Introduction
Дом Ухо институт-кортиева органа 1 (HEI-OC1) клетки получают из слухового органа трансгенной мыши 1,2. Инкубационный любой клетки от этой трансгенной мыши при 33 ° C / 10% CO 2 (разрешающих условиях) индуцирует экспрессию гена увековечивающему, запускающего де-дифференциацию и пролиферацию ускоренную; перемещение клеток до 39 ° C / 5% CO 2 (не разрешающие условия) приводят к снижению пролиферации, дифференцировки и, по крайней мере , в случае Hei-OC1, гибели клеток 2,3.
Вуз-OC1 клетки были клонированы и охарактеризованы в нашей лаборатории более десяти лет назад, и первоначальные исследования показали, что они выражают специфические маркеры волосковых клеток улитки, такие как Prestin, миозина 7а, Atoh1, BDNF, кальбиндин и кальмодулин, но и маркеры поддержки клетки , такие как коннексина 26 и рецептора фактора роста фибробластов (FGF-R) 2. Поэтому было высказано предположение о том, что HEI-OC1 может представлять собой Коммоп прародителем для сенсорных и опорных клеток органа Корти 2. Параллельные исследования убедительно показали , что архетипическом ототоксичен препараты , как цисплатин, гентамицин и стрептомицин индуцированной активации каспазы-3 в этих клетках, в то время как препараты считаются не ототоксичен, как пенициллин, не сделал 2,3. Таким образом, эта клеточная линия была предложена в качестве системы в пробирке для исследования клеточных и молекулярных механизмов , участвующих в ототоксичность и для скрининга потенциальных ототоксичность или otoprotective свойств новых фармакологических препаратов. Предполагается, что HEI-OC1 клетки были использованы в более чем ста пятидесяти исследований, опубликованных за последние десять лет.
Принимая во внимание , глядя на потенциального проапоптотического влияния различных препаратов была основной целью большинства исследований , связанных с этой клеточной линии, другие важные клеточные процессы , такие как аутофагии и старении только начали исследовать в клетках HEI-OC1 4-7. яна недавнем исследовании нашей лаборатории 8, мы использовали клетки HEI-OC1 собрать полный набор данных о гибели клеток, выживание, пролиферацию, старении и аутофагии , вызванных различными фармакологическими препаратами , часто используемых в клинике. Мы также сравнили некоторые из ответов HEI-OC1 клеток с теми из НЕК-293 (эмбриональные клетки почки человека) и HeLa (эпителиальные клетки человека), получающих идентичную обработку. Наши результаты показали, что Hei-OC1 клетки реагируют на каждого лекарственного средства характерным образом, с характерным дозы и времени зависит чувствительность, по крайней мере, один из механизмов, на стадии изучения. Мы также подчеркнули , в этом исследовании , что правильная интерпретация экспериментальных результатов потребует проведения параллельных исследований с более чем одной техники 8.
В другом исследовании мы изучали использование клеток HEI-OC1 оценить функциональную характеристику Prestin, двигатель белок кохлеарных наружных волосковых клеток (OHCs) 9 + K + АТФазы, которая транслокации из плазматической мембраны в цитоплазму без существенных изменений в общей экспрессии в клетках. Кроме того, мы показали, что Р-Вуз-OC1 клетки имеют надежный НЖК, связанный с Prestin двигательной функции, которая уменьшается, когда плотность молекул Prestin, присутствующих на мембране увеличена. В целом, эти результаты убедительно подтверждают полезность Hei-OC1 клетки для исследования слуховых белков.
В этом видео статье мы опишем, как культура клеток HEI-OC1, почему удобно использовать клетки растут в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) для исследований цитотоксичности, как оценить механизм / с лекарственно-индуцированной цитотоксичности и как для выполнения электрофизиологических исследований (например, патч-зажим, нелинейную емкость (НЖК)) для исследования функциональных свойств Prestin, молекулярного двигателя кохлеарного OHCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток
Примечание: Все протоколы культивирования клеток должны быть выполнены с использованием надлежащих методов культивирования клеток (для справки см первые 3 главы клеточной биологии: A Laboratory Handbook, том I 10). Вуз-OC1 клетки не требуют какого-либо дополнительного покрытия или обработка посуды клеточных культур для надлежащего соблюдения и роста. Очень важно: не используйте стеклянную посуду посуду для целей культивирования клеток; фенотип и биологическая реакция клеток на фармакологических препаратов изменится (G & F Kalinec Kalinec, неопубликованный); Рекомендуется использовать традиционные блюда из пластика для культивирования клеток (см Таблицу материалов / оборудования). Обратите особое внимание на асептики , чтобы избежать загрязнения, но никогда не используют антибиотики (например, ампициллин или стрептомицин) с клетками HEI-OC1. При необходимости использовать амфотерицина В. В то время как HeLa и НЕК-293 клеток, были использованы в качестве контроля в предыдущих исследованиях с Hei-OC1 8, любая другая линия клеток можетбыть приемлемыми для этой цели.
- Реанимация Замороженный HEI-OC1 клеток
Примечание: Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями из той же трансгенной мыши , разработанной в нашей лаборатории, такие как OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.- Удалить флакон криоконсервированных клеток Hei-OC1 из жидкого N 2, и поместить его на водяной бане при 37 ° С. Погрузите только нижнюю половину флакона, и дайте ему оттаять, пока лишь небольшое количество льда остается во флаконе. Протрите наружную поверхность флакона с 70% -ным спиртом.
- Пипетировать клетки из флакона и доставить весь объем (~ 1,5 × 10 5 клеток / мл) медленно, по капле, в 15 мл коническую пробирку , содержащую 10 мл подогретого среды для роста, как модифицированной среде Игла Дульбекко ( DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Удалить ДМСО при центрифугировании трубки при температуре 300-500 мкг в течение 5 мин, отбрасывая тон супернатант и ресуспендирования клеток в 9 мл свежей среды для роста (DMEM + 10% FBS). Дезагрегации комки или листы клеток флюса и флегмы взвешенных клеток, из пипетки в среде, и наоборот, в три-четыре раза с кончиком пипетки касаясь дна трубки.
- Поместите общий объем клеток, суспендированных в среде роста в мм диаметра 100 необработанных, пластиковые чашки для культивирования клеток.
- Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (разрешающих условиях).
- Субкультура HEI-OC1 клеток
Примечание: До слияния (~ 80%), клетки должны быть приведены в подвеске и субкультивироваться для того, чтобы предотвратить культуру смерти. Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями , разработанных в нашей лаборатории из той же трансгенной мыши, например, OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.- Удалите старую среду и промыть клетки с 2 мл PBS. </ Li>
- Накройте клеточный монослой с раствором 0,25% трипсина, с использованием 1 мл на 25 см 2 поверхности. Для того, чтобы перейти к следующему шагу более чем 40% клеток должна быть отсоединена. Исследуют клетки с использованием инвертированного микроскопа, и, при необходимости, "шлепать или нажмите" культуральных чашек осторожно, чтобы освободить все оставшиеся прикрепленные клетки.
Примечание: Будьте осторожны, как трипсином в течение длительного времени может привести к гибели клеток; не достаточно, а переданные клетки будут недостаточными для планируемых исследований. - Ресуспендируют клеток, следуя процедуре, описанной в разделе 1.1.3, и передавать их в коническую пробирку на 15 мл.
- Центрифуга в течение 5 мин при 300-500 XG, выбросьте среду, собирают клетки со свежей средой роста и семя их в, по меньшей мере, четыре 100 мм диаметра блюда клеточной культуры. Число клеток на чашку, будет зависеть от количества клеток, выделенных. Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (С-Hei-OC1) и разделить снова столько раз , сколько необходимо длязапланированные эксперименты или для создания нового запаса.
- Для подготовки запасов, заменить блюда мм диаметром 100 от 250-550 мл колбах для культивирования клеток; для экспериментов, небольшие блюда или мульти-луночные планшеты могут быть более адекватными.
- Для дифференцировки, клетки инкубировать HEI-OC1 в разрешающих условиях, пока они не достигают ~ 80% слияния; затем переместите посуду до 39 ° C с 5% CO 2 (NP-Вуз-OC1) в течение 2 -х до 3 -х недель.
Примечание: Клетки будут постепенно остановить пролиферирующих и умирает. Изменение среды через день, чтобы удалить мертвые клетки. В зависимости от исходного количества клеток, как правило, после ~ 4 недели не больше ячеек не будут доступны для экспериментов. Дифференциация начинается, как только клетки помещают в условиях NP, но не каждая клетка дифференцируются в том же темпе. Важно отметить, что Prestin экспрессии и локализации мембраны возрастает в процессе дифференцировки (см Представитель Результаты, рисунок 4), обеспечивая качественноеи количественный показатель уровня дифференциации.
2. Drug Исследования цитотоксичности
Примечание: Вуз-OC1 клетки , выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований (см Представитель Результаты, Рисунок 1).
- Жизнеспособность клеток (МТТ)
- Собирают клетки Р-Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
- Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
- После того, как медикаментозное лечение (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполняют МТТ анализ в соответствии с протоколом производителя. В целом, Протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
- Добавьте 10 мкл реагента МТТ в каждую лунку.
- Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение от 2 до 4 ч до тех пор, фиолетовый краситель не виден, а затем добавить 100 мкл МТТ Моющая реактива в каждую лунку. Не встряхивайте пластину.
- Закройте планшет и оставить его в темноте в течение 2 до 4 ч при температуре 37 ° С.
- Используйте устройство для чтения микропланшетов пластины для измерения оптической плотности при длине волны 570 нм в каждую лунку, включая пробелы (рост среднего в одиночку). Нормализация данных с использованием среднего OD в контрольных клетках, как 100% от жизнеспособности.
- Каспазы 3/7 Активация Анализ
Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.- Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
- Семенной клеток на КНИТО-стеной 96-луночные планшеты (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
- После медикаментозного лечения (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполнить анализ каспазы следующий протокол соответствующего производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
- Подготовка реагентов, хорошо перемешать, и дать им возможность уравновешивания до комнатной температуры.
- Удалить клетки из инкубатора и позволяют пластины уравновешиваться до комнатной температуры.
- Добавьте указанное количество реагента в каждую лунку, соблюдая осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения, не касаясь лунки, содержащие различные образцы с одинаковыми наконечниками пипеток.
- Закройте планшет и перемешивают в течение 30 секунд с помощью шейкере при температуре 300-500 оборотов в минуту.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение периода, по крайней мере, 30 мин. Determinе оптимальный период инкубации эмпирически. Если температура в помещении колеблется использовать постоянной температуры инкубатора, так как колебания температуры будут влиять на чтение люминесценции.
- Измеряют люминесценцию в каждую лунку, и нормализовать значения с использованием среднего люминесценцию в контрольных клетках, как 100% от активации каспазы.
- Деление клеток (пролиферации)
- Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
- Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубируют в течение ночи при разрешающих условиях для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
- Через час после обработки, добавляют в каждую лунку по 1 мкл приготовленной 100x BrdU (5-Бром-2'-deoxyuriобед) решение, и вернуть пластины в инкубатор при 33 ° С.
- После того, как 12, 24 и 48 ч, удалить существующую среду из соответствующих пластин и промыть каждую лунку один раз PBS.
- Провести анализ пролиферации клеток в соответствии с протоколом производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
- Подготовка реагентов, в том числе фиксации / денатурирующих раствор, моющий буфер, раствор первичного обнаружения антител, вторичное решение для обнаружения антител и BrdU раствора, как указано в протоколе изготовителя.
- Добавьте решение фиксирующее / денатурации в каждую лунку в количествах, указанных в протоколе изготовителя, и держать планшет при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалите / денатурирующих фиксирующим раствором и добавляют первичное антитело в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Хранить планшет при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Удалите раствор с первичным муравейibody, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, а затем добавить вторичные антитела в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Держите пластину с вторичным антителом, при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалите раствор с вторичным антителом, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, и добавьте субстрат. Через 10 мин инкубации при комнатной температуре, добавляют раствор STOP. Будьте осторожны: контролировать изменение в цвете; если решение становится очень темно, остановить реакцию до начала стандартного времени разработки 10 мин.
- Измерить оптическую плотность при 450 нм в течение 30 мин после добавления стоп-раствора.
- Цитотоксичность
Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.- Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
- В конце лечения, Промыть клетки три раза PBS, и отделяться с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора для диссоциации клеток в течение 3 мин.
- После стягивания, сбора и осаждения клеток центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин, удалить супернатант, и окрашивать клетки в течение 15 мин в темноте с реагентом, включенного в цитотоксичности.
- Определить количество живых клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточного цитометра.
- физиологическое старение
- Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
- Определить количество Старение-ассоциированные бета-галактозидазы - положительных клеток с помощью проточной цитометрии с протоколом , описанным Debacq-Chainiaux и др. 15 или другим способом , известным , чтобы обеспечить надежные результаты. Краткий протокол для проточной цитометрии является следующее:
- <Li> В конце эксперимента обработок, промыть клетки три раза PBS, а затем инкубировать их с 100 нМ Bafilomycin A1 в культуральной среде клеток в течение 1 ч при разрешающих условиях.
- Добавить C12FDG в конечной концентрации ~ 33 мкМ, и продолжают инкубацию клеток в течение 1-2 ч.
- Вымойте клетки дважды с PBS, собирают их с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора диссоциации клеток в течение 3 мин, и гранул их центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в охлажденном льдом PBS и определяют количество положительных клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточном цитометре.
- Собирают Hei-OC1 контрольные клетки и голодали (лишенные сыворотки в течение 48 ч) с помощью следующей процедуры, описанной в разделе 1.2, и обрабатывать их для Вестерн-блоттинга в соответствии со стандартными протоколами. В целом, протоколы для вестерн-блоттинга имеют следующую стEPS:
- Семенной Hei-OC1 клеток в 6-луночные планшеты при концентрации 1,0 х 10 5 клеток / мл. После того, как 24 и / или 48 ч, промыть клетки с охлажденным льдом PBS.
- Лизируйте с 200 мкл буфера TNESV (1% NP40, 50 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na 3 VO 4) с ингибитором протеаз и 1 мМ PMSF в течение 5 мин на льду.
- Собирают клетки (путем соскоба в нижней части каждой лунки), трансфер в микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 16800 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- Собирают супернатанты и количественного определения концентрации белка с помощью ВСА анализа.
- Добавить 5х буфера для загрузки и 1 мМ DTT, к каждому образцу и кипятят в течение 5 мин для денатурации белков.
- Запуск образцов с помощью SDS-PAGE на 4-12% геле и переносят на мембраны ПВДФ.
- Блок мембраны с 5% обезжиренным сухим молоком в TBS-T с 0,1% твина 20 в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Инкубацию мембраны в течение ночи при 4 ° С с первичным муравейibodies.
- На следующий день, промывка мембран экстенсивно с TBS-T, и инкубировать с вторичным антителом IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (1: 1500) в течение 1 часа.
- Обнаружение иммунореактивности с системой обнаружения усиливается хемилюминесценции (ECL). Нормализация уровней экспрессии белка с использованием GAPDH (1: 2000 в TBS-T с в 10% обезжиренного сухого молока) в качестве стандарта.
- В Вестерн-блоттинга исследовать экспрессию, по крайней мере, два различных маркеров аутофагией, такие как Beclin-1 и LC3B (как правило, в соотношении 1: 1000 разбавления в TBS-T, с 2,5% БСА). Не забудьте взглянуть на контроль экспрессии белка, такие как GAPDH или актина.
- Оценка экспрессии интересующего белка с помощью денситометрии с помощью цифрового сканера блот или компьютерного программного обеспечения, таких как публичного домена NIH Image или ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).
3. Электрофизиологические Эксперименты с вузом-OC1 клеток
- Сбор клеток
Примечание: Используйте клетки растут в чашки для культивирования диаметром 100 мм на 50% -80% сплошности. Трипсин, Accutase, фермент-бесплатное решение, или р hosphate- б uffered сек Алины + е thylene d iamine т ETRA в cetic кислоту (PBS-EDTA) могут быть использованы для подъема клеток без значительного воздействия на количество и качество gigaseals , В некоторых случаях, однако, обработка трипсином делает клетки более хрупкими. В этих случаях, позволяют клеткам восстановиться в течение примерно 30 минут, перед началом экспериментов.- Вымойте клетки дважды с 10 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+.
- Добавляют 2 мл фермента раствора без съемника, например неферментативного раствора клеточной диссоциации, и инкубировать блюда в течение 3 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
- С помощью инвертированного микроскопа, чтобы проверить отряд клеток. При необходимости, переместите CELл культуры блюдо, чтобы отделить больше клеток, но сделать это мягко.
Примечание: Не трясите блюдо. - Добавьте 10 мл DMEM + 10% FBS и пипеткой клетки нежно вверх и вниз в пять раз с 10-мл пипетки.
- Посмотрите на клетки под микроскопом. Если> 80% клеток уже разделены (один), не далее пипеткой не требуется. Если клетки все еще находятся в кластерах, повторите осторожно пипеткой до более чем 80% клеток не одиноки.
- Поместите ~ 10 мл взвешенных клеток в коническую пробирку на 15 мл, центрифуга в течение 2 мин при 100 мкг, и отбросить супернатант.
- Используйте ~ 200 мкл внешнего раствора записи (Лейбовиц L-15 средней доводят до 305 - 310 мОсм с дистиллированной водой) для ресуспендирования клеток. Оптический контроль ячеек должны показать много одиночных, круглые клетки с гладкими краями мембраны.
- Патч-зажим и НЖК Измерения
- Выполните патч-зажим и измерения напряжения зависящих от нелинейной емкости (НЖК) с использованиемdequate усилители и программного обеспечения, а также стандартные электрофизиологические методы. Как использование внутреннего раствора (intrapipette) 150 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 0,1 мМ EGTA, 2 мМ АТФ-Mg, 0,1 мМ ГТФ-Na, и 10 мМ HEPES; доведения рН до 7,2 с помощью Триса.
- Под микроскопом, выбрать одну, здоровую клетку, с круглыми и гладкими краями мембраны. Прикрепите кончик стеклянной пипетки на клеточной поверхности и проверить сопротивление мембраны. Это должно быть около 3-6 МОм, что соответствует внутреннему диаметру (ID) наконечника пипетки из ~ 2 мкм.
- Слегка нажмите на кончик микропипетки против плазматической мембраны клетки, а затем применить всасывание. Часть клеточной мембраны будет отсасывается в пипетку, генерируя электрическое сопротивление в порядка 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
- Установить состояние целой клетки путем разрушения плазматической мембраны с всасывающим импульсами.
- Использование клеток , которые не экспрессируют Prestin, такие как НЕК-293, в качестве контроля 9,
Примечание: Текущие ответы должны быть отфильтрованы на 5 кГц, а также исправления, сделанные для эффектов остаточного сопротивления серии. Все сбора данных и большинство анализов могут быть выполнены с использованием программного обеспечения, как правило, включены с замком усилителями. Функция емкостного сопротивления может быть установлен на первой производной двух государственной функции Больцмана , связанной нелинейной заряд мембраны напряжения 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нескольких недавних публикациях мы сообщали , полный набор исследований , направленных на оценку реакции клеток HEI-OC1 к нескольким наиболее часто используемых фармакологических препаратов, а также исследовать функцию Prestin 8,9. В этих исследованиях мы использовали всех протоколов, описанных в предыдущих разделах.
Одним из результатов этих предыдущих исследований было то , что Hei-OC1 клетки культивировали при непермиссивные условиях (39 ° С / 10% СО 2 = NP-Hei-OC1) показали весьма значительное снижение жизнеспособности клеток, и столь же значительное увеличение в клеточной гибели, по отношению к клеткам культивировали при разрешающих условиях (33 ° C / 10% CO 2 = P-вуз-OC1) (Рисунок 1). Поэтому любое цитотоксичность исследование, проведенное на клетках NP-Вуз-OC1 должны выделять значительные усилия в дискриминирующих эффектов препарата от воздействия условий культивирования. В сложения иN, так как лекарственные эффекты на клетки уже умирают или с уменьшением жизнеспособности может быть различным, что воздействие одного и того же препарата на здоровых клетках, рекомендуется использовать клетки Р-Hei-OC1 для экспериментов, которые не требуют специально дифференцированных клеток.
Проведенные нами исследования по изучению влияния различных фармакологических препаратов также интересные результаты. Например, цисплатин, химиотерапевтическое средство , часто используется для лечения некоторых злокачественных опухолей человека, и ацетаминофена (APAP = N- cetyl- ра ра-амино- р henol), наиболее широко продаются более чем в розницу болеутоляющее в США, оба были токсичны для клеток HEI-OC1 (Рисунок 2). Тем не менее, в то время как АПАФ снижение жизнеспособности клеток и увеличение активации каспазы 3/7, он не вызывал гибели клеток. Цисплатин, напротив, значительно возросло три отклика (Рисунок 2). Интересно отметить, что каспазы 3/7 были mostlY активируется при более низких концентрациях, цисплатин, предполагая, что гибель клеток индуцируется низкими дозами цисплатина, вероятно, опосредовано апоптоза, в то время как высокие дозы летальные эффекты могут быть связаны с oncosis / necroptosis. В то время как oncosis была определена как предварительно летальным путь , ведущий к нерегулируемому гибели клеток в сопровождении клеточного и органелл отек, блеббинга и повышенной проницаемости мембран 17,18, necroptosis является регулируемым , не механизм апоптоза гибель клеток активируются те же раздражители , которые инициируют апоптоз , но с морфологическими признаками , аналогичными oncosis 19-22.
Дополнительные исследования , направленные на изучение влияния APAP и цисплатином на клетки Р-Hei-OC1 показали четкую, дозозависимый эффект АРАР на пролиферацию клеток , которые могли бы объяснить интригующим снижение жизнеспособности клеток без гибели клеток , описанной в предыдущем параграфе (рис 3A). цисплатин ALS O уменьшилась на пролиферацию клеток, и его эффект дополняется временем экспозиции даже при малых дозах (рис 3 , а ), но дополнительно уменьшились старении при всех концентрациях и временных точках , включенных в наше исследование (фиг.3В). Значительное уменьшение клеточного старения , индуцированный цисплатином , можно объяснить увеличением гибели клеток, при условии , что стареющие клетки будет, вероятно, склонны умирать быстрее , чем здоровые клетки 23.
Важно, что эти репрезентативные результаты свидетельствуют о том, что Hei-OC1 клетки реагируют на различные фармакологические препараты с отличительным дозы и времени зависит чувствительность к по меньшей мере, одного из механизмов исследуемых. Таким образом, правильная интерпретация любого экспериментального результата потребует четкого понимания конкретных клеточных процессов, исследованных и информацию, представленную каждым из методов, используемых для их оценки.
jove_content "ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> конфокальной и проточной цитометрии экспериментов, с другой стороны, подтвердил Prestin выражение в P-Вуз-OC1 и NP-Вуз-OC1 клеток, с Prestin immunolocalizing главным образом на цитоплазма клеток P-вуз-OC1 (рис 4A, стрелки), и более концентрированным на плазматической мембране в клетках NP-вуз-OC1 (рис 4В, стрелки). Проточная цитометрия исследования показали явное увеличение Prestin экспрессии в NP-ХЕИ -OC1 клетки по отношению к клеткам P-вуз-OC1 (Рисунки 4C и 4D). Нестационарная увеличение экспрессии и локализации плазмы мембраны Prestin в клетках NP-вуз-OC1 позволяет предположить , что транслокация сопровождался синтезом более молекул Prestin. Однако эти эксперименты не дают ключ, чтобы решить, является ли молекулы Prestin первоначально расположенные в цитоплазме перехода к плазматической мембране и новых молекул заменить их, если они остаются в цитоплазме и только недавно синтesized Prestin перемещается к плазматической мембране, или сочетание обоих процессов.Электрофизиологические исследования показали надежную НЖК в клетках Р-Hei-OC1 (рис 5б) с пиковым значением , которое уменьшается , и напряжение при пиковой емкости , которые переходили на более деполяризованы значений, когда клетки были перенесены в непермиссивные условий для 1 и 2 недели (Рисунки 5C и 5D). Из-за прогрессирующего транслокации Prestin из цитоплазмы в плазматическую мембрану, мы первоначально выдвинули гипотезу, что НЖК бы в NP-Hei-OC1 выше, чем в клетках Р-Hei-OC1, и что он будет в дальнейшем возрастать со временем инкубации при NP условия. Удивительно, но результаты наших исследований показали точно противоположный ответ. Мы предположили, что увеличение плотности Prestin молекул в плазматической мембране может быть ограничение их двигательной функции.
хин-страница = "1"> Обратите внимание на рисунке 5 деполяризации напряжения при пиковой емкости в клетках HEI-OC1 по отношению к типичным значениям , зарегистрированных в OHCs и в трансфицированных клетках НЕК293 24; Кроме того, заметим, что деполяризующее сдвиг увеличивается со временем в условиях NP. Прогрессирующее Деполяризующее сдвиг аналогичен тому , который описан в OHCs во время мыши и крысы развития 25,26, и было высказано мнение , что это может быть связано с развитием других клеточных структур , связанных с плазматической мембраной НВК № 25 или процесса созревания внутренней к Prestin 24.
Мы надеемся, что этот краткий пересчет голосов нескольких исследований с клетками HEI-OC1 обеспечивают достаточно доказательств потенциальной полезности клеток HEI-OC1 для исследования широкого спектра клеточных молекулярных реакций.
Объявление / 54425 / 54425fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Жизнеспособность клеток и гибель клеток в P-Вуз-OC1 и NP-Вуз-OC1 клеток. Жизнеспособность (А) Cell оценивали с помощью МТТ - анализе. Оптическую плотность измеряли с помощью планшет-ридер, а средняя ОП в контрольных клеток принимают за 100% жизнеспособности. (В) некрозу клеток оценивали с помощью анализа цитотоксичности. Число положительных (умерших) клеток определяли с помощью проточной цитометрии с 488 нм возбуждения (синий лазер) и FL1: 530 15 нм. Обратите внимание , статистически значимы (P ≤0.001) снижение жизнеспособности клеток (А) и гибель клеток (В) , индуцированного непермиссивные условий. Столбики показывают стандартную ошибку средних (SEM). Измененный ссылки 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
"Рисунок 2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
Рис . 2: Ответы HEI-OC1 клетках , подвергнутых APAP и цисплатин при анализе МТТ, каспазы 3/7 и цитотоксичность (A) Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ - анализе, и оптическую плотность измеряли с помощью планшет - ридер. (B) Активация палача каспазы 3/7. (С) Drug - индуцированной гибели клеток оценивали с помощью анализа цитотоксичности; число положительных (умерших) клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Данные в каждом эксперименте нормализовали к соответствующим условиям управления (управления) = 1, чтобы сделать возможным одновременный статистический анализ. * = P ≤0.05 отношению к контролю. Столбики показывают стандартную ошибку средних (SEM). Модифицированный fromreference 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. а>
Рисунок 3: Влияние APAP и цисплатин на митотических Rate и старении HEI-OC1 клеток. (А) Изменения наркотиков индуцированных на скорость митотического деления клеток HEI-OC1, 24 и 48 ч, оценивали с BrdU Количественное определение. (В) лекарственно-индуцированной старении в клетках HEI-OC1 измеряли с помощью проточной цитометрии а senescence- связаны β-галактозидазы (SA-Bgal) метод. Данные в каждом эксперименте нормализовали к соответствующим условиям управления (управления) = 1, чтобы сделать возможным одновременный статистический анализ. * = P ≤0.05 отношению к контролю. Столбики показывают стандартную ошибку средних (SEM). Модифицированный fromreference 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию тего фигура.
Рис . 4: Prestin Экспрессия в P-Вуз-OC1 и NP-Вуз-OC1 клетки - клетки метили с анти-Prestin антител и наблюдаемых с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии (А) В клетках Р-Вуз-OC1 Prestin immunolocalized главным образом на цитоплазма (стрелки). (В) В клетках NP-Hei-OC1, в противоположность этому , Prestin реактивность была сосредоточена на плазматической мембране (стрелки). (С и D) , методом проточной цитометрии исследований в Hei-OC1 клеток , культивированных в течение 2 -х недель при условиях Np (D) показал явное увеличение Prestin экспрессии по отношению к клеткам Р-Hei-OC1 (C). (C) Врезка является вторичным AB только (отрицательный контроль). Измененный ссылки 9.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: НЖК исследования в P-Hei-OC1 и NP-Hei-OC1 клетки (А) патч-зажаты HEI-OC1 ячейки.. (B - D) НЖК в P-Hei-OC1 и NP-Вуз-OC1 клетки. Обратите внимание на снижение пика НЖК и прогрессивный сдвиг кривых более деполяризованных значения в ячейках NP-Вуз-OC1. Измененный ссылки 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом докладе мы опишем, как культура клеток HEI-OC1 и использовать их для оценки механизмов цитотоксичности медикаментозного и исследовать функциональные свойства Prestin, молекулярного двигателя кохлеарной OHCs. Технические процедуры, однако, являются достаточно общими, чтобы быть легко адаптирована к различным исследованиям.
Все протоколы , описанные здесь , требуют правильного использования хорошо зарекомендовавших себя методов клеточной культуры 10. Так же, как с любой другой клеточной линии, работая с клетками HEI-OC1 требует правильно оборудованной клеточной культуры объекта, заверенный бокс биологической безопасности, охлаждаемой центрифуге, водяной бане, и один инвертированный микроскоп для исследования клеточных культур и для подсчета клеток при использовании hemocytometric техники. Уникальное требование, однако, является наличие двух увлажненных инкубаторах один набор при 33 ° C / 10% СО 2 для клеток P-Вуз-OC1 и другие при 39 ° C / 5% CO 2 для NP-Вуз-OC1 клеткиs. Если запланированные исследования включают только Р-Hei-OC1 клетки, второй инкубатор может быть установлена на уровне 37 ° C / 5% CO 2 для различных анализов.
Использование пластиковой посуды для культивирования клеток является важным дополнительным условием для работы с клетками HEI-OC1. На самом деле, Вуз-OC1 клетки являются очень прочными, и они будут рост в различных поверхностях и в очень разных условиях. Тем не менее, их фенотип и их реакция на лекарства и другие раздражители будут сильно зависеть от параметров культуры (G & F Kalinec Kalinec, неопубликованный). Как мы утверждали в предыдущей работе 8, эта Пластичность клеток Hei-OC1 могут быть с успехом использованы для разработки новых опыта. Например, хорошо известно , что парциальное давление кислорода в кохлеарного перилимфой значительно ниже (~ 2 кПа) , чем в обычном инкубаторе на уровне моря (~ 21,3 кПа) 27. Инкубация клеток HEI-OC1 при более низкой концентрации O 2 будет изменять свои ответы, возможно , делает их лучшую модель для аудитаORY сенсорные клетки.
Следует подчеркнуть , что описанные протоколы для культуры и субкультуры клеток Hei-OC1 также могут быть использованы с другими слуховыми клеточных линий , разработанных в нашей лаборатории из той же трансгенной мыши, например, OC-K3 от органа Корти 11,12 и С.В. -k1 из полоской vascularis 13,14. Более того, эти клеточные линии могут быть полезны в качестве контроля для клеток Hei-OC1 в отдельных экспериментах. Например, недавно мы использовали SV-К1 , чтобы продемонстрировать , что обратно пропорционально иммунореактивности к Prestin и Na + , K + АТФазы антител в плазматической мембране клеток Hei-OC1 был типа клеток зависимый ответ , а не связан с трансгенной мыши из которой эти клетки были получены 9.
Другое важное требование для работы с клетками HEI-OC1 является практика соответствующих асептических методов, таких как очистка всех рабочих поверхностей внутри шкафа безопасности с 70% еthanol или изопропиловый спирт и обезвреживание любых материалов, необходимых для проведения процедур. Тем не менее, в то время как другие клеточные линии млекопитающих часто защищены от случайного бактериального загрязнения с помощью пенициллина-стрептомицина или других подобных комбинаций, антибиотики никогда не должны быть использованы с клетками HEI-OC1, за исключением, если цель исследования состоит в том, чтобы исследовать их эффекты. Клетки HEI-OC1 были получены в антибиотических свободных условиях, и они должны избегать, чтобы уменьшить появление устойчивых к антибиотикам клеток.
И, наконец, мы хотим еще раз подчеркнуть точку уже несколько раз упоминается в этом докладе: фенотип и реакция клеток HEI-OC1 к лекарственным препаратам и других раздражителей будет сильно зависеть от параметров культуры. Поэтому очень важно, чтобы лаборатории, работающие с клетками HEI-OC1 используют аналогичные протоколы и условия культивирования клеток для того, чтобы сделать их результаты действительно сопоставимы с представленными другими группами. Кроме того, онаОчень важно помнить, что клеточная линия Hei-OC1 только модель, со всеми ограничениями, что модель. Ожидая , что в пробирке эксперименты с клетками HEI-OC1 будет предоставлять данные точно представляющие ответы в естественных условиях реальных слуховых сенсорных клеток нереально. Тем не менее, мы твердо убеждены, клеточная линия Hei-OC1 является полезной моделью для исследования функциональных ответов слуховых сенсорных клеток и скрининг потенциальных ототоксичность фармакологических препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
Cell culture dishes , PS, 60 mm x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
Cellstar tissue culture flasks 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
Cellstar tissue cultur flasks 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom | Greiner Bio-One | 655098 | |
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I.
Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015). - Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).