לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם
Summary
פרוטוקול לנצל פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) מצופה Microfilter עבור יעיל ללכוד ולשחרר thermoresponsive של תאים סרטניים קיימא במחזור (CTC) מוצג. שיטה זו מאפשרת ללכוד של CTC מ 'דם בחולים ושחרורו של CTC קיימא עבור במורד הזרם מחוץ שבב תרבות, מנתח ואפיון.
Abstract
אנו מדגימים שיטה ללכוד גודל מבוסס של תא הקיימא מחזור גידול (CTC) מן הדם כולו, יחד עם שחרורו של תאים אלה בין שבב לניתוח במורד זרם ו / או תרבות. האסטרטגיה מעסיקה את השימוש של Microfilter הנקבוביות חריץ קרום Parylene C רומן ללכוד CTC וציפוי של פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) עבור thermoresponsive שחרור קיימא של CTC בשבי. לכידתו של תאי חיים מופעלת על ידי מינוף העיצוב של גיאומטריה נקבובית חריץ עם ממדים ספציפיים כדי להפחית את לחץ הגזירה מזוהה בדרך כלל עם תהליך הסינון. בעוד Microfilter מפגין יעילות גבוהה ללכוד, השחרור של תאים אלה הוא לא טריוויאלי. בדרך כלל, רק אחוז קטן של תאים משתחררים כאשר טכניקות כגון זרימה הפוכה או גירוד תא משמשות. ההידבקות החזקה של תאי סרטן אפיתל אלה קרום Parylene C נובעת אינטראקצית אלקטרוסטטית הלא ספציפית. כדי לנטרל את ההתוצאה היא, שיישמנו השימוש ציפוי PIPAAm וניצלו נכסים interfacial תגובה תרמית שלה כדי לשחרר את התאים מן הסינון. דם מסונן הראשון בטמפרטורת החדר. להלן 32 ° C, PIPAAm הוא הידרופילי. לאחר מכן, המסנן להציב גם בתקשורת תרבות או חיץ על 37 מעלות צלזיוס, שתוצאתו PIPAAm מפנה הידרופובי, ולאחר מכן משחרר את התאים מאוגדים אלקטרוסטטי.
Introduction
מחלה גרורתית היא אחראית למותם של הסרטן ביותר. פיתוח סמנים ביולוגיים אבחון פרוגנוסטיים וכמלווה גרורות חיוני בניהול וטיפול בסרטן. בתאי גידול במחזור (CTC) לשחק תפקיד מרכזי בהפצת גידול וגרור. יתר על כן, להיות נגיש בקלות כמו ביו-מרקר 'ביופסיה נוזלית', CTC בחולי סרטן דם ההיקפי כבר עולה כ 'חממה' למחקר ביו-מרקר הסרטן. CTC אומתו גם ביומרקר פרוגנוסטיים במסגרות שונות לחולי סרטן, כולל סרטן השד, הערמונית וסרטן המעי הגס 1 – 3. עם זאת, התקדמות בתחום CTC ציינה כי הספירה בלבד של תאים הנדירים אלה הגבילה תועלת קלינית, כפי שמוצגת ניסויים קליניים התערבותיים 4. לפיכך, קיים צורך המתעורר עבור טכנולוגיות המאפשרות אפיון מולקולרי ופונקציונלי של CTC. נכון לעכשיו, רק כמה טכנולוגיות קיימות המאפשרות FOr הלא אנטיגן מוטה, לכידת קיימא ושחרור CTC, מה שמאפשר 5,6 ניתוח מולקולרי ופונקציונלי במורד חזק. רוב התקנים microfabricated אלה הם מצמידים את פלטפורמות microfluidic ולכן יש גורם מגביל את כמות הדם שניתן לעבד, שנעה בין 2-4 מ"ל 7 – 10. CTC הם אירועים נדירים בתוך שפופרת אחת של לקיחת הדם (7.5 מ"ל), ולכן מקטינים עוד יותר את כמות הדם שניתן לעבד, מאוד מעכבת את סיכויי לכידה לבודד תאים אלה של עניין.
פתחנו שני סוגי מכשירי Microfilter קרום Parylene C בתמורה ללכידתו של CTC המנצלת את ההבדלים בגודל בין תאים סרטניים גדולים ואת תאי דם הנורמלים הקטנים 11,12. יש לנו הדיווח בעבר על מסנן הספירה נקבובית העגול והשוו אותו עם פלטפורמת ה- FDA, שבו Microfilter הוצגה להיות מעולה יעיל ללכוד CTCעבור דגימות דם לחולה סרטן 13,14. עם זאת, מגבלה של המסנן העגול הוא הצורך להשתמש מקבעים משחררי פורמלדהיד לפני הסינון. תהליך זה שומר על מורפולוגיה תאים ובמקביל לאפשר להם לעמוד מאמץ הגזירה ולחץ במהלך תהליך הסינון. בעוד ספירה ומחקרים מולקולריים יכולים להתבצע על-שבב 13, מקבע פוגעת ביכולת לבצע אפיון פונקציונלי. כדי לתת מענה על מגבלה זו, פתחנו מסנן נקבובי חריץ השולל את הצורך לתקן תאים לפני הסינון (איור 1). החריץ הנקבובי הגיאומטריה (6 מיקרומטר הרוחב x 40 מיקרומטר נקבוביים חריץ אורך) מאפשרת לתאי הגידול להיות בשבי בזמן חלקי בלבד גורם לחסימה נקבובית ולכן עדיין המתיר מעבר חופשי עבור תאי דם אחרים והקלו על עליית לחץ שתוביל ניזק לתאים עד להתפקע סופי 15,16 מחסנית חריץ הנקבובית הורכב מ -2 חלקים אקרילי אשר כריךהחריץ הנקבובי מסנן בין היצירה העליונה ותחתונה עם polydimethylsiloxane (PDMS) מתנהג כמו אטם לספק דליפת הוכחת חותם 14,15 (איור 1).
בעוד יעילות לכידתו של מסנן חריץ הנקבובי גבוהה, (לוח 1), שנתפס CTC המאוגדים קרום Parylene C על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות הלא ספציפיות חזקות במקום תאי מטריקס (ECM) בתיווך הידבקות 15. שיטות כגון זרימה הפוכה או שימוש מגרדים תאים מצליחים לשחרר את התאים ביעילות ממסנן, או לגרום נזק לתאים תהליכי המוות התאי. בדקנו שימוש לא שגרתי של PIPAAm לגבש אסטרטגיה שחרור 15. PIPAAm הוא פולימר אשר עובר עיבוד טמפרטורת פתרון הפיך נמוכים קריטית (LCST) המעבר לשלב בטמפרטורת פתרון של 32 מעלות צלזיוס 17. באופן מסורתי, נכס זה של PIPAAm נחקר נרחב עבור יישומי הנדסת רקמות. בדרך כלל, תאיםבתרבית על PIPAAm מצופה משטחים על 37 מעלות צלזיוס כאשר PIPAAm הוא הידרופובי. התאים לאחר מכן ניתן מנותקים כסיד כאשר טמפרטורת התרבות מוסטת אל מתחת ל 32 מעלות צלזיוס, שבו המשטח המצופה PIPAAm הופך 17,18 התייבשות. אנו לנצל נכס תרמית זו על ידי ביצוע תהליך הסינון בטמפרטורת חדר (מתחת ל -32 מעלות צלזיוס) ולאחר מכן המאפשר שחרור תא על ידי צבת המסנן בתקשורת תרבות על 37 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה זו, שכבת הפולימר PIPAAm הופך הידרופובי, ובכך לשחרר את כבול אלקטרוסטטי תאים 15 (איור 1).
למרות שיטת טמפרטורת התגובה כמו גם שיטות אחרות יושמה בהצלחה להשיג ללכוד CTC קיימא ולשחרר 19 – 21, חסרון פוטנציאלי עיקרי אחת משותף טכנולוגיות אלה המדווחים כי הם כולם משתמשים עיקרון אנטיגן התלוי עבור לכידת CTC. מבוסס Antigen ללכוד CTC, כמוצג previously, עלול להוביל 11,14 ניתוח CTC מוטה. לדוגמה, טכנולוגיות רבות מבוססי זיקה להעסיק נוגדן אשר נקשר EpCAM עבור לכידת CTC. עם זאת, CTC הוכח מבטאים רמות שונות של EpCAM, שמוביל השמטת EpCAM נמוך EpCAM שלילית CTC על ידי הטכנולוגיות הללו. כמו כן, מגבלות עלולות להתרחש כאשר CTC מהמקור שאינו אפיתל הוא של עניין, כגון CTC במסגרות מלנומה סרקומה. לכן, טכנולוגיה המאפשרת ללכוד קיימא CTC ושחרור ללא הטיה פוטנציאלית הציגה ידי לכיד מבוסס אנטיגן רצויה מאוד.
חשוב לציין, מכשיר Microfilter ללכוד הוא בגודל מבוסס אך ורק ואת אסטרטגיית השחרור היא אגנוסטי לנוכחות של סמני משטח מסוימים. אנו מאמינים כי העסקתו של Microfilter מצופה PIPAAm יסייע להרחיב את הבנתנו את תהליך גרורתי, באמצעות מתן היכולת בצורה אפקטיבית ויעילה ללכוד ולשחרר CTC עבור ניתוחים במורד הזרם. מאי זה חזקially לחשוף מולקולות חדשות עבורו טיפולים מערכתיים ממוקד רומן עשויים להיות מופנים כמו גם לספק סמן ביולוגי כי ניתן לפקח בקלות וסיוע בניהול חולה סרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
התהליך לכיד CTC קיימא מהדם כולו ומשחרר אותם מן Microfilter הוא פשוט יחסית; עם זאת כמה נקודות קריטיות שווים אזכור. זה הכרחי, כמו עם כל תרבית התאים כי תנאי סטרילית נשמרים לאורך התהליך כולו. השלב הראשוני של ציפוי המסנן עם PIPAAm הוא קריטי, כבסיס הטכניקה של שחרור התאים ממסנן מבוסס על…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1XPBS | Gibco | 10010-023 | |
| McCoy's | Gibco | 16600-082 | Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case |
| Falcon Petri dishes 35×10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20mL | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used |
| Cellstar 50mL Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
Riferimenti
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -. T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
