Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre

Summary

Un protocolo para utilizar un poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro recubierto para la captura eficaz y la liberación de respuesta térmica de las células tumorales circulantes viables (CTC) se presenta. Este método permite la captura de CTC de la sangre de los pacientes y la posterior liberación de CTC viables para el cultivo aguas abajo fuera del chip, análisis y caracterización.

Abstract

Se demuestra un método para la captura basado tamaño de viable circulantes de células tumorales (CTC) de la sangre entera, junto con la liberación de estas células de chip para análisis y / o cultivo de aguas abajo. La estrategia emplea el uso de una novela parileno C microfiltro poro ranura membrana para capturar CTC y un revestimiento de poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) para termosensible liberación viable de la CTC capturado. La captura de células vivas se habilita al aprovechar el diseño de una geometría de poro ranura con dimensiones específicas para reducir la tensión de corte típicamente asociados con el proceso de filtración. Mientras que el microfiltro exhibe una alta eficacia de captura, la liberación de estas células no es trivial. Típicamente, sólo un pequeño porcentaje de las células se liberan cuando se utilizan técnicas tales como el flujo inverso o raspado celular. La fuerte adhesión de estas células cancerosas epiteliales a la membrana de parileno C es atribuible a la interacción electrostática no específica. Para contrarrestar THes efecto, hemos empleado el uso de recubrimiento PIPAAm y explotaron sus propiedades interfaciales de respuesta térmica para liberar las células del filtro. La sangre se filtró primero a temperatura ambiente. Por debajo de 32 ° C, PIPAAm es hidrofílico. A partir de entonces, el filtro se coloca en cualquiera de los dos medios de cultivo o un tampón mantenido a 37 ° C, lo que resulta en la PIPAAm girando hidrófobo, y posteriormente la liberación de las células electrostáticamente consolidados.

Introduction

La enfermedad metastásica es responsable de la mayoría de las muertes por cáncer. El desarrollo de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico compañero para la metástasis es crucial en el manejo y tratamiento del cáncer. Las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel central en la diseminación tumoral y la metástasis. Además, al ser de fácil acceso como un biomarcador 'biopsia líquida', CTC en pacientes con cáncer de la sangre periférica ha ido en aumento como un "caldo de cultivo" para la investigación de biomarcadores de cáncer. CTC han sido bien validado como un biomarcador de pronóstico en diversos entornos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, de próstata y el cáncer colorrectal ^1-3. Sin embargo, los recientes avances en el campo de CTC ha indicado que la simple enumeración de estas células raras ha limitado la utilidad clínica, como se muestra en los ensayos clínicos de intervención ^4. Por lo tanto, hay una necesidad emergente de tecnologías que permiten la caracterización molecular y funcional de CTC. En la actualidad, sólo existen pocas tecnologías que permiten for antígeno no sesgada, la captura viable y liberación de CTC, lo que permite robusto ^5,6 análisis molecular y funcional de aguas abajo. La mayoría de estos dispositivos microfabricados se acoplan a las plataformas de microfluidos y por lo tanto tienen un factor limitante en la cantidad de sangre que que se pueden procesar, que oscila desde 2 hasta 4 ml ^7-10. CTC son eventos raros en un único tubo de extracción de sangre (7,5 ml), por lo tanto reduciendo aún más la cantidad de sangre que puede ser procesada, dificulta en gran medida las posibilidades de capturar y aislar estas células de interés.

Hemos desarrollado dos tipos de dispositivos de microfiltro de membrana parileno C para la captura de CTC que explotan las diferencias de tamaño entre las células tumorales más grandes y las más pequeñas células sanguíneas normales ^11,12. Hemos informado anteriormente en el filtro de poro enumeración ronda y lo comparó con una plataforma aprobada por la FDA, en el que el microfiltro se demostró que era superior en eficiencia de la captura de CTCpara las muestras de sangre de pacientes de cáncer ^13,14. Sin embargo, una limitación del filtro redondo es la necesidad de utilizar un fijador a base de formaldehído antes de la filtración. Este proceso conserva la morfología de las células, mientras que lo que les permite resistir el esfuerzo cortante y presión durante el proceso de filtración. Mientras que la enumeración y los estudios moleculares se pueden realizar en el chip ^13, el fijador deteriora la capacidad para llevar a cabo la caracterización funcional. Para hacer frente a esta limitación, hemos desarrollado un filtro de poro ranura que niega la necesidad de fijar las células antes de la filtración (Figura 1). La geometría de poros ranura (6 m de ancho x 40 micras poros de ranura longitud) permite que las células tumorales a ser capturados mientras ocluir sólo parcialmente un poro y por lo tanto aún permite el paso libre para otras células de la sangre y aliviar el aumento de presión que daría lugar a daño celular y eventual ruptura ^15,16 El cartucho de poro ranura se compone de 2 piezas de acrílico que sándwichel filtro de poro ranura entre la pieza superior e inferior con polidimetilsiloxano (PDMS) que actúa como una junta para proporcionar una fuga sello a prueba de ^14,15 (Figura 1).

Mientras que la eficacia de la captura del filtro de poro ranura es alta, (Tabla 1), el CTC capturado están unidos a la membrana de parileno C por fuertes interacciones electrostáticas no específicas en lugar de la matriz extracelular (ECM) de adhesión ¹⁵ mediada. Métodos tales como el flujo inverso o el uso de rascadores de células no liberan eficazmente las células del filtro, o resultar en el daño celular y la muerte celular. Exploramos un uso no convencional de PIPAAm para formular una estrategia ^de liberación ^15. PIPAAm es un polímero que experimenta una transición de fase reversible de temperatura de solución crítica inferior (LCST) a una temperatura de la solución de 32 ° C ^17. Tradicionalmente, esta propiedad de PIPAAm ha sido ampliamente explorada para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Típicamente, las células sonsuperficies cultivadas en PIPAAm revestido a 37 ° C cuando PIPAAm es hidrófobo. Las células luego se pueden separar como una hoja cuando la temperatura de cultivo se desplaza por debajo de 32 ° C, donde la superficie de PIPAAm recubierto se hidrata ^17,18. Hemos explotado esta propiedad térmica mediante la realización del proceso de filtración a temperatura ambiente (por debajo de 32 ° C) y luego permitiendo la liberación de células colocando el filtro en medios de cultivo se mantuvo a 37 ° C. A esta temperatura, la capa de polímero PIPAAm se convierte en hidrófobo, liberando de este modo las células unidas electrostáticamente ¹⁵ (Figura 1).

Aunque el método sensible a la temperatura, así como otros métodos se han aplicado con éxito para lograr la captura de CTC viable y liberar ^{19 – 21,} un inconveniente potencial de clave compartida por estas tecnologías reportados es que todos ellos emplean un principio dependiente de antígeno para la captura de CTC. Antígeno de captura CTC base, como se muestra pestaba viendo anteriormente, puede dar lugar a ^11,14 sesgado análisis de CTC. Por ejemplo, muchas tecnologías basadas en la afinidad emplean anticuerpo que se une EpCAM para la captura de CTC. Sin embargo, CTC se ha demostrado que expresan varios niveles de EpCAM, que conduce a la omisión de EpCAM baja y EpCAM CTC negativa por estas tecnologías. Además, las limitaciones se pueden producir cuando CTC de origen no epitelial es de interés, tal como en la configuración de CTC de melanoma y el sarcoma. Por lo tanto, una tecnología que permite la captura y liberación CTC viables y sin sesgo potencial introducido por captura basada antígeno es altamente deseable.

Es importante destacar que el dispositivo de captura de microfiltro es puramente basado tamaño y la estrategia de liberación es agnóstico a la presencia de ciertos marcadores de superficie. Creemos que el empleo del microfiltro recubierto PIPAAm ayudará a ampliar nuestra comprensión del proceso metastásico, a través de proporcionar la capacidad de capturar y liberar CTC para los análisis posteriores con eficacia y eficiencia. Esto puede potenteially exponer nuevas moléculas para las cuales terapias novedosas sistémicos pueden ser dirigidas, así como proporcionar un biomarcador que puede controlarse fácilmente y ayuda en la gestión de los pacientes de cáncer.

Protocol

Declaración de Ética: Para proteger los derechos de los sujetos humanos, las muestras de sangre se obtuvieron después de un consentimiento informado en virtud de los protocolos aprobados por la Universidad de Miami juntas de revisión institucional bajo el IRB 20150020. NOTA: La sangre que se filtra para la captura de CTC se debe recoger en un tubo con EDTA para prevenir la coagulación. 1. Recubrimiento de la microfiltro con poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) Pesar PIPAAm para preparar …

Representative Results

El uso de la sangre de donantes sanos '(obtenida bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Miami IRB 20150020 después de un consentimiento informado) enriquecida con células cancerosas cultivadas, la técnica de respuesta térmica para la liberación de células viables circulantes tumorales (CTC), la captura lograda, la liberación y la eficiencia de recuperación de 94% ± 9%, 82% ± 5% y 77% ± 5%, respectivamente (Tabla 1) 15. En comparación,…

Discussion

El proceso de captura de CTC viable de la sangre entera y de liberarlos del microfiltro es relativamente sencilla; Sin embargo algunos puntos críticos son dignos de mención. Es imperativo, como con todo el cultivo de células que una condición estéril se mantiene a través de todo el proceso. El paso inicial de recubrir el filtro con PIPAAm es crítica, como la base para la técnica de la liberación de las células del filtro se basa en la explotación de propiedades interfaciales sensibles a la temperatura de PIPA…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice