Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation
Summary
Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.
Abstract
Im letzten Jahrzehnt gab es ein Wiederaufleben in der Verwendung von Pflanzenprotoplasten gegeben, die von Modellarten reichen Spezies zu beschneiden, für die Analyse von Signalwegen, Transkriptionsregulationsnetzwerke, die Genexpression, Genom-Bearbeitung und Genin. Darüber hinaus wurden erhebliche Fortschritte bei der Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten hergestellt worden, die noch mehr Interesse an der Nutzung dieser Systeme für Pflanzengenom erzeugt hat. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Automatisierung der Isolierung von Protoplasten und Transformation von einem 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Tabaksuspensionskultur unter Verwendung einer Roboterplattform entwickelt. Die Transformationsverfahren wurden unter Verwendung eines orangefarbenen fluoreszierendes Protein (OFP) Reportergen (pporRFP) unter der Steuerung des Mosaikvirus 35S-Promotor Cauliflower validiert (35S). OFP-Expression in Protoplasten wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die Analysen enthalten auch Protoplasten Produktionseffizienz Methoden propidium Jodid. Schließlich wurden Low-Cost-Lebensmittel-Grade-Enzyme für die Protoplasten-Isolierungsverfahren verwendet, wodurch die Notwendigkeit für Labor-Grade Enzyme zu umgehen, die im Hochdurchsatz automatisierte Isolierung von Protoplasten und Analyse zu kostspielig sind. Basierend auf dem Protokoll in dieser Arbeit entwickelt wurde, kann der gesamte Vorgang von Isolierung von Protoplasten zur Transformation durchgeführt werden, in weniger als 4 Stunden, ohne Eingabe vom Bediener. Während das Protokoll in dieser Arbeit entwickelte mit der BY-2-Zellkultur bestätigt wurde, sollten die Verfahren und Methoden auf jede beliebige Pflanze Suspensionskultur / Protoplasten System übersetzbar sein, die Beschleunigung von Pflanzengenomforschung ermöglichen soll.
Introduction
In den letzten Jahren hat es erhebliche Impulse auf die Gestaltung von transgenen Kulturen gelegt worden , um verschiedene Krankheiten 1, verleihen Herbizidresistenz 2, verleihen Dürre 3,4 und Salztoleranz 5, verhindern Herbivorie 6, erhöhen Biomasseertrag 7 und verringern Zellwand Widerspenstigkeit überwinden 8. Dieser Trend wurde durch die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge zur Erzeugung transgener Pflanzen Aided, einschließlich Genom-Bearbeitung mit CRISPR und Talens 9 und Gen durch dsRNA – Silencing 10, miRNA 11 und siRNA 12. Während diese Technologien die Erzeugung transgener Pflanzen vereinfacht haben, haben sie erstellt auch einen Engpass, wo die schiere Anzahl der transgenen Pflanzen erzeugt wird, nicht traditionellen Systemen mit gescreent werden, die auf die Pflanzenregeneration verlassen. Im Zusammenhang mit diesem Engpass, während zum Schweigen zu bringen und Genom-Editing-Konstrukte schnell in Pflanzen eingeführt werden kann, sind viele dergezielte Züge nicht den gewünschten Effekt zu erzeugen, die oft erst entdeckt, wenn Pflanzen im Gewächshaus analysiert werden. In dieser Arbeit haben wir ein Verfahren zur schnellen, automatisierten Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenprotoplasten entwickelt, die speziell den aktuellen Engpass in der frühen Screening einer großen Anzahl von Genombearbeitung und Gen-Silencing Ziele zu adressieren.
Die Verwendung von Protoplasten zu intakten Pflanzenzellen gegenüber, hat mehrere Vorteile für die Entwicklung eines automatisierten Plattform. Zuerst Protoplasten werden aber nach Aufschluss der Pflanzenzellwand isoliert und mit dieser Barriere nicht mehr vorhanden ist , wird die Transformationseffizienz 13 erhöht. In intakten Pflanzenzellen gibt es nur zwei etablierte Methoden zur Transformation, Biolistik 14 und Agrobacterium -vermittelte Transformation 15. Keines dieser Verfahren kann leicht an Liquid-Handling-Plattformen übersetzt werden, wie Biolistik erfordert spezielle Ausrüstung für transformation, während Agrobacterium -vermittelte Transformation erfordert Kokultur und anschließende Entfernung der Bakterien. Weder sind zugänglich für Hochdurchsatzverfahren. Im Falle von Protoplasten wird routinemßig Transformations 16, unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) -vermittelte Transfektion durchgeführt , die nur mehrere Lösungs Austausch erfordert, und ist ideal für Liquid – Handling – Plattformen geeignet. Zweitens, Protoplasten, per Definition, Single-Zellkulturen sind, und damit die mit Verklumpung und Kettenbildung verbundenen Probleme in pflanzlichen Zellkulturen, die nicht in Protoplasten beobachtet. Im Hinblick auf die schnelle Screening eine plattenbasierte Spektrophotometer, Verklumpung von Zellen, oder Zellen in mehreren Ebenen werden in den Erwerb konsistente Messungen zu Schwierigkeiten führen. Da Protoplasten auch dichter ist als die Kulturmedien sind, sedimentieren sie auf den Boden des Wells, um eine Monoschicht bilden, die für plattenbasierte Spektrophotometrie förderlich ist. Schließlich, während Pflanzenzellkulturen sind primarily aus Kallus 17 abgeleitet, Protoplasten können aus einer Anzahl von Pflanzengeweben geerntet werden, zu der Fähigkeit führt die gewebespezifische Expression zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Fähigkeit, Wurzel- oder blattspezifische Expression eines Gens kann sehr wichtig sein, um Phänotyp Vorhersage zu analysieren. Aus diesen Gründen sind die in dieser Arbeit entwickelten Protokolle wurden validiert Protoplasten isoliert von der weit verbreiteten Tabak (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Suspensionskultur mit.
Die BY-2 – Suspensionskultur wurde als "HeLa" Zelle von höheren Pflanzen beschrieben worden ist , wegen seiner allgegenwärtigen Einsatz in der molekularen Analyse von Pflanzenzellen 18. Kürzlich wurden BY-2 – Zellen verwendet , um die Effekte der Pflanze zu untersuchen Stressoren 19-22, intrazelluläre Proteinlokalisation 23,24 und Grund Zellbiologie 25-27 der breiten Verwendbarkeit dieser Kulturen in Pflanzenbiologie demonstriert. Ein zusätzlicher Vorteil der BY-2 Kulturen ist dieFähigkeit , die Kulturen mit Aphidicolin zu synchronisieren, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit für Genexpressionsstudien führen kann 28. Darüber hinaus wurden für die Extraktion von BY-2 – Protoplasten unter Verwendung von Low-Cost – Enzyme 29,30, als Enzyme traditionell verwendet zur Erzeugung von Protoplasten sind unerschwinglich für Hochdurchsatz – Systeme Methoden entwickelt. Als solches beschriebene Protokoll unter validiert wurde die BY-2-Suspensionskultur verwendet, aber es sollte auf jede Pflanzenzellsuspensionskultur abänderbar ist. Proof-of-Concept – Experimente werden mit einem Orange – Fluoreszenz – Protein (OFP) Reporter – Gen (pporRFP) von den Hartkorallen Porites ausgeführt Porites- 31 unter der Kontrolle des CaMV 35S – Promotors.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das oben beschriebene Protokoll wurde für Isolierung von Protoplasten, Aufzählung und Transformation mit der BY-2 Tabaksuspensionszellkultur erfolgreich validiert; jedoch könnte das Protokoll leicht an jede Pflanzensuspensionskultur erweitert werden. Derzeit Isolierung von Protoplasten und Transformation wurde in zahlreichen Pflanzen, darunter Mais (Zea Mays) 10, Karotte (Daucus carota) 32, Pappel (Populus euphratica) 33, Traube (Vitis vinifera) <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Materials
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
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