Introduction
microinjecção citoplasmática de embriões de 1 célula é uma técnica muito potente. Ele pode ser usado para a entrega de qualquer solução para o embrião com, por exemplo, produzir gene knock-out para estudar a função do gene ou para gerar animais editado por genes. Zigotos de animais de exploração agrícola mais relevantes têm uma composição de ácidos graxos muito elevado que faz com que seu citoplasma opaco e escuro 1. Eles também têm uma membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características fazem microinjeção usando pronuclear injeção convencional / citoplasmática como usado em espécies de roedores desafiadoras e muitas vezes imprecisas.
Microinjecção citoplasmática tem vantagens sobre microinjecção pronuclear, uma vez que é mais fácil de executar e também causa menos danos para os embriões injectados, resultando em maior viabilidade 2. O objetivo geral deste protocolo é demonstrar um método bem sucedido para a entrega de soluções para o citoplasma de zigotos de animais de exploração. Para ser capaz de realizarmicroinjecção citoplasmática com alta eficiência em embriões de gado, é usado um laser para gerar um furo na zona pelúcida (ZP) e então, uma agulha de extremidade romba de vidro é usado para a microinjecção. Esta estratégia visa reduzir os danos mecânicos impressa no embrião durante a injeção. Em seguida, o conteúdo citoplasmático de aspiração no interior da agulha de injecção permite a quebra eficiente e confiável do PM assegurar que a solução é fornecida para dentro do citoplasma do embrião.
Esta técnica já sido utilizado com sucesso em embriões de bovinos para entregar siRNA para o citoplasma zigótica 3,4 e para gerar mutações que utilizam as repetições curtas em cluster regularmente interespaçadas palindrómicos (CRISPR) / CRISPR associada do sistema 9 de sistema (Cas9) 5. É igualmente apropriado (com pequenas modificações) para injetar bovina oócitos inclusos-cumulus 6. Aqui, descrevemos nosso protocolo de injeção de entregar um corante, que podem ser aplicáveis a injeção de qualquer dessolução Ired no zigoto, e mostrar que usando esta técnica provoca lise mínima e não afeta o desenvolvimento embrionário precoce.
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Protocol
1. Micropipeta Produção
- micropipeta Injection
- Coloque um capilar de vidro de borossilicato (diâmetro externo (OD): 1,0 mm, diâmetro interior (ID): 0,75 mm) num puxador de micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo.
- Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa seringueiro. (Exemplo: Calor: 825; Pull: 30; Velocidade: 120; Tempo: 200; Pressão: 500).
- Remova cuidadosamente as pipetas puxados a partir do dispositivo e colocá-lo em um microforge em uma posição horizontal.
- Traga a pipeta puxado e o filamento aquecedor microforge com a sua conta de vidro em foco. Utilizar o retículo ocular para medir a espessura desejada e mover a pipeta horizontalmente até que o filamento de aquecimento atinge o diâmetro interno alvo (5 uM).
- Ajustar a aquecer a cerca de 45% e suavemente trazer a pipeta para baixo de modo que toque o filamento. Ativar o aquecedor brevemente. este wderreter doente ligeiramente a pipeta de modo que adere ao filamento e depois do arrefecimento, a pipeta vai quebrar no ponto de contacto gerar um corte a direito.
Nota: Definir a temperatura apropriada é fundamental neste passo desde que as temperaturas demasiado elevadas fará com que a curva da pipeta e, portanto, um corte rectilíneo não será possível e temperaturas muito baixas, não será suficiente para derreter a pipeta (Figura 1A). - Fazer um ângulo de aproximadamente 30 ° perto da ponta da pipeta, posicionando-o a cerca de 10 uM de distância a partir do filamento de aquecimento. Ajustar a temperatura para 60% e activar o aquecedor.
Nota: Este irá dobrar a pipeta sobre o filamento. Este ângulo é desejada para que a ponta da agulha é paralela à superfície da placa de injecção, quando montado no injector (Figura 1B). - Lidar com pipetas de microinjeção com cuidado, pois eles são extremamente afiada e frágil.
- segurando micropipeta
- Coloque um borosiliccomeu capilar de vidro (OD: 1,0 mm ID: 0,75 mm) em um extrator micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo.
- Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa, mesmo cone e paredes paralelas (Exemplo: Calor: 815; Pull: 20; Velocidade: 140; Time: 175; Pressão: 200).
- Remova cuidadosamente a pipeta puxado a partir do dispositivo extrator e colocá-lo no porta-microforge em uma posição horizontal. Ajuste o foco no filamento aquecedor e pipeta.
- Utilizar o retículo ocular para medir o diâmetro da pipeta e mover a pipeta até que o seu diâmetro ao longo do filamento alcança de 180 um.
- No tamanho indicado, marcar o capilar de vidro, com uma caneta de ponta de diamante, em seguida, pressione suavemente na ponta puxou para quebrar o vidro. Isso deve resultar em um corte reto (Figura 1C).
- Mover a pipeta para uma posição vertical, com a sua ponta estreita para o filamento. Regule a temperatura do microforge a 60%.
- Fire-polonês a ponta da pipeta usando técnicas padrão 7 até que esta atinja um ID de 40 uM. Use o retículo ocular para verificar o ID (Figura 1D).
- Faça um ângulo na pipeta.
- Traga a pipeta de volta para uma posição horizontal cerca de 10 um para longe do filamento e 5 mm de distância da sua ponta. Ajustar a temperatura para cerca de 60% e activar o aquecedor para dobrar a pipeta sobre o filamento. Continuar o aquecimento, até um ângulo desejado (de cerca de 30 °) é alcançado. Verifique o ângulo visual (Figura 1E).
Nota: A pipeta é normalmente montado à microinjector com um ângulo aproximado de 60 ° em relação ao fundo do prato por injecção. A ponta da pipeta é dobrada de modo que é paralela à parte inferior do prato, que é necessário para a correcta injecção do embrião no seu plano médio.
- Traga a pipeta de volta para uma posição horizontal cerca de 10 um para longe do filamento e 5 mm de distância da sua ponta. Ajustar a temperatura para cerca de 60% e activar o aquecedor para dobrar a pipeta sobre o filamento. Continuar o aquecimento, até um ângulo desejado (de cerca de 30 °) é alcançado. Verifique o ângulo visual (Figura 1E).
- Verifique se as microinjetores são totalmente carregado com óleo e que não há bolhas de ar no sistema (bolhas no microinjetor impedir que o controle fino da injecção).
- Verifique se os micromanipuladores estão na posição central. Isto irá permitir a uma ampla gama de movimento das pipetas.
- Insira a pipeta segurando no suporte micromanipulador da esquerda e da pipeta de injeção no suporte micromanipulação direita.
- Deixe o óleo entrar nas pipetas por capilaridade e verificar se o sistema está funcionando corretamente, movendo óleo cima e para baixo dentro da pipeta usando os controles microinjetor.
Nota: Se não houver nenhuma circulação do óleo dentro das agulhas, pode haver uma obstrução. Neste caso, usar uma agulha nova. - Use os controlos micromaniplador para trazer as pipetas para o centro do campo do microscópio de vista. Usando uma ampliação de 4X, verifique se as dicas micropipeta estão no ângulo correto (parallel para a parte inferior do prato).
Nota: Uma configuração correcta das agulhas é a chave para uma injecção de sucesso e resultados para a consistência. - Calibrar o sistema de laser seguindo o manual de calibração do fabricante.
3. Preparação do prato de injecção (Figura 2)
- Coloque uma gota de 50 ul de aquecido (37 ° C) SOF-HEPES (composição detalhado na secção de materiais) suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS) no centro da tampa de uma placa de petri de 100 mm. Coloque um 1 - 2 ul gota da solução a ser injectada próximo da gota injecção. Certifique-se de que os embriões não arrefecer abaixo RT.
Nota: Neste protocolo, irá adicionar o corante Dextran-Vermelho para a solução de injecção para ser capaz de visualizar o local da injecção e segui-lo mais tarde. - Cobrir as gotas na placa de injecção, utilizando aproximadamente 10 ml de óleo mineral.
- Colocar o prato de injecção na fase do microscópio invertido e trazer o PIPEttes na gota injecção. Verifique se as agulhas estão no foco dentro da gota. Ajustar a sua altura conforme necessário usando os controles micromaniplador.
- Usando uma micro-distribuidor, carregar cerca de 20 - 30 zigotos (17-20 horas pós-fertilização (HPF)) no lado superior da gota injecção. Realizar a injecção à temperatura ambiente de modo que o número de embriões na queda de injecção é determinada pela velocidade à qual a pessoa pode injectar-los. Não carregue mais embriões do que os que podem ser injetadas em 30 min.
- Para carregar os embriões em no micro, pressionar o êmbolo totalmente e mergulhe a ponta na solução contendo os embriões. Tocam os embriões para ser apanhada com a ponta do capilar de vidro (um de cada vez) e liberam lentamente o êmbolo de modo que cada embrião entra no capilar. Repita este procedimento até todos os embriões são apanhados ou a capacidade de micro-distribuidor está cheio.
- Para liberar os embriões carregados, pressionar o êmbolo suavemente até que todo o volume de containing os embriões é liberado do capilar.
4. microinjeção
- Usando o objectivo 4X, carregar a solução a ser injectada para a pipeta de injecção por aplicação de pressão negativa (aspiração). Coloque solução suficiente para injetar 2 - 3 zigotos. Em seguida, passar para a queda de injeção.
- Dentro da gota injeção, mover a pipeta segurando para que a ponta fica perto de um zigoto. Aplique pressão negativa (aspirado) com o microinjetor exploração de modo que o zigoto fica fixo para a pipeta holding e mudança para um objetivo 20X.
- Uma vez que o zigoto está ligado à pipeta de exploração, verificar a sua qualidade utilizando a pipeta de injeção para mover suavemente o embrião ao redor sem separá-la. A qualidade zigoto bom deve ter os dois corpos polares (embora, por vezes, apenas um é visto) e um citoplasma homogêneo. Não injectar zigotos anormais (Figura 3A).
- Se necessário, reposicionar o embrião para uma injecção adequadalocalização. Um bom posicionamento seria aquele em que existe um espaço entre a ZP e o PM, de modo que o PM não seja danificada pelo laser.
- Verificar que a pipeta de injecção está posicionado no plano médio do embrião tocando suavemente o zigoto no local da injecção. Se ele não está no seu plano médio, a agulha irá tendem a fazer rodar o embrião em vez de punção. Ajustar a altura da pipeta de injecção conforme necessário.
- Fazer um buraco na ZP usando um laser (Figura 3B).
- Utilizando software lugar do laser, a retícula de laser na ZP onde o furo vai ser feita (no lado oposto ao onde o embrião está ligado à pipeta de exploração). Usando a janela, clique em controle de laser sobre o botão de fogo. Certifique-se de que o tamanho do orifício é suficientemente grande para criar uma abertura no ZP para a agulha para passar através sem danificar o PM (Exemplo: 0,662 ms de largura de impulso / 6,9 uM O tamanho do orifício).
- Passe a agulha de injeçãoatravés do orifício na ZP e fazer contato com a PM. Continue a empurrar a pipeta para a frente até que a agulha é ¾ da forma para o embrião (Figura 3C).
- Observar a posição do menisco na interfase solução de óleo, tal como este será utilizado para controlar o volume de injecção consistente.
- Aplicar pressão negativa (aspiração) na pipeta de injecção, o que irá resultar em PM e citoplasma sendo aspirado para a agulha de injecção. Continuar até que o movimento do citoplasma para dentro da agulha ou acelera quando o conteúdo citoplasma misturando-se com uma solução de injecção pode ser visto. Estes irão indicar a ruptura da PM (Figura 3D).
- Injectar de volta o conteúdo citoplasmático seguido da solução para dentro do citoplasma do zigoto pela aplicação de pressão positiva (que se injectam), até que o menisco na interfase solução-óleo tem avançado diâmetro equivalente de um zigoto passado o ponto de partida.
Nota: Nas nossas condições, este representa cerca de 7 pl de solução injectada (Figura 3E). - Mudar para um objectivo 4X e mover o injectado embrião / s para o lado de baixo da gota de injecção. Liberar o embrião através da aplicação de pressão positiva sobre o microinjetor exploração. Manter os embriões não injectados no lado superior e os injetados no lado inferior da queda para ajudar a manter o controle dos embriões injetados / não-injetado e trabalhar de forma eficiente.
5. Embrião de recuperação e Injeção Resultados
- Adicione 3 gotas de cerca de 200 ul numa nova placa com pré-aquecido SOF-HEPES. Recolher os embriões injectados utilizando uma micro-distribuidor (como descrito acima). Lavar os embriões injectados movendo-os através do SOF 3-HEPES gotas.
- Conte os embriões lisadas durante a microinjeção e descartá-las.
Nota: Um zigoto lisadas podem ser facilmente distinguidos a partir de um único intacta desde o primeiro aparece translúcido, preencher toda a ZP, e, geralmente, tem citoplasmáticateor de vazamento para o exterior do embrião. - Opcionalmente, verificar a eficiência microinjecção utilizando um microscópio de fluorescência. Esteja ciente de que a exposição à luz UV pode induzir danos embrião que pode afetar o desenvolvimento subsequente.
- Grupos de cultura de 25 embriões injectados em 50 gotas ul de meio simplex optimização de potássio (KSOM) suplementado com 4 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em óleo mineral a 38,5 ° C, 5% CO 2 em ar, e humidade de saturação.
- Suplementar o meio de cultura com 5% de FBS dois dias após a injecção.
- Verifique blastocisto (BL) taxas de 7 dias após a injeção. Calcular as taxas de BL como o número total de embriões de blastocisto / número total de embriões cultivados em que a queda.
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Representative Results
Microinjecção citoplasmática assistida por laser é um protocolo potente e fiável para fornecer soluções para o citoplasma de zigotos de gado. A Figura 3 mostra um esquema geral dos zigotos, antes e depois da injecção, bem como o contorno geral da técnica. Dextrano-vermelho é usado como injeção de solução para permitir site de rastreamento de injeção e injeção de eficiência e precisão. O sucesso da entrega a solução está ilustrada na Figura 4 que mostra um embrião recentemente injectado em que o corante é distribuída homogeneamente no citoplasma. Usando esta técnica de 100% dos embriões são injectadas no seu citoplasma.
Este protocolo tem demonstrado a ter taxas de lise mínimos em zigotos bovinos e ovinos. Apenas 15,6 ± 5 e 5,8 ± 3,9% dos embriões injectados foram lisadas em gado e ovelhas, respectivamente, como resultado de microinjecção
Estes resultados indicam que a injecção intracitoplasmática assistida por laser faz com que o mínimo de danos durante a injecção e os resultados das taxas de desenvolvimento de blastocistos normais.
Figura 1: um diagrama geral que mostra como fazer o Pipettes Holding e injeção. AB) pipeta de injeção, CE) Segurando pipeta. A) Toque suavemente o filamento com a pipeta puxado no diâmetro desejado (5 mm). Ative o brevemente aquecedor (mostrou em o alcance). Isto irá derreter ligeiramente a pipeta de modo que adere ao filamento e depois do arrefecimento, a pipeta vai quebrar no ponto de contacto gerar um corte a direito. B) Fazer e ângulo na pipeta de cerca de 0,5 cm de distância da sua ponta, posicionando a pipeta de cerca de 10 uM de distância a partir do filamento de aquecimento. Continuar o aquecimento até o ângulo desejado seja alcançado. C) Use uma caneta de ponta de diamante para marcar e cortar a pipeta de exploração no diâmetro desejado (180 uM). D) na posição vertical, fogo-polonês a ponta da pipeta de exploração até que ele atinge o diâmetro interno desejado (40 mm). e) fazer um ângulo na pipeta trazendo a pipeta para um posicionamento horizontal um par uM longe do filamento e cerca de 0,5 cm de distância da sua ponta. Ativar o aquecedor para dobrar a pipeta sobre o filamento. Continuar o aquecimento até o ângulo desejado seja alcançado. Veja 8,9,10 para obter mais detalhes sobre como fazer agulhas.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:.. Configuração geral da Dish injeção Arranjo de pipetas, gotas, e os embriões são exibidos neste desenho Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Assistida por laser Intracytoplasmic Protocolo Injection A) Um diagrama geral de um zigoto ligado à pipeta de exploração antes da injeção. PB: Corpos polares, ZP: zona pelúcida, Cit: o citoplasma, PN: pronúcleos, PM: Membran Plasmae, HP: Pipeta da terra arrendada, IP:. pipeta de injeção BE) passos de microinjeção: b) Fazer um buraco na ZP de um zigoto ligado à pipeta de exploração usando um laser C) Apresentar a pipeta de injeção para o lado oposto do embrião. . Posição do menisco (a). D verificar) Quebre a membrana plasmática por aspiração de conteúdo citoplasmático dentro da pipeta de injeção. E) Injectar volta conteúdo citoplasmático e uma solução para o citoplasma zygotic, até que o menisco atinge um diâmetro zigoto (b) após o ponto de partida . Distância ab representa ~ 7 pl de solução injetada. F) Um diagrama geral de um zigoto após a injeção. Note-se que a solução injetada se espalha de forma homogénea para o citoplasma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:.. Figura Representante de um Zygote injetado com Dextran-vermelho A) imagem de campo brilhante do zigoto injetado B) imagem fluorescente do zigoto injetado Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Proporção de lisado embriões após Zygote Microinjeção em duas espécies diferentes de dados representa 4 repetições para os embriões de bovinos (total de 103 zigotos injetados) e 3 repetições para os embriões de ovinos (total de 173 zigotos injetados). As barras de erro representam SEM Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.
Figura 6:. Blastocyst Tarifas em bovinos e ovinos Embriões de dados representa 4 repetições para a espécie bovina com um total de 102 injetada e 156 embriões de controlo e 3 réplicas para os ovinos com um total de 163 injetado e 239 embriões de controle. As barras de erro representam SEM Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A microinjecção de zigotos é um método bem estabelecido para a introdução de soluções em embriões de mamíferos. Com algumas variações dependentes das espécies e o objectivo da experiência, esta técnica pode ser usado de forma ampla. Mostramos como executar microinjecção intracitoplasmática usando um laser para ajudar na entrada de uma micropipeta de extremidade romba. Os zigotos de algumas espécies animais (tais como gado bovino, ovelhas, e porcos) têm um citoplasma escuro, dificultando a visualização da pipeta de injecção uma vez dentro do embrião. Além disso, suas membranas plasmáticas são muito elástico, tornando a sua penetração com uma agulha cravada chanfrada (geralmente usada para injetar zigotos de espécies de roedores) difícil de alcançar. Para ultrapassar estas limitações, foi utilizado um laser para permitir a passagem de uma agulha de extremidade romba através da zona pelúcida e a subsequente aspiração do conteúdo citoplasmático para assegurar a ruptura da membrana do plasma e a libertação da solução no interior do citoplasma do embrião. Além disso, por injecting no lado oposto da entrada da agulha (cerca de 3/4 no interior do embrião) pretendemos deslocar o PN e, assim, evitar a sua aspiração / injeção. Além disso, fornece mais ponto de contato para a membrana quebrado para curar, resultando em taxas de lise mais baixos.
Produzindo bons micropipetas (especialmente a pipeta de injecção) e adequadamente colocá-los para o micromanipulador é fundamental para alcançar bons resultados com esta técnica. A agulha de injecção pode ser utilizada durante o tempo que a solução de injecção move-se suavemente no interior da agulha. Às vezes, ou mesmo conteúdo conteúdo citoplasmático pronúcleos fica preso no interior da ponta da agulha, fazendo com que o fluxo para funcionar de maneira irregular e complicando a injecção (isto também aumenta as taxas de lise e atrasa o processo). Substituindo a agulha de injeção quando isso acontece é necessário para obter os melhores resultados com este protocolo. A quantidade de tempo que os embriões estão fora da incubadora é crucialpara obter as taxas de sobrevivência consistentes e não deve exceder os 30 min. Após o treinamento ea prática, as operadoras costumam atingir uma velocidade de injeção de 1-2 embriões injetados por minuto. Outro ponto-chave para o sucesso deste protocolo é injetar de forma consistente a mesma quantidade de volume de solução por embrião. Isto é facilmente e com precisão controlada observando o deslocamento do menisco interface de solução de óleo. É importante que o diâmetro da pipeta é consistente entre as manipulações e que a ponta tem um diâmetro regular e constante. Com 5 uM ID pipetas na ponta, a 7 - 10 pl de volume de injecção é conseguido injectando o equivalente ao comprimento de um zigoto. Sobre-injecção muitas vezes resulta em lise embrião.
Usando este protocolo, 100% dos embriões injectados são adequadamente para o citoplasma, evitando completamente falsa injecções espaço perivitelino (Figura 4). Isto maximiza a fiabilidade e a reprodutibilidade do ensaio a ser realizado (independentemente da solução injetadas) uma vez que os resultados são devidos somente ao efeito da solução injectada e não a inconsistências injecção. Alguns dos zigotos injectados normalmente irá lisar devido a danos mecânicos durante a injecção. A taxa usual de sobrevivência após a injeção é de 75% 11. Usando esse método, podemos obter taxas mínimas de embriões lisadas (Figura 5). Além disso, as taxas de desenvolvimento embrionário foram comparáveis a não injectada (controlo) embriões (Figura 6), indicando que a técnica de injecção não tem efeitos prejudiciais sobre o desenvolvimento embrionário precoce. A eficiência deste protocolo foi recentemente em comparação com o protocolo convencional microinjecção citoplasmático (microinjecção citoplasmática directo usando uma agulha de vidro cravado chanfrada sem a utilização do laser para penetrar de ZP) para injectar 5 zigotos bovinos. Os resultados mostraram taxas significativamente maiores de embriões lisadas e menores taxas de formação de blastocistos para o cytopl diretamicroinjeção asmic. Acreditamos que estas diferenças são devido a menos danos mecânicos durante a penetração da agulha quando se utiliza a microinjeção citoplasmática assistida por laser, tornando este protocolo o preferido para a injecção de espécies de gado em nosso laboratório.
Aqui, são apresentados dados para embriões de bovinos e ovinos obtidos por vitro em fertilização, mas têm também testada usando o protocolo in vivo e in vitro de embriões de suínos obtenção de resultados semelhantes (dados não mostrados). Dependendo da solução injectada, este protocolo pode ser utilizado para muitas aplicações. Recentemente, nós tê-lo usado para introduzir um sistema CRISPR / Cas9 para knock-out genes específicos em embriões bovinos in vitro fertilizado e encontrou uma alta proporção de blastocistos seqüenciados com mutações: 50% dos embriões (n = 6) tinham mutações bialélicos , 33% (n = 4) tinham mutações monoalélicos, e 17% (n = 2) foram de tipo selvagem 5. Este protocolo tem sido muito fiável e pode ser utilizado emvárias espécies e uma miríade de aplicações.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 100 x 15 mm culture dish | Falcon | 351029 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used. |
| 35 mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10 mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCl2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
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- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
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