Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut

Summary

Ein Protokoll , ein Poly (N iso-propylacrylamid) (PIPAAm) beschichtet Mikro für effektive Erfassung und thermoresponsive Freisetzung von lebenden zirkulierenden Tumorzellen (CTC) präsentiert zu nutzen. Diese Methode ermöglicht Erfassung von CTC aus dem Blut des Patienten und die anschließende Freisetzung von lebensfähigen CTC für Downstream-Off-Chip-Kultur, Analysen und Charakterisierung.

Abstract

Wir zeigen ein Verfahren zur Größe basierte Erfassung von lebenden zirkulierenden Tumorzellen (CTC) aus Vollblut, zusammen mit der Freisetzung dieser Zellen aus Chip für Downstream-Analyse und / oder Kultur. Die Strategie setzt die Verwendung eines Porenmikro neuartigen Parylene C Membran Schlitz zu erfassen CTC und eine Beschichtung aus Poly (N -iso-propylacrylamid) (PIPAAm) für thermoresponsiven tragfähige Freisetzung des eingefangenen CTC. Das Einfangen von lebenden Zellen wird durch die Nutzung der Gestaltung eines Schlitzes Porengeometrie mit spezifischen Abmessungen ermöglichte die Scherspannung zu verringern, die typischerweise mit den Filtrationsprozess verbunden. Während die Filter nicht mit einer hohen Abscheidegrad aufweist, ist die Freisetzung dieser Zellen nicht trivial. Typischerweise sind nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen freigesetzt wird, wenn Techniken wie Umkehrströmung oder Zell Schaben verwendet werden. Die starke Haftung dieser epithelialen Krebszellen auf die Parylene C-Membran ist auf unspezifische elektrostatische Wechselwirkung. Entgegenzuwirken thEffekt ist, verwendet wir die Verwendung von PIPAAm Beschichtung und ihre Wärme ansprechenden Grenzflächeneigenschaften ausgenutzt, die Zellen von dem Filter zu lösen. Blut wird zuerst bei Raumtemperatur filtriert. Unter 32 ° C, ist PIPAAm hydrophil. Danach wird der Filter entweder in Kultur platziert Medien oder einem Puffer bei 37 ° C gehalten wird, die in der PIPAAm führt hydrophoben Drehen und anschließend die elektrostatisch gebundenen Zellen freigesetzt wird.

Introduction

Metastasierten Erkrankung ist verantwortlich für die meisten Todesfälle durch Krebs. Die Entwicklung prognostischen und diagnostischen Begleit Biomarker für die Metastasierung ist in der Krebs Management und Behandlung von entscheidender Bedeutung. Zirkulierende Tumorzellen (CTC) spielen eine zentrale Rolle bei der Tumorausbreitung und Metastasierung. Des Weiteren als "flüssige Biopsie Biomarker leicht zugänglich zu sein, CTC bei Krebspatienten Tummelplatz" für Krebs Biomarker-Forschung 'peripheren Blut wurde als gestiegen ". ^{3 –} CTC wurden als prognostischer Biomarker bei verschiedenen Krebserkrankungen, einschließlich Brust-, Prostata- und Darmkrebs ¹ gut validiert. Jüngsten Fortschritte in der CTC – Feld hat jedoch darauf hingewiesen , dass die bloße Aufzählung dieser seltenen Zellen klinischen Nutzen beschränkt hat, als ⁴ in der interventionellen klinischen Studien gezeigt. Somit gibt es eine wachsende Nachfrage nach Technologien, die für die molekulare und funktionelle Charakterisierung von CTC ermöglichen. Derzeit sind nur wenige Technologien existieren, mit denen for Nicht-Antigen voreingenommen, durchführbare Erfassung und Freigabe von CTC und ermöglicht robuste nachgeschalteten molekularen und funktionellen Analyse ^5,6. Mehrzahl dieser mikrofabrizierten Geräte an mikrofluidischen Plattformen gekoppelt und damit einen begrenzenden Faktor in der Menge von Blut, die die verarbeitet werden können, die von 2 bis 4 ml ⁷ reicht ^{– 10.} CTC sind seltene Ereignisse in einem einzigen Rohr aus Blutentnahme (7,5 ml), daher weiter die Menge an Blut zu reduzieren, die verarbeitet werden können, stark behindert die Chancen für die Erfassung und diese Zellen von Interesse zu isolieren.

Wir haben für die Erfassung von CTC zwei Arten von Parylene C Membranmikro Geräte entwickelt , die die Größenunterschiede zwischen größeren Tumorzellen und den kleineren normalen Blutzellen ^11,12 auszunutzen. Wir haben zuvor auf dem runden Poren Enumeration Filter berichtet und verglichen sie mit einer FDA-zugelassenen Plattform, wo die Mikro in CTC – Capture – Effizienz überlegen gezeigt wurde ,für Krebspatienten Blutproben ^13,14. Jedoch eine Begrenzung des Rundfilters ist die Notwendigkeit, eine Formaldehydbasis Fixiermittel vor der Filtration zu verwenden. Dieser Prozess bewahrt die Zellen Morphologie, während es ihnen ermöglicht, die Scherspannung und Druck während des Filtrationsprozesses zu widerstehen. Während Aufzählung und molekulare Untersuchungen können auf dem Chip ¹³ durchgeführt werden, beeinträchtigt die Fixiermittel die Fähigkeit , funktionelle Charakterisierung durchzuführen. Um diese Einschränkung zu begegnen, entwickelten wir einen Schlitz Porenfilter, der die Notwendigkeit negiert zu fixieren Zellen vor der Filtration (Abbildung 1). Die Schlitzporengeometrie (6 & mgr; m Breite x 40 & mgr; m Länge Schlitzporen) ermöglicht es den Tumorzellen, während nur teilweise eine Pore und somit noch ermöglicht einen freien Durchgang für andere Blutzellen und die Linderung der Druckanstieg Okkludieren erfasst werden, die zu Zellschäden führen würde und schließlich Platzen ^15,16 der Schlitz Poren Kartusche besteht aus zwei Acrylstücke , die Sandwichder Schlitz Porenfilter , der zwischen dem oberen und unteren Teil mit Polydimethylsiloxan (PDMS) , die als eine Dichtung , die eine lecksichere Dichtung ^14,15 (Figur 1) zu liefern.

Während die Abscheidungseffizienz des Schlitzes Porenfilter ist hoch, (Tabelle 1), werden die erfassten CTC an die Membran gebunden Parylene C durch starke unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen statt extrazellulären Matrix (ECM) ¹⁵ vermittelte Adhäsion. Verfahren wie Umkehrströmung oder die Verwendung von Zell-Schaber versagen die Zellen von dem Filter effektiv zu lösen, oder in Zellschädigung und Zelltod führen. Wir erkundeten einen unkonventionellen Einsatz von PIPAAm Release – Strategie ¹⁵ zu formulieren. PIPAAm ist ein Polymer , das bei einer Lösungstemperatur von 32 ° C ¹⁷ eine reversible untere kritische Lösungstemperatur (LCST) Phasenübergang erfährt. Traditionell ist diese Eigenschaft von PIPAAm für Tissue-Engineering-Anwendungen weit erforscht. Typischerweise werden Zellenkultiviert auf PIPAAm bei 37 ° C beschichteten Oberflächen wenn PIPAAm hydrophob ist. Die Zellen können dann als Folie abgenommen werden , wenn die Kulturtemperatur auf unter 32 ° C verschoben wird, wo die beschichtete Oberfläche PIPAAm hydratisierten ^17,18 wird. Wir nutzten diese thermische Eigenschaft durch das Filtrationsverfahren bei Raumtemperatur durchführt (unter 32 ° C) und dann ermöglicht Zellfreisetzung durch den Filter in Kulturmedien platziert bei 37 ° C gehalten. Bei dieser Temperatur wird die PIPAAm Polymerschicht hydrophob ist , wodurch die Freigabe der elektrostatisch gebundenen Zellen ¹⁵ (Abbildung 1).

Obwohl die Temperatur ansprechende Methode sowie andere Methoden haben tragfähige CTC – Capture zu erreichen erfolgreich umgesetzt und Release ^19-21, ein Schlüssel durch diese Technologien gemeinsam genutzt möglicher Nachteil berichtet, dass sie alle eine Antigen-abhängige Prinzip für CTC – Capture verwenden. Antigen basierte CTC-Capture, wie gezeigt previously, führen zu verzerrten CTC – Analyse ^11,14. Zum Beispiel verwenden viele Affinität-basierten Technologien Antikörper, der EpCAM für CTC-Capture bindet. Allerdings CTC wurde verschiedenen Ebenen von EpCAM, was zu einer Auslassung von EpCAM niedrig und EpCAM negativen CTC durch diese Technologien zum Ausdruck gezeigt. Auch können Einschränkungen auftreten, wenn CTC aus nicht-epithelialen Ursprungs von Interesse ist, wie CTC in Melanom und Sarkom-Einstellungen. Somit ist eine Technologie, die ohne Potentialvorspannung für tragfähige CTC Erfassung und Freigabe ermöglicht durch Antigen-basierende Datenerfassung eingeführt ist höchst wünschenswert.

Wichtig ist, dass der Mikrofilter-Aufnahmegerät rein bemessen basiert und die Trennstrategie unabhängig auf das Vorhandensein von bestimmten Oberflächenmarker. Wir glauben, dass der Einsatz der Mikro PIPAAm beschichtet wird dazu beitragen, unser Verständnis des metastatischen Prozesses zu erweitern, durch die Möglichkeit bietet, effektiv und effizient zu erfassen und zu lösen CTC für Downstream-Analysen. Dies kann potentaussetzen mathematisch neue Moleküle, für die neuartige gezielte systemische Therapien als auch gerichtet werden könnten als Biomarker zur Verfügung stellen, die einfach und Hilfe bei der Krebspatientenmanagement überwacht werden kann.

Protocol

Ethikerklärung: Um die Rechte der menschlichen Probanden zu schützen, wurden Blutproben unter den von der University of Miami Institutional Review Boards unter IRB 20150020 genehmigten Protokollen nach einer informierten Zustimmung erhalten. HINWEIS: Blut für CTC-Capture gefiltert werden soll verhindern Koagulation in einem EDTA-Röhrchen gesammelt werden. 1. Beschichtung der Mikrofilter mit Poly (N-iso-Propylacrylamid) (PIPAAm) Wiegen PIPAAm aus 10% w / v Lösung in Butanol herzustellen. Mi…

Representative Results

Mit gesunden Spendern Blut (erhalten unter einem Protokoll, das von der University of Miami IRB 20.150.020 im Anschluss an eine informierte Zustimmung genehmigt) gespickt mit kultivierten Krebszellen, die thermoresponsive Technik zur Freisetzung von lebenden zirkulierenden Tumorzellen (CTC) erzielte Erfassung, Freigabe und Wieder Effizienz von 94% ± 9%, 82% ± 5% und 77% ± 5% (Tabelle 1) 15. Im Vergleich dazu waren die Freisetzung und Wiedergewinnungseffizie…

Discussion

Der Prozess der Erfassung tragfähige CTC aus Vollblut und aus dem Mikrofilter Freigabe ist relativ einfach; aber ein paar kritische Punkte sind erwähnenswert. Es ist zwingend notwendig, wie bei allen Zellkultur, die eine sterile Zustand durch den gesamten Prozess aufrecht erhalten wird. Der erste Schritt des Beschichtens des Filters mit PIPAAm kritisch ist, als Grundlage für die Technik der Zellen aus der Filter Freisetzung beruht PIPAAm des auf Temperatur ansprechenden Grenzflächeneigenschaften zu nutzen. Um zu gew…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice