Захват и Выпуск Жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток из крови

Summary

Протокол использовать поли (N -iso-пропилакриламид) (PIPAAm) микрофильтр с покрытием для эффективного улавливания и высвобождения thermoresponsive жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) представлено. Этот метод позволяет захватывать ТХМ из крови больных и последующим выпуском жизнеспособной КТК для вниз по течению вне кристалла культуры, анализ и характеристика.

Abstract

Демонстрируется способ размера на основе захвата жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) из цельной крови, наряду с выпуском этих клеток из чипа для нисходящего анализа и / или культуры. Стратегия использует использование нового Parylene С слот пор мембраны микрофильтр для захвата CTC и покрытие из поли (N -iso-пропилакриламид) (PIPAAm) для thermoresponsive жизнеспособного освобождения захваченного КТК. Захват живых клеток включается за счет использования конструкции геометрии слота пор с конкретными размерами, чтобы уменьшить напряжение сдвига, обычно связанные с процессом фильтрации. В то время как микрофильтр демонстрирует высокую эффективность захвата, высвобождение этих клеток является нетривиальной. Как правило, только небольшой процент клеток высвобождаются, когда такие методы, как обратный поток или клетки соскоба используются. Сильная адгезия этих эпителиальных раковых клеток к мембране Parylene С обусловлено неспецифическим электростатическим взаимодействием. Противодействовать тысявляется эффект, мы использовали использование PIPAAm покрытия и эксплуатировали его термических реагирующие межфазных свойств, чтобы освободить клетки от фильтра. Кровь сначала фильтруют при комнатной температуре. Ниже 32 ° C, PIPAAm является гидрофильным. После этого фильтр помещен в любой из культуральной среды или буфер, поддерживаемую при температуре 37 ° С, что приводит к PIPAAm превращения гидрофобными, а затем отпуская электростатически связанных клеток.

Introduction

Метастатического заболевания несет ответственность за большинство случаев смерти от рака. Разработка прогностической и сопутствующий диагностический биомаркером метастазирования имеет решающее значение в лечении рака и лечения. Циркулирующие опухолевые клетки (КТК) играют центральную роль в распространении опухоли и метастазов. Кроме того, будучи легко доступны в качестве "жидкой биопсии" биомаркеров, CTC у онкологических больных "периферической крови повышался как« рассадник »для исследования биомаркеров рака. КТК были хорошо подтверждены в качестве прогностического биомаркера в различных условиях, в том числе рака молочной железы, простаты и колоректальный рак ^{1 – 3.} Тем не менее, последние достижения в области СТС указал , что простое перечисление этих редких клеток имеет ограниченную клиническую полезность, как показано в интервенционной клинических испытаний ^4. Таким образом, существует потребность в новых технологиях, которые позволяют молекулярной и функциональной характеристике КТК. В настоящее время лишь немногие существуют технологии, которые позволяют FOг не-антиген предвзятым, жизнеспособного захват и освобождение КТК, что позволяет надежную вниз по течению молекулярный и функциональный анализ ^5,6. Большинство этих устройств микроизготовленном соединены с микрофлюидальных платформ и , таким образом ограничивающим фактором в количестве крови, которая может быть обработана, которая колеблется от 2-4 мл ^{7 – 10.} СТС являются редкими событиями в одной трубе взятия крови (7,5 мл), поэтому дальнейшее уменьшение количества крови, который может быть обработан, в значительной степени препятствует возможности захвата и изоляции этих клеток, представляющих интерес.

Мы разработали два типа устройств мембраны микрофильтр Parylene C для захвата КТК, эксплуатирующие различия в размерах между крупными опухолевыми клетками и небольших нормальных клеток крови ^11,12. Ранее мы уже сообщали о круглом пор фильтра подсчета и сравнивали его с FDA утвержденных платформу, где микрофильтр было показано, что превосходит по эффективности захвата СТСдля образцов рака крови пациента ^13,14. Тем не менее, ограничение круглого фильтра является необходимость использования формальдегида на основе закрепитель перед фильтрацией. Этот процесс сохраняет морфологию клеток, позволяя им выдержать напряжение сдвига и давление во время процесса фильтрации. В то время как перечисление и молекулярные исследования могут быть выполнены на микросхеме ^13, закрепляющий ухудшает способность выполнять функциональную характеристику. Для устранения этого ограничения, мы разработали пористую фильтр слот , который сводит на нет необходимость зафиксировать клетки перед фильтрацией (рисунок 1). Геометрия слот пор (ширина 6 мкм х 40 мкм слот длиной поры) позволяет опухолевым клеткам быть захвачены в то время как лишь частично перекрыта, поры и, таким образом, все еще позволяя свободный проход для других клеток крови и облегчение повышение давления, что приведет к повреждению клеток и в конечном итоге лопнул ^15,16 картридж слот пор состоит из 2 -х частей , которые акриловых сэндвичслот поры фильтра между верхней и нижней части с полидиметилсилоксана (PDMS) , действующего в качестве прокладки для обеспечения герметичного уплотнения ^14,15 (Рисунок 1).

В то время как эффективность захвата из гнезда пор фильтра является высоким, (таблица 1), захваченное СТС связаны с мембраной из Parylene С сильными неспецифических электростатических взаимодействий вместо внеклеточного матрикса (ЕСМ) , опосредованной адгезии ^15. Такие методы, как обратный поток или использование клеточных скребками не эффективно освободить клетки от фильтра, или привести к повреждению клеток и гибели клеток. Мы исследовали нетрадиционный использование PIPAAm разработать стратегию выхода ^15. PIPAAm представляет собой полимер , который претерпевает обратимое ниже критической температуры раствора (НКТР) фазового перехода при температуре раствора 32 ° С ^17. Традиционно, это свойство PIPAAm широко изучены для тканевой инженерии. Как правило, клеткикультивировали на PIPAAm Поверхности с нанесенным покрытием при температуре 37 ° С, когда PIPAAm является гидрофобным. Клетки затем могут быть отделены , как лист , когда температура культивирования смещается ниже 32 ° С, при которой поверхность PIPAAm покрытием становится гидратированный ^17,18. Мы использовали эту термальное свойство путем осуществления процесса фильтрации при комнатной температуре (ниже 32 ° C), а затем позволяя высвобождением клеток путем размещения фильтра в культуральной среде поддерживалась на уровне 37 ° C. При этой температуре, полимерный слой PIPAAm становится гидрофобной, таким образом , освобождая электростатически связанные клетки ¹⁵ (фиг.1).

Хотя температура отзывчивым метод, а также другие методы , которые были успешно реализованы для достижения жизнеспособного захвата CTC и выпуска ^{19 – 21,} один ключевой потенциальный недостаток разделяемое этими технологиями сообщенных в том , что все они используют принципу антиген-зависимой для CTC захвата. Антиген на основе CTC захвата, как показано рreviously, может привести к необъективной CTC анализа ^11,14. Например, многие сродством на основе технологии используют антитела, которое связывается EpCAM ТХМ захвата. Тем не менее, КТК было показано, чтобы выразить различные уровни EpCAM, что приводит к пропуском EpCAM низкого и EpCAM отрицательного CTC этими технологиями. Кроме того, ограничения могут возникнуть, когда CTC из не эпителиального происхождения представляет интерес, таких, как КТК в меланомой и саркомой настройки. Таким образом, технология, которая позволяет жизнеспособного CTC захвата и освобождения без потенциального смещения, введенного путем захвата антигена на основе является весьма желательным.

Важно отметить, что устройство захвата микрофильтр чисто размера на основе, и стратегия высвобождения является агностиком в присутствии определенных поверхностных маркеров. Мы считаем, что использование микрофильтра с покрытием PIPAAm поможет расширить наше понимание метастатического процесса, путем предоставления возможности для эффективного и действенного захвата и освобождения КТК для последующих анализов. В мае этого года мощнымially выставить новые молекулы, для которых новые целевые системной терапии могут быть направлены, а также обеспечить биомаркеров, которые можно контролировать легко и помощи при раке пациента управления.

Protocol

Этика Заявление: В целях защиты прав человека в качестве субъекта, образцы крови были получены после информированного согласия в соответствии с процедурами, утвержденными Университетом этическими комитетами Майами в рамках IRB 20150020. Примечание: в крови, чтобы быть отфильтрованы для CTC захвата …

Representative Results

Использование крови здоровых доноров (полученные в соответствии с протоколом, утвержденным в Университете Майами IRB 20150020 следующего информированного согласия) подсыпали культивированных раковых клеток, в thermoresponsive техники для высвобождения жизнеспособных циркулир?…

Discussion

Процесс захвата жизнеспособной КТК из цельной крови и освобождая их от микрофильтра относительно проста; Однако несколько критических точек стоит упомянуть. Крайне важно, как и всей культуры клеток, стерильное состояние сохраняется в течение всего процесса. Начальная стадия покрытия…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice