Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

Summary

Een protocol om een poly (N–ISO propylacrylamide) (PIPAAm) gecoat microfilter voor een effectieve vangst en thermoresponsieve release van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) wordt gepresenteerd te benutten. Deze methode maakt het vangen van CTC uit het bloed van de patiënt en de daaropvolgende vrijlating van levensvatbare CTC voor downstream off-chip cultuur, analyses en karakterisering.

Abstract

We tonen een werkwijze voor de grootte gebaseerde vastlegging van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) van volbloed, samen met de introductie van deze cellen uit chip voor downstream analyse en / of cultuur. De strategie maakt gebruik van het gebruik van een nieuw slot Parylene C membraan porie microfilter CTC en een bekleding van poly (N-propylacrylamide -ISO) (PIPAAm) voor thermoresponsieve levensvatbare afgifte van de gevangen CTC vangen. De vangst van levende cellen wordt mogelijk gemaakt door gebruik te maken van het ontwerp van een sleuf porie geometrie met specifieke afmetingen voor de schuifspanning doorgaans geassocieerd met het filtratieproces verminderen. Terwijl het microfilter vertoont een hoge vangstrendement, het vrijkomen van deze cellen is niet triviaal. Meestal slechts een klein percentage cellen vrijkomen bij technieken zoals reverse flow of cel schrapen gebruikt. De sterke hechting van deze epitheliale kankercellen aan de Parylene C membraan is toe te schrijven aan niet-specifieke elektrostatische interactie. Om th tegen te gaanis effect, gebruikten we het gebruik van PIPAAm coating en benut de thermische responsieve grensvlakeigenschappen om de cellen los te maken van het filter. Bloed wordt eerst gefiltreerd bij kamertemperatuur. Beneden 32 ° C, PIPAAm hydrofiel. Daarna wordt het filter geplaatst in ofwel kweekmedia of een buffer op 37 ° C, waardoor de hydrofobe PIPAAm draaien, en vervolgens de elektrostatisch gebonden cellen los.

Introduction

Metastatische ziekte is verantwoordelijk voor de meeste sterfgevallen door kanker. Het ontwikkelen van prognostische en companion diagnostics biomarker voor metastase is van cruciaal belang bij kanker beheer en de behandeling. Circulerende tumorcellen (CTC) spelen een centrale rol in de tumor verspreiding en metastase. Bovendien bereikt u met gemak als een 'vloeibare biopsie' biomarker, CTC bij patiënten met kanker 'is het perifere bloed is gestegen als een' broeinest 'voor kanker biomarker onderzoek. CTC zijn goed gevalideerd als een prognostische biomarker in diverse kanker instellingen, waaronder borst-, prostaat- en darmkanker ^1-3. Echter, recente ontwikkelingen in CTC gebied heeft aangegeven dat de loutere opsomming van deze zeldzame cellen heeft beperkte klinische bruikbaarheid, zie interventionele klinische studies ^4. Er is dus een groeiende behoefte aan technologieën voor de moleculaire en functionele karakterisatie van CTC. Op dit moment, slechts enkele technologieën bestaan ​​die het mogelijk maken for niet-antigen bevooroordeeld, levensvatbare vangst en het vrijkomen van CTC, waardoor robuust downstream moleculaire en functionele analyse ^5,6. De meerderheid van deze microgefabriceerde inrichtingen zijn gekoppeld microfluïdische platforms en dus een beperkende factor in de hoeveelheid bloed die kunnen worden verwerkt, die varieert 2-4 ml ^7-10. CTC zijn zeldzame gebeurtenissen in één buis bloedafname (7,5 ml), zodat de hoeveelheid bloed die kan worden verwerkt teneinde, aanzienlijk belemmert de kans op het vastleggen en het isoleren van deze cellen plaats.

We hebben twee soorten Parylene C membraanmicrofilter apparaten ontwikkeld voor de vangst van CTC die de grootte verschillen tussen grotere tumorcellen en de kleinere normale bloedcellen ^11,12 exploiteren. We hebben eerder gemeld op de ronde porie opsomming filter en vergeleken met een door de FDA goedgekeurde platform, waar de microfilter bleek superieur in CTC afvangrendement te zijnvoor kanker bloed monsters van patiënten ^13,14. Echter, een beperking van de ronde filter is de noodzaak om een ​​fixeermiddel formaldehyde gebaseerde voorgebruik filtratie. Deze werkwijze behoudt de cellen morfologie terwijl ze de schuifspanning en druk te weerstaan ​​tijdens het filtratieproces. Terwijl opsomming en moleculaire studies kunnen worden uitgevoerd on-chip ^13, het fixeermiddel verslechtert het vermogen om functionele karakterisatie voeren. Om deze beperking te pakken hebben we een sleuf porie filter dat de noodzaak om cellen vóór filtratie (figuur 1) vast ontkent. De sleuf porievorm (6 um breed x 40 urn lengte sleuf poriën) maakt de tumorcellen achtereen maken door een porie gedeeltelijk occluderen en dus mogelijk blijft vrije doorgang van andere bloedcellen en verlichten de drukstijging die zou leiden tot celbeschadiging en eventuele barsten ^15,16 De sleuf poriën patroon bestaat uit 2 delen die acryl sandwichde sleuf porie filter tussen de bovenste en onderste stuk met Polydimethylsiloxane (PDMS) fungeren als een pakking om een lekvrije afdichting ^14,15 (figuur 1) te verstrekken.

Terwijl de afvangrendement van de sleuf porie filter hoog (Tabel 1), de vastgelegde CTC zijn gebonden aan de Parylene C membraan door sterke niet-specifieke elektrostatische interacties plaats van extracellulaire matrix (ECM) gemedieerde adhesie ^15. Werkwijzen zoals tegenstroom of het gebruik van cel schrapers niet aan de cellen daadwerkelijk los van het filter, of kunnen leiden tot celbeschadiging en celdood. We verkend een onconventionele gebruik van PIPAAm een versie strategie ¹⁵ te formuleren. PIPAAm is een polymeer dat een reversibele lagere kritische oplostemperatuur (LCST) faseovergang bij een oplossingstemperatuur van 32 ° C ¹⁷ ondergaat. Traditioneel is deze eigenschap van PIPAAm is op grote schaal onderzocht voor tissue engineering-toepassingen. Gewoonlijk cellengekweekt op PIPAAm gecoate oppervlakken bij 37 ° C wanneer PIPAAm hydrofoob. De cellen kunnen vervolgens worden losgemaakt als opgenomen wanneer de kweektemperatuur beneden 32 ° C, waarbij de PIPAAm beklede oppervlak wordt gehydrateerd ^17,18 verschoven is. We benut deze thermische eigenschappen door het uitvoeren van het filtratieproces bij kamertemperatuur (beneden 32 ° C) en daarna inschakelen cel afgifte door het plaatsen van het filter in kweekmedium bij 37 ° C. Bij deze temperatuur de PIPAAm polymeerlaag wordt hydrofoob, waardoor het elektrostatisch gebonden cellen ¹⁵ (Figuur 1) los.

Hoewel de temperatuurgevoelige werkwijze evenals andere werkwijzen met succes zijn uitgevoerd om levensvatbare CTC vangen bereiken kort ^19-21, een sleutel mogelijk nadeel gedeeld door deze technologieën gemeld is dat ze allemaal een antigeen-afhankelijke beginsel CTC capture gebruiken. Antigeenbasis CTC vast te leggen, zoals previously, kan leiden tot vertekende CTC analyse ^11,14. Bijvoorbeeld, veel technologieën affiniteit gebaseerde dienst antilichaam dat EpCAM bindt voor CTC vast te leggen. Echter CTC aangetoond dat verschillende niveaus van EpCAM tot expressie, waardoor weglaten van lage EpCAM en EpCAM negatieve CTC deze technologieën. Ook kunnen beperkingen optreden wanneer CTC van niet-epitheliale oorsprong is van belang, zoals CTC bij melanomen en sarcomen instellingen. Zo, een technologie die het mogelijk maakt voor levensvatbare CTC vast te leggen en het vrijkomen zonder mogelijke vertekening geïntroduceerd door antigen gebaseerde vastlegging is zeer wenselijk.

Belangrijker is het microfilter vastlegapparaat zuiver afmeting alsmede het vrijgavestrategie agnostische is de aanwezigheid van bepaalde oppervlaktemerkers. Wij zijn van mening dat de arbeidsovereenkomst van de PIPAAm gecoat microfilter zal bijdragen aan ons begrip van de metastatische proces uit te breiden, door middel van het verstrekken van de mogelijkheid om effectief en efficiënt te vangen en laat CTC voor downstream analyses. Dit kan potenteially bloot nieuwe moleculen waarvoor nieuwe gerichte systemische therapieën kunnen ook van gericht en verstrekt een biomarker die gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd en steun behandeling van kankerpatiënten.

Protocol

Ethiek Verklaring: Om de rechten van proefpersonen te beschermen, werden bloedmonsters verkregen na een geïnformeerde toestemming in het kader van protocollen door de Universiteit van Miami institutionele review boards onder IRB 20150020 goedgekeurd. LET OP: het bloed worden gefilterd voor CTC capture moet worden verzameld in een EDTA buis om stolling te voorkomen. 1. Coating de Microfilter met Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Weeg PIPAAm een ​​10% w / v oplossing in butanol bereiden…

Representative Results

Het gebruik van bloed gezonde donoren '(uit hoofde van een protocol door de Universiteit van Miami IRB 20.150.020 goedgekeurd na een informed consent) verrijkt met gekweekte kankercellen, de thermoresponsieve techniek voor het vrijgeven van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC), bereikte capture, vrijgave en retrieval efficiency respectievelijk 94% ± 9%, 82% ± 5% en 77% ± 5% (Tabel 1) 15. Ter vergelijking, de afgifte en ophalen efficiëntie onbek…

Discussion

Het proces van het vastleggen van levensvatbare CTC uit volbloed en het vrijgeven van hen uit de microfilter is betrekkelijk eenvoudig; Maar een paar kritische punten zijn het vermelden waard. Het is absoluut noodzakelijk, net als bij alle celcultuur die steriele toestand wordt gehandhaafd door het hele proces. De eerste stap van het bekleden van het filter met PIPAAm kritisch, als basis voor de techniek van het vrijgeven van de cellen van het filter is gebaseerd op het gebruikmaken PIPAAm de temperatuurgevoelige grensv…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice