui le culture sono state coltivate in 200 ml di mezzi di comunicazi…

Discussion

Il protocollo sopra descritto è stato convalidato con successo per l'isolamento di protoplasti, l'enumerazione e la trasformazione utilizzando il tabacco coltura cellulare sospensione BY-2; Tuttavia, il protocollo potrebbe facilmente essere esteso a qualsiasi coltura in sospensione pianta. Allo stato attuale, l'isolamento di protoplasti e trasformazione è stato raggiunto in numerose piante, tra cui il mais (Zea mays) 10, carota (Daucus carota) 32, il pioppo (Popu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Materials

Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4 dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly (ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
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References

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. . Plant Biology and Biotechnology. , 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

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Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).
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