Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Werken met Auditieve HEI-OC1 Cells

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Introduction

Huis Ear Institute-orgaan van Corti 1 (HEI-OC1) cellen afkomstig van het auditieve orgaan van een transgene muis 1,2. Incubatie van een cel van deze transgene muizen bij 33 ° C / 10% CO 2 (permissieve omstandigheden) induceert expressie van een gen dat het onsterfelijk de-differentiatie en proliferatie versnelde triggers; het verplaatsen van de cellen 39 ° C / 5% CO 2 (non-permissie-omstandigheden) daalt de proliferatie, differentiatie en, althans bij HEI-OC1, celdood 2,3.

HEI-OC1 cellen werden gekloneerd en gekarakteriseerd in ons laboratorium tien jaar geleden en initiële studies aantonen dat specifieke merkers van cochleaire haarcellen, zoals prestin, myosine 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin en calmoduline, maar ook markers ondersteunen drukken cellen zoals connexine 26 en fibroblast growth factor receptor (FGF-R) 2. Daarom werd gesuggereerd dat HEI-OC1 een commo kunnen vertegenwoordigenn progenitor voor sensorische en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti 2. Parallel studies levert sterke aanwijzingen dat ototoxic drugs zoals cisplatine, gentamicine en streptomycine geïnduceerde caspase-3-activering in deze cellen archetypische, terwijl de drugs beschouwd als niet-ototoxische, zoals penicilline, niet 2,3. Daarom werd deze cellijn voorgesteld als een in vitro systeem om de cellulaire en moleculaire mechanismen ototoxiciteit en voor het screenen van potentiële ototoxiciteit of otoprotective eigenschappen van nieuwe farmacologische middelen te onderzoeken. Geschat wordt dat HEI-OC1 cellen zijn in meer dan honderdvijftig studies gepubliceerd in de afgelopen tien jaar.

Dat waarbij de mogelijkheden pro-apoptotisch effect van verschillende geneesmiddelen was de belangrijkste doel van de meeste onderzoeken met deze cellijn zijn andere belangrijke celprocessen zoals autofagie en senescentie net begonnen te onderzoeken in HEI-OC1 cellen 4-7. ikna recent onderzoek van ons laboratorium 8, gebruikten we HEI-OC1 cellen om een uitgebreide set van gegevens over celdood, overleving, proliferatie, veroudering en autofagie veroorzaakt door verschillende farmacologische drugs vaak gebruikt in de kliniek te verzamelen. We vergeleken ook enkele van de reacties van HEI-OC1 cellen met die uit HEK-293 (humane embryonale niercellen) en HeLa (menselijke epitheelcellen) die een identieke behandeling. Onze resultaten gaven aan dat HEI-OC1 cellen reageert op elk geneesmiddel op karakteristieke wijze, met een kenmerkende dosis- en tijdsafhankelijke gevoeligheid voor ten minste één van de mechanismen van de studie. Ook benadrukt dat onderzoek dat een correcte interpretatie van de experimentele resultaten vereist uitvoeren parallel onderzoek met meerdere techniek 8.

In een andere studie onderzochten we het gebruik van HEI-OC1 cellen de functionele respons van prestin, de motor eiwit van cochleaire buitenste haarcellen (OHCS) 9 evalueren + K + ATPase, die translocatie van het plasmamembraan naar het cytoplasma zonder significante veranderingen in de totale cel expressie. Bovendien hebben we aangetoond dat P-HEI-OC1 cellen een sterke NAR geassocieerd motorfunctie die af wanneer de dichtheid van prestin moleculen aanwezig in het plasmamembraan toegenomen Prestin. In totaal hebben deze resultaten een groot voorstander van het nut van HEI-OC1 cellen auditieve eiwitten te onderzoeken.

In deze video artikel beschrijven we hoe de cultuur HEI-OC1 cellen, waarom is het handig om cellen te gebruiken groeien in permissieve omstandigheden (P-HEI-OC1) voor cytotoxiciteit studies, hoe het mechanisme / s van geneesmiddel-geïnduceerde cytotoxiciteit en hoe evalueren om elektrofysiologische studies uit te voeren (bijvoorbeeld patch-clamp, niet-lineaire capaciteit (NLC)) naar functionele eigenschappen van prestin, de moleculaire motor van cochleaire OHCS onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultuur van de Cel

Opmerking: Alle celkweek protocollen moeten worden uitgevoerd met behulp van de juiste celkweek technieken (referentie: zie de eerste 3 hoofdstukken of Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volume I 10). HEI-OC1 cellen geen extra bekleding of behandeling van de celcultuurschalen voor een goede hechting en groei vereisen. Heel belangrijk: gebruik geen glaswerk gerechten voor celkweek doeleinden; het fenotype en biologische respons van de cellen farmacologische drugs (G Kalinec & F Kalinec, ongepubliceerd) wijzigen; conventionele plastic celkweek gerechten worden aanbevolen (zie tabel of Materials / Equipment). Speciale aandacht besteden aan aseptische technieken om besmettingen te voorkomen, maar nooit gebruik van antibiotica (bijvoorbeeld ampicilline of streptomycine) met HEI-OC1 cellen. Gebruik eventueel amfotericine B. Terwijl HeLa en HEK-293-cellen werden gebruikt als controle in studies met HEI-OC1 8, een andere cellijn konacceptabel hiervoor.

  1. Reanimatie van Frozen HEI-OC1 Cells
    Opmerking: Dit protocol kan ook worden gebruikt met andere cellijnen van dezelfde transgene muis ontwikkeld in ons laboratorium, zoals OC-k3, van orgaan van Corti 11,12 en SV-k1 uit stria vascularis 13,14.
    1. Verwijder een flacon van gecryopreserveerde HEI-OC1 cellen van vloeibare N2, en plaats deze in een waterbad bij 37 ° C. Dompel alleen de onderste helft van het flesje, en laat het ontdooien tot slechts een kleine hoeveelheid ijs in de flacon blijft. Veeg de buitenkant van het flesje met 70% alcohol.
    2. Pipetteer de cellen van de flacon en leveren het gehele volume (~ 1,5 x 10 5 cellen / ml) langzaam druppelsgewijs in een 15 ml conische buis met 10 ml voorverwarmd kweekmedium, zoals Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium ( DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
    3. DMSO verwijderen door centrifugeren van de buis bij 300-500 g gedurende 5 min en gooi thij supernatant en opnieuw suspenderen van de cellen in 9 ml vers kweekmedium (DMEM + 10% FBS). Splitsen klompen of vellen van cellen door en vloed van de gesuspendeerde cellen, de pipet aan het medium en vice-versa, drie tot vier keer met de punt van de pipet aanraken van de bodem van de buis.
    4. Plaats de totale cellen gesuspendeerd in groeimedium in 100 mm diameter onbehandelde plastic celcultuurschalen.
    5. Incubeer de cellen bij 33 ° C met 10% CO2 (permissie-omstandigheden).
  2. Subcultuur van HEI-OC1 Cells
    Opmerking: Alvorens confluentie (~ 80%) van de cellen dient om de kweek dood voorkomen in suspensie en sub-gekweekt worden gebracht. Dit protocol kan ook gebruikt worden met andere cellijnen in ons laboratorium ontwikkeld uit hetzelfde transgene muis, zoals OC-k3, van orgaan van Corti 11,12 en SV-k1 uit stria vascularis 13,14.
    1. Verwijder oude medium en was de cellen met 2 ml PBS. </ Li>
    2. Bedek de cel monolaag met een oplossing van 0,25% trypsine, middels 1 ml per 25 cm 2 oppervlakte. Door te gaan naar de volgende stap meer dan 40% van de cellen moet worden losgemaakt. Onderzoek de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop en eventueel "klap of tik" de kweekschalen zachtjes resterende gehechte cellen los.
      Let op: Wees voorzichtig als behandeling met trypsine voor lange periodes kan celdood veroorzaken; niet genoeg en de overgedragen cellen onvoldoende voor de geplande studies.
    3. Resuspendeer de cellen, volgens de in 1.1.3 beschreven procedure, en overbrengen naar een 15 ml conische buis.
    4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300-500 xg, gooi het medium, het verzamelen van de cellen met vers groeimedium en zaden ze in tenminste vier 100 mm diameter celcultuurschalen. Het aantal cellen per schaal hangt af van de hoeveelheid cellen teruggewonnen. Incubeer de cellen bij 33 ° C met 10% CO2 (P-HEI-OC1) en die nodig zijn voor splitsen weer zo vaakde geplande experimenten of voor het genereren van een nieuwe voorraad.
    5. Voor voorraad voorbereiding, vervangt 100 mm-schalen met een diameter van 250-550 ml celkweek kolven; voor experimenten kunnen kleinere gerechten of multi-putjesplaten meer voldoende.
    6. Voor differentiatie, incubeer HEI-OC1 cellen bij permissieve omstandigheden totdat ze ~ 80% samenvloeiing; verplaats de gerechten 39 ° C met 5% CO 2 (NP-HEI-OC1) gedurende 2 tot 3 weken.
      Opmerking: Cellen zal geleidelijk stoppen uitdijende en sterven. Verander het medium om de andere dag om de dode cellen te verwijderen. Afhankelijk van het oorspronkelijke aantal cellen, meestal na ongeveer 4 weken geen cellen meer beschikbaar experimenten is. Differentiatie begint zodra de cellen bij NP voorwaarden is geplaatst, maar niet alle cellen differentiëren in hetzelfde tempo. Belangrijk is Prestin expressie en membraan lokalisatie stijgt tijdens de differentiatie proces (zie Representatieve resultaten, Figuur 4), die een kwalitatieveen kwantitatieve indicatie van de mate van differentiatie.

2. Drug cytotoxiciteit Studies

Opmerking: HEI-OC1 cellen gekweekt bij permissieve omstandigheden (P-HEI-OC1) aanbevolen voor deze studies (zie Representatieve resultaten Figuur 1).

  1. Levensvatbaarheid van de cellen (MTT-test)
    1. Verzamel P-HEI-OC1 cellen door de procedure beschreven in 1,2 en tel ze ofwel met een automatische celteller of hemocytometer. Stel de concentratie 2,0 x 10 5 cellen / ml.
    2. Zaad de cellen op 96-well clear platbodem platen (100 ul per putje), incubeer overnacht voor bevestiging aan het substraat, en vervolgens behandelen met medicijnen plaats. Vergeet niet om spaties en niet-behandelde cellen (controle) bevatten!
    3. Na behandeling met geneesmiddelen (gewoonlijk 24 of 48 uur bij 33 ° C), voert de MTT assay volgende protocol van de fabrikant. In het algemeenDe protocollen voor deze test de volgende stappen:
      1. Voeg 10 ul MTT-reagens aan elk putje.
      2. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 2-4 uur totdat paarse kleurstof zichtbaar en voeg 100 ul van de MTT Detergent reagens aan elke well. Raak de plaat niet schudden.
      3. Bedek de plaat en laat het in het donker gedurende 2-4 uur bij 37 ° C.
      4. Gebruik een microplaat plaat lezer absorptie bij 570 nm te meten in elk putje, met inbegrip van de lege plekken (groeimedium alleen). Normaliseren gegevens met de gemiddelde OD controle cellen als 100% levensvatbaarheid.
  2. Caspase 3/7 Activation Assay
    Opmerking: HEI-OC1 cellen gekweekt bij permissieve omstandigheden (P-HEI-OC1) aanbevolen voor deze studies.
    1. Verzamel HEI-OC1 cellen door de procedure beschreven in 1,2 en tel ze ofwel met een automatische celteller of een hemocytometer. Stel de concentratie 2,0 x 10 5 cellen / ml.
    2. Zaad de cellen op white wanden 96-well platen (100 ui per putje), incubeer overnacht voor bevestiging aan het substraat, en vervolgens behandelen met medicijnen plaats. Vergeet niet om spaties en niet-behandelde cellen (controle) bevatten!
    3. Na behandeling met geneesmiddelen (gewoonlijk 24 of 48 uur bij 33 ° C), voert de caspase assay volgende protocol de betreffende fabrikant. In het algemeen, de protocollen voor deze test de volgende stappen:
      1. Bereid de reagentia, meng ze goed, en laat ze op kamertemperatuur komen.
      2. Verwijder de cellen uit de incubator en laat de platen equilibreren tot kamertemperatuur.
      3. Voeg de aangegeven hoeveelheid reagens aan elk putje, let daarbij goed op kruisbesmetting door putjes met verschillende monsters met dezelfde pipet tips niet aanraken te voorkomen.
      4. Bedek de plaat en meng gedurende 30 seconden met behulp van een plaat schudder bij 300-500 tpm.
      5. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min. determine de optimale incubatietijd empirisch. Als de ruimte temperatuur schommelt gebruik maken van een constante temperatuur incubator, omdat temperatuurschommelingen luminescentie lezing zal beïnvloeden.
      6. Meet luminescentie in elk putje, en normaliseren gemiddelde waarden met luminescentie in controlecellen als 100% van caspase activering.
  3. Celdeling (proliferatie)
    1. Verzamel HEI-OC1 cellen door de procedure beschreven in 1,2 en tel ze ofwel met een automatische celteller of een hemocytometer. Stel de concentratie 2,0 x 10 5 cellen / ml.
    2. Zaad de cellen op 96-well clear platbodem platen (100 ul per putje), incubeer overnacht bij permissieve condities voor bevestiging aan de ondergrond, en vervolgens behandelen met medicijnen plaats. Vergeet niet om spaties en niet-behandelde cellen (controle) bevatten!
    3. Een uur na de behandeling, toe te voegen aan elk putje 1 pl van bereide 100x BrdU (5-Broom-2'-deoxyuridineren) oplossing, en de platen terug naar de incubator bij 33 ° C.
    4. Na 12, 24 en 48 uur, verwijder het medium bestaande uit de overeenkomstige platen en wassen elk putje eenmaal met PBS.
    5. Voer de celproliferatie assay volgens het protocol van de fabrikant. In het algemeen, de protocollen voor deze test de volgende stappen:
      1. Bereid de reagentia, inclusief bevestigingsset / denaturerende oplossing, wasbuffer, primaire antilichaam opsporen oplossing, secundaire detectie antilichaamoplossing en BrdU oplossing als beschreven in het protocol van de fabrikant.
      2. Voeg de vaststelling / denaturerende oplossing aan elk putje in de in protocol van de fabrikant bedragen, en houdt de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
      3. Verwijder de bevestiging / denaturerende oplossing en voeg het primaire antilichaam op de in protocol van de fabrikant concentratie. Houd de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      4. Verwijder de oplossing met de primaire antibody, was de plaat 3 keer met wasbuffer, en voeg dan het secundaire antilichaam op de in protocol van de fabrikant concentratie. Houd de plaat met het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
      5. Verwijder de oplossing met het secundaire antilichaam, was de plaat 3 keer met wasbuffer, en voeg de ondergrond. Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, voeg de stopoplossing. Wees voorzichtig: Controle van de verandering in kleur; Als de oplossing zeer donker, stop de reactie vóór de standaard ontwikkelingstijd voor 10 min.
      6. Lees absorptie bij 450 nm in 30 min van het toevoegen van de stopoplossing.
  4. cytotoxiciteit
    Opmerking: HEI-OC1 cellen gekweekt bij permissieve omstandigheden (P-HEI-OC1) aanbevolen voor deze studies.
    1. Incubeer bij permissieve omstandigheden, meestal voor 24-48 uur, HEI-OC1 cellen in celkweek medium alleen (controle) of medium plus de drugs van belang.
    2. Na afloop van de behandeling, Driemaal wassen van de cellen met PBS en los gebruik 1 ml per 25 cm2 van de oppervlakte van een niet-enzymatische cel dissociatie oplossing gedurende 3 min.
    3. Na het aftrekken verzamelen en pellet de cellen door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 5 minuten, de bovenstaande vloeistof, en vlekken op de cellen gedurende 15 minuten in het donker met het reagens in cytotoxiciteit assay.
    4. Bepaal het aantal levende HEI-OC1 cellen door flowcytometrie zoals aangegeven door de fabrikant van de stromingscytometer.
  5. senescentie
    1. Incubeer bij permissieve omstandigheden, meestal voor 24-48 uur, HEI-OC1 cellen in celkweek medium alleen (controle) of medium plus de drugs van belang.
    2. Bepaal het aantal senescentie geassocieerde beta-galactosidase positieve cellen met flowcytometrie met de door Debacq-Chainiaux et al. 15 of andere bekende werkwijze betrouwbare resultaten opleveren protocol. Een kort protocol voor flowcytometrie is de volgende:
        <li> Aan het einde van de experimentele behandelingen, driemaal wassen van de cellen met PBS en daarna geïncubeerd met 100 nM te bafilomycine A1 in celkweekmedium gedurende 1 uur bij permissie-omstandigheden.
      1. Voeg C12FDG bij een uiteindelijke concentratie van ~ 33 uM, en verder het incuberen van de cellen gedurende 1-2 uur.
      2. Was de cellen tweemaal met PBS, geoogst ze met 1 ml per 25 cm2 van de oppervlakte van een niet-enzymatische cel dissociatie oplossing gedurende 3 minuten, en ze pellet door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 5 minuten.
      3. Resuspendeer de cellen in ijskoude PBS en bepaal het aantal positieve HEI-OC1 cellen door flowcytometrie zoals aangegeven door de fabrikant van de stromingscytometer.
  6. autofagie
    1. Verzamel HEI-OC1 controlecellen en uitgehongerd (verstoken van serum gedurende 48 uur) door de procedure beschreven in 1.2 en verwerken voor Western blot na standaardprotocollen. In het algemeen, de protocollen voor Western blot de volgende steps:
      1. Zaad HEI-OC1 cellen in 6-well platen bij een concentratie van 1,0 x 10 5 cellen / ml. Na 24 en / of 48 uur, was de cellen met ijskoude PBS.
      2. Lyse met 200 pl TNESV buffer (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4) met een cocktail van proteaseremmers en PMSF 1 mM gedurende 5 minuten op ijs.
      3. Verzamel de cellen (door schrapen de bodem van elk putje), transfer naar microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 16.800 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
      4. Verzamel de bovenstaande vloeistof en kwantificeren van de eiwitconcentratie met behulp van de BCA Assay.
      5. Voeg 5x laadbuffer en 1 mM DTT aan elk monster en koken gedurende 5 minuten om de eiwitten te denatureren.
      6. Voer de monsters met behulp van SDS-PAGE op een 4-12% gel, en transfer naar PVDF-membranen.
      7. Blokkeer de membranen met 5% magere melkpoeder in TBS-T met 0,1% Tween 20 gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
      8. Incubeer de membranen een nacht bij 4 ° C met primaire antibodies.
      9. De volgende dag was de membranen uitvoerig met TBS-T, en geïncubeerd met een secundair IgG antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) (1: 1500) gedurende 1 uur.
      10. Detecteren immunoreactiviteit met versterkte chemiluminescentie (ECL) detectiesysteem. Normaliseren eiwitexpressie niveaus met behulp van GAPDH (1: 2000 in TBS-T met 10% magere melkpoeder) als standaard.
    2. In de Western blots onderzocht de expressie van ten minste twee verschillende merkers voor autofagie zoals beclin-1 en LC3B (meestal 1: 1000 verdunning in TBS-T met 2,5% BSA). Vergeet niet om te zoeken naar een regeling van eiwitexpressie, zoals GAPDH of actine.
    3. Evalueer de expressie van het eiwit van belang met densitometrie onder toepassing van een digitale scanner of Blot computersoftware, zoals het publieke domein NIH Image of ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Elektrofysiologie Experimenten met HEI-OC1 Cells

  1. Oogsten Cells
    Opmerking: Gebruik de cellen groeien in diameter van 100 mm cultuur gerechten op 50% -80% samenvloeiing. Trypsine, Accutase, enzymvrije oplossing of p hosphate- b uffered s aline + e ethyleen d iamine t ETRA een cetic zuur (PBS-EDTA) worden gebruikt voor het optillen van de cellen zonder significante effecten op het aantal en de kwaliteit van de gigaseals . In sommige gevallen echter, trypsine behandeling maakt de cellen kwetsbaarder. In deze gevallen kan de cellen te herstellen gedurende ongeveer 30 minuten voor de experimenten.
    1. Was de cellen tweemaal met 10 ml PBS zonder Ca2 + en Mg2 +.
    2. Voeg 2 ml van een enzym-vrije ontkoppelaar oplossing, zoals niet-enzymatische cel dissociatie oplossing en incubeer de gerechten gedurende 3 min bij 37 ° C met 5% CO2.
    3. Gebruik een omgekeerde microscoop om het detachement van de cellen te controleren. Indien nodig verplaatst de cell cultuur schotel om meer cellen los, maar doe het voorzichtig.
      Let op: Schud het gerecht.
    4. Voeg 10 ml DMEM + 10% FBS en de cellen pipet zachtjes op en neer vijfmaal met een 10 ml pipet.
    5. Kijken naar de cellen onder een microscoop. Als> 80% van de cellen reeds zijn gescheiden (single), wordt geen verdere pipetteren nodig. Als de cellen nog in clusters, herhaal de voorzichtig pipetteren tot meer dan 80% van de cellen zijn single.
    6. Plaats de ~ 10 ml gesuspendeerde cellen in een 15 ml conische buis, centrifugeer gedurende 2 min bij 100 xg, Verwijder de bovenstaande vloeistof.
    7. Gebruik ~ 200 ul externe opnameoplossing (Leibovitz L-15 medium ingesteld op 305-310 mOsm met gedestilleerd water) om de cellen te resuspenderen. Een optische controle van de cellen moeten veel alleenstaande, ronde cellen met gladde membraan randen te tonen.
  2. Patch-clamp en NLC Metingen
    1. Voer patch-clamp en metingen van voltage-afhankelijke niet-lineaire capaciteit (NLC) met behulp van eendequate versterkers en software en standaard elektrofysiologische technieken. Als interne (intrapipette) oplossing gebruikt 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na en 10 mM HEPES; breng de pH op 7,2 met Tris.
    2. Onder de microscoop, selecteert één gezonde cel, met ronde en gladde randen membraan. Bevestig het uiteinde van de glazen pipet naar het celoppervlak en controleer membraanweerstand. Dit moet ongeveer 3-6 megaohms, overeenkomend met een binnendiameter (ID) van de punt van de pipet ~ 2 pm.
    3. Druk de micropipet tip tegen de cel plasmamembraan en daarna afzuigen. Een deel van het celmembraan wordt opgezogen in de pipet, het genereren van een elektrische weerstand in de orde van 10-100 gigaOhms (gigaseal).
    4. Bepaal de whole-cell conditie door het verstoren van de plasmamembraan met afzuiging pulsen.
    5. Met cellen die geen prestin expressie brengen, zoals HEK-293, als controle 9.
      Opmerking: De huidige maatregelen moeten worden gefilterd bij 5 kHz en correcties voor de effecten van overblijvende serieweerstand. Alle gegevensverzameling en de meeste analyses kunnen worden uitgevoerd met de software doorgaans bij de lock-in versterkers. Capaciteit functie kan worden bevestigd aan de eerste afgeleide van een twee staat Boltzmann functie betrekking lineaire lading aan membraanspanning 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In een aantal recente publicaties berichtten we een uitgebreide reeks van studies gericht op het evalueren van de respons van de HEI-OC1 cellen om diverse veelgebruikte farmacologische drugs evenals onderzoeken prestin functie 8,9. In deze studies maakten we gebruik van alle in de voorgaande paragrafen beschreven protocollen.

Een van de resultaten van deze eerdere studies was dat HEI-OC1 cellen gekweekt bij niet-permissieve omstandigheden (39 ° C / 10% CO2 = NP-HEI-OC1) vertoonde een zeer significante afname in cellevensvatbaarheid en een even significante stijging celdood, ten opzichte van cellen gekweekt bij permissieve omstandigheden (33 ° C / 10% CO2 = P-HEI-OC1) (figuur 1). Daarom moet elke cytotoxiciteit studie uitgevoerd op NP-HEI-OC1 cellen moeten aanzienlijke inspanningen in discriminerende effecten van geneesmiddelen tegen de gevolgen van de kweekomstandigheden te wijden. in addition, aangezien effecten van geneesmiddelen op cellen al sterven of met een verminderde levensvatbaarheid zou anders kunnen zijn dat de effecten van hetzelfde geneesmiddel op gezonde cellen, raden we u aan P-HEI-OC1 cellen voor experimenten die niet specifiek gedifferentieerde cellen nodig hebben.

Onze studies naar het effect van verschillende farmacologische middelen ook interessante resultaten. Bijvoorbeeld cisplatine, een chemotherapeutisch middel vaak gebruikt voor de behandeling van verschillende menselijke maligniteiten, en acetaminofen (APAP N = een cetyl- pa ra p-amino henol), de meest verkochte over-the-counter pijnstiller in de USA, waren beide toxisch HEI-OC1-cellen (figuur 2). Hoewel APAP cellevensvatbaarheid en verhoogde caspase activatie 3/7, het niet celdood induceert. Cisplatine daarentegen sterk toegenomen drie reacties (figuur 2). Interessant is dat caspases 3/7 waren mostly actief bij lagere concentraties cisplatine, wat suggereert dat celdood geïnduceerd door lage doses cisplatin werd waarschijnlijk gemedieerd door apoptose, terwijl hoge doses letale effecten kunnen worden geassocieerd met oncosis / necroptose. Hoewel oncosis is gedefinieerd als een pre-dodelijke route leidend tot gereguleerde celdood begeleid door cellulaire organellen en zwelling, blebbing en verhoogde membraanpermeabiliteit 17,18, necroptose een gereguleerde niet-apoptotische celdood mechanisme geactiveerd door dezelfde stimuli die leiden apoptose maar met morfologische kenmerken overeenkomen met die van oncosis 19-22.

Aanvullend onderzoek wil nagaan van de effecten van APAP en cisplatine op P-HEI-OC1 cellen vertoonden een duidelijke dosis-afhankelijke effect van APAP op celproliferatie die de intrigerende afname in cellevensvatbaarheid zonder celdood in de vorige paragraaf omschreven kunnen verklaren (fig 3A). cisplatine als o verminderde celproliferatie en het effect aangevuld met blootstellingstijd zelfs voor kleine hoeveelheden (Figuur 3A), maar daarnaast verminderde veroudering bij alle concentraties en tijdstippen in onze studie (Figuur 3B). De significante afname in cel senescentie geïnduceerd door cisplatine worden verklaard door de toename van celdood, ervan uitgaande dat verouderde cellen zou zijn, waarschijnlijk gevoelig sneller dan gezonde cellen 23 sterven.

Belangrijk is dat deze representatieve resultaten suggereren dat HEI-OC1 cellen reageren op verschillende farmacologische middelen met een kenmerkende dosis- en tijdsafhankelijke gevoeligheid voor ten minste één van de mechanismen van de studie. Daarom zal een correcte interpretatie van elke experimentele resultaat een duidelijk begrip van de specifieke cellulaire processen onderzocht en de door elk van de technieken te evalueren informatie.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> confocale en flowcytometrie-experimenten, anderzijds, bevestigd prestin expressie in P-HEI-OC1 en NP-HEI-OC1 cellen, met prestin immunolocalizing meestal op cytoplasma van P-HEI-OC1 cellen (Figuur 4A, pijlen), en geconcentreerd in de plasmamembraan in NP-HEI-OC1-cellen (Figuur 4B, pijlen). Flowcytometrie studies toonden een duidelijke toename prestin expressie in NP-HEI -OC1 cellen respecteren P-HEI-OC1 cellen (figuren 4C en 4D). De tijdsafhankelijke toename van expressie en plasmamembraan lokalisatie van prestin in NP-HEI-OC1 cellen suggereert dat translocatie werd vergezeld door de synthese van meer prestin moleculen. echter, deze experimenten geen aanwijzingen geven om te beslissen of prestin moleculen oorspronkelijk in het cytoplasma zet de plasmamembraan en nieuwe moleculen te vervangen, als ze in het cytoplasma blijven en alleen de nieuw synthesized prestin gaat naar het plasmamembraan, of een combinatie van beide processen.

Elektrofysiologische studies toonden een sterke NLC in P-HEI-OC1-cellen (Figuur 5B), met een piekwaarde die verminderd en een spanning op piek capaciteit die verschoven naar meer gedepolariseerde waarde, wanneer de cellen werden verplaatst naar non-permissie-omstandigheden voor 1 en 2 weken (figuren 5C en 5D). Door de geleidelijke translocatie van prestin van het cytoplasma naar het plasmamembraan, we oorspronkelijk hypothese dat NLC hoger NP-HEI-OC1 dan in P-HEI-OC1 cellen zou zijn, en dat deze verder zal toenemen met de tijd van incubatie bij NP conditie. Verrassend is dat de resultaten van onze studies toonden precies het tegenovergestelde reactie. Speculeerden wij dat de toename van de dichtheid van prestin moleculen in het plasmamembraan de motorfunctie kan worden beperkt.

hin-page = "1"> Merk in figuur 5 de depolarisatie van de spanning op maximale capaciteit in HEI-OC1 cellen ten opzichte van de typische waarden gerapporteerd in OHCS en in getransfecteerde HEK293-cellen 24; bovendien op dat de depolariserende verschuiving toeneemt met de tijd op NP omstandigheden. De progressieve depolarisatie verschuiving is gelijk aan die OHCS beschreven in muizen en ratten de ontwikkeling 25,26 en het werd gesuggereerd dat het kan worden gerelateerd aan de ontwikkeling van andere cellulaire structuren geassocieerd met het OHC plasmamembraan 25, of een rijpingsproces intrinsieke Prestin tot 24.

We hopen dat deze korte hertelling van een aantal studies met HEI-OC1 cellen genoeg bewijs van het potentiële nut van HEI-OC1 cellen voor het onderzoeken van een breed spectrum van cel- en moleculaire reacties.

ad / 54425 / 54425fig1.jpg "/>
Figuur 1: levensvatbaarheid van de cellen en celdood in P-HEI-OC1 en NP-HEI-OC1 Cells. (A) Levensvatbaarheid van de cellen geëvalueerd met de MTT assay. De absorptie werd gemeten met een Plate Reader en de gemiddelde OD controle cellen werd genomen als 100% levensvatbaarheid. (B) Celdood geëvalueerd met een cytotoxiciteitsbepaling. Het aantal positieve (dode) cellen werd bepaald onder toepassing van stroomcytometrie met 488 nm excitatie (blauwe laser) en FL1: 530 15 nm. Let op de zeer significant (P ≤0.001) afname in cellevensvatbaarheid (A) en een toename van celdood (B) geïnduceerd door niet-permissie-omstandigheden. Balken geven standaardfout van de middelen (SEM). Gewijzigd ten opzichte van referentie-8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

</ Html"Figuur 2" src = "/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
Figuur 2:. Reacties van HEI-OC1 cellen blootgesteld aan APAP en Cisplatine wanneer geanalyseerd door MTT, caspases 3/7 en Cytotoxiciteit assays (A) Levensvatbaarheid van de cellen geëvalueerd met de MTT-bepaling en de absorptie gemeten met een Plate Reader. (B) Activering van scherprechter-caspases 3/7. (C) Drug - geïnduceerde celdood geëvalueerd met een cytotoxiciteit assay; het aantal positieve (dode) cellen werd bepaald met flowcytometrie. Gegevens in elk experiment werd genormaliseerd naar de respectievelijke controle condities (controle = 1) mogelijke gelijktijdige statistische analyse maken. * = P ≤0.05 betrekking tot controle. Balken geven standaardfout van de middelen (SEM). Gemodificeerde fromreference 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Effecten van APAP en cisplatine op HEI-OC1 Cells 'mitosesnelheid en afsterven. (A) Drugs geïnduceerde veranderingen van de snelheid van mitotische deling van HEI-OC1 cellen na 24 en 48 uur werd geëvalueerd met BrdU assay. (B) door drugs geïnduceerde senescentie bij HEI-OC1-cellen werd gemeten door stroming cytometrie en senescence- geassocieerde β-galactosidase (SA-Bgal) techniek. Gegevens in elk experiment werd genormaliseerd naar de respectievelijke controle condities (controle = 1) mogelijke gelijktijdige statistische analyse maken. * = P ≤0.05 betrekking tot controle. Balken geven standaardfout van de middelen (SEM). Gemodificeerde fromreference 8. Klik hier om een grotere versie van t bekijkenzijn figuur.

figuur 4
Figuur 4:. Prestin Expressie in P-HEI-OC1 en NP-HEI-OC1 Cellen - De cellen werden gemerkt met anti-Prestin antilichaam en geobserveerd door confocale microscopie en flowcytometrie (A) In P-HEI-OC1 cellen prestin meestal immunolocalized op het cytoplasma (pijlen). (B) In NP-HEI-OC1 cellen daarentegen prestin reactiviteit werd geconcentreerd bij de plasmamembraan (pijlen). (C en D) Flowcytometrie studies in HEI-OC1 cellen gekweekt gedurende 2 weken bij NP omstandigheden (D) vertoonden een duidelijke toename van prestin expressie opzichte van P-HEI-OC1-cellen (C). (C) Inzet is secundaire ab alleen (negatieve controle). Gewijzigd ten opzichte van referentie-9.Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: NLC studies in P-HEI-OC1 en NP-HEI-OC1 Cells (A)-Patch geklemd HEI-OC1 cel.. (B - D) NLC in P-HEI-OC1 en NP-HEI-OC1 cellen. Let op de vermindering in de piek van NAR en de geleidelijke verschuiving van de curven meer gedepolariseerd waarden NP-HEI-OC1 cellen. Gewijzigd ten opzichte van referentie-9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit rapport beschrijven we hoe de cultuur HEI-OC1 cellen en ze gebruiken om mechanismen van geneesmiddel-geïnduceerde cytotoxiciteit te evalueren en functionele eigenschappen van prestin, de moleculaire motor van cochleaire OHCS onderzoeken. De technische procedures zijn echter algemeen genoeg om gemakkelijk worden aangepast aan verschillende onderzoeken.

Al de hier beschreven protocollen vereisen het juiste gebruik van gevestigde celcultuur technieken 10. Net als bij alle andere cellijn, het werken met HEI-OC1 cellen vereist een correct uitgerust celkweek faciliteit, met een gecertificeerde biologische veiligheid kabinet, een gekoelde centrifuge, een waterbad, en een omgekeerde microscoop voor het onderzoek van celculturen en voor het tellen van cellen als het gebruiken van hemocytometric technieken. Een unieke eis is echter de beschikbaarheid van twee bevochtigde incubatoren, een set bij 33 ° C / 10% CO2 gedurende P-HEI-OC1 cellen en andere bij 39 ° C / 5% CO2 gedurende NP-HEI-OC1 cells. Als de geplande studies slechts betrekking P-HEI-OC1 cellen, kan de tweede incubator ingesteld op 37 ° C / 5% CO2 gedurende verschillende assays.

Het gebruik van plastic celcultuurschalen een belangrijke bijkomende vereiste voor het werken met HEI-OC1 cellen. In feite, HEI-OC1 cellen zijn zeer robuust en zij zullen groei van verschillende oppervlakken en onder zeer verschillende omstandigheden. Echter, hun fenotype en hun reactie op drugs en andere prikkels zijn sterk afhankelijk van de cultuurparameters (G Kalinec & F Kalinec, ongepubliceerd). Zoals we in een vorige artikel 8 aangevoerd, kan deze plasticiteit van HEI-OC1 cellen met voordeel worden gebruikt om nieuwe experimenten te ontwerpen. Zo is het bekend dat de zuurstofspanning in de cochleaire perilymfe veel lager (~ 2 kPa) dan in een typische incubator op zeeniveau (~ 21,3 kPa) 27. Incubatie HEI-OC1 cellen bij lagere O 2 concentraties zullen hun reacties te veranderen, misschien waardoor ze een beter model voor de auditory zintuigcellen.

Er zij op gewezen dat de beschreven protocollen voor cultuur en subcultuur van HEI-OC1 cellen ook kunnen worden gebruikt met andere auditieve cellijnen in ons laboratorium ontwikkeld uit hetzelfde transgene muis, zoals OC-k3 van orgaan van Corti 11,12 en SV -K1 uit stria vascularis 13,14. Bovendien zouden deze cellijnen nuttig als controle HEI-OC1 cellen in bepaalde experimenten. Zo hebben we recent gebruikte SV-K1 cellen aan te tonen dat het omgekeerd evenredig immunoreactiviteit te prestin en Na + K + ATPase antilichamen op de plasmamembraan van HEI-OC1 cellen was celtype-afhankelijke respons dan gekoppeld aan de transgene muis van waarbij deze cellen werden afgeleid 9.

Er zijn andere essentiële voorwaarde voor het werken met HEI-OC1 cellen is de praktijk van de juiste aseptische technieken, zoals het reinigen van alle werkbladen in de veiligheid kast met 70% ethanol of isopropanol en de decontaminatie van materialen die nodig zijn voor de procedures. Hoewel andere zoogdiercellijnen vaak beschermd tegen onbedoelde bacteriële besmetting met penicilline-streptomycine of soortgelijke combinaties, antibiotica mag nooit worden gebruikt HEI-OC1 cellen behalve als het doel van de studie is om de effecten te onderzoeken. HEI-OC1 cellen werden gegenereerd in antibiotica-vrije omstandigheden en moeten worden vermeden om het ontstaan ​​van antibiotica-resistente cellen te verminderen.

Tot slot willen we opnieuw te benadrukken een punt al meerdere malen genoemd in dit rapport: het fenotype en de reactie van HEI-OC1 cellen aan drugs en andere stimuli zal sterk afhangen van de cultuur parameters. Daarom is het zeer belangrijk dat de laboratoria waar met HEI-OC1 cellen gebruiken soortgelijke protocollen en celcultuur condities om hun resultaten echt vergelijkbaar zijn met die van andere groepen maken. Bovendien iszeer belangrijk om te onthouden dat de HEI-OC1 cellijn is slechts een model, met alle beperkingen die een model heeft. Verwacht dat in vitro experimenten met HEI-OC1 cellen zullen accuraat die de in vivo reacties van echte auditieve zintuigcellen is onrealistisch te bieden. Echter, wij geloven sterk de HEI-OC1 cellijn is een bruikbaar model voor het onderzoeken van functionele reacties van auditieve zintuigcellen en de screening van de potentiële ototoxiciteit van farmacologische drugs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Tags

Cellular Biology HEI-OC1 cellen celkweek cytotoxiciteit celdood levensvatbaarheid van de cellen cel veroudering autofagie. FACS prestin motorische functie patch-clamp niet-lineaire capaciteit
Werken met Auditieve HEI-OC1 Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., … More

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter