Introduction
1-hücre embriyoların Sitoplazmik mikroenjeksiyon çok güçlü bir tekniktir. Bu, örneğin, gen fonksiyonu çalışma ya da gen düzenlenmiş hayvanlar oluşturmak için, gen, çıkıntılara üretilmesi için embriyo herhangi bir çözüm sunmak için de kullanılabilir. En tarımsal-ilgili çiftlik hayvanı zigot kendi sitoplazma opak ve 1 karanlık kılan çok yüksek yağ asidi kompozisyonu var. Onlar da oldukça esnek plazma zarı (PM) var. Bu özellikler kemirgen türleri zorlu ve sık sık yanlış kullanılan geleneksel pronüklear / sitoplazmik enjeksiyon kullanılarak mikroenjeksiyon yapmak.
Sonuçlar, daha kolay olan ve aynı zamanda daha yüksek canlılığı 2'de elde edilen, enjekte edilen embriyolar için daha az zarar yana Sitoplazmik mikroenjeksiyon pronükleer mikroenjeksiyon fazla avantajlara sahiptir. Bu protokolün genel amacı çiftlik hayvanı zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için başarılı bir yöntem ortaya koymaktır. yapabilmek içinBesi embriyoların yüksek verimle sitoplazmik mikroenjeksiyon, bir lazer, bir küt uç cam iğne mikroenjeksiyon için kullanılan zona pellucida (ZP) ve daha sonra bir delik oluşturmak için kullanılır. Bu strateji enjeksiyon sırasında embriyo üzerinde baskılı mekanik zararı azaltmayı hedefliyor. Sonra, enjeksiyon iğnesi içinde sitoplazmik içeriğin aspirasyon çözümü embriyo sitoplazmaya teslim edilmesini sağlamak PM verimli ve güvenli kırılmasına izin verir.
Bu teknik başarıyla zigotik sitoplazma 3,4 içine siRNA teslim etmek ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarı (CRISPR) / CRISPR ilişkili sistem 9 (Cas9) sistemi 5 ile mutasyon üretmek için sığır embriyolarının kullanılmıştır. Ayrıca sığır cumulus-kapalı oosit 6 enjekte etmek (küçük değişikliklerle) uygundur. Burada, bir boya teslim eden enjeksiyon protokol açıklar, herhangi des enjekte uygulanabilir olabilirzigot içine IRED çözüm ve bu tekniği kullanarak en az erimesine yol açar ve erken embriyo gelişimini etkilemediğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikropipet Üretimi
- enjeksiyon mikropipet
- borosilikat cam kapiller (: 1,0 mm, iç çapı (ID): dış çap (DÇ) 0.75 mm) koyun, bir mikropipet çektirmenin (sağ ve sol kılcal sahipleri merkezinde) ve kilitleyin.
- uzun uzantılar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir program kullanın. (Örnek: Isı: 825; çekin: 30; Hız: 120; Süresi: 200; Basınç: 500).
- Dikkatle cihazdan çekti pipetler kaldırmak ve yatay konumda bir microforge üzerine yerleştirin.
- çekti pipet ve odak noktası haline cam boncuk ile Microforge ısıtıcı iplik getir. İstenilen kalınlığı ölçümü ve ısıtıcı Filament hedef iç çapı (5 mikron) ulaşıncaya kadar yatay pipet taşımak için mercek reticle kullanın.
- yaklaşık% 45 ısı ayarlama ve filamanın dokunur şekilde hafifçe aşağı pipet getirmek. kısaca ısıtıcı etkinleştirin. Bu Whasta hafifçe filamanın yapışır, böylece pipet eritmek ve soğutma üzerine, pipet düz bir kesim üreten temas noktasında kıracak.
Not: Çok yüksek sıcaklıklar pipet bend yapacak ve böylece düz bir kesim mümkün olmayacak ve çok düşük sıcaklıklarda pipet (Şekil 1A) eritmek için yeterli olmayacaktır çünkü uygun sıcaklık ayarı bu adımda anahtarıdır. - Isıtıcı filament yaklaşık 10 mikron uzak konumlandırarak pipet yakın yaklaşık 30 ° açı yapar. % 60 sıcaklığını ayarlamak ve ısıtıcı etkinleştirin.
Not: Bu filament üzerinde pipet viraj. Bu açı, enjektör (Şekil 1B) içine monte edildiğinde iğnenin ucu püskürtme plakasının yüzeyine paralel olacak şekilde tercih edilir. - Bunlar son derece keskin ve kırılgan olduğu gibi dikkatli mikroenjeksiyon pipetler anlaştım.
- Holding mikropipet
- Bir borosilic yerleştirin(: 1,0 mm, ID: OD 0.75 mm) cam kapiller yedik (sağ ve sol kılcal sahiplerinin merkezinde) Mikropipet çektirmenin ve kilitleyin.
- uzun hatta konik ve paralel duvarlar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir programı kullanın (: Heat: Örnek 815; çekin: 20; Velocity: 140; Zaman: 175; Basınç: 200).
- Dikkatle çektirmenin cihazdan çekti pipet kaldırmak ve yatay konumda Microforge tutucu üzerine yerleştirin. Isıtıcı lif ve pipet üzerinde odağı ayarlayın.
- pipet çapını ölçmek ve filamanın üzerinde çapı 180 mikron ulaşıncaya kadar pipet taşımak için mercek reticle kullanın.
- Belirtilen boyutta bir elmas uç kalem ile cam kapiller işaretleyin ve sonra yavaşça camı kırmak için çekti ucunda basın. Bu, düz bir kesim (Şekil 1C) ile sonuçlanmalıdır.
- filaman yakın olan ucu ile dikey bir konuma pipet getirin. sıcaklığı ayarlayın % 60 microforge evi.
- Yangın lehçe o 40 mikron bir kimliği ulaşıncaya kadar standart teknikler 7 kullanarak pipet ucu. Kimliği (Şekil 1D) kontrol etmek için mercek reticle kullanın.
- pipet üzerinde bir açı yapar.
- yaklaşık 10 mikron uzaklıkta filamanın ve uzak ucu 5 mm geri yatay konuma pipet getirin. Yaklaşık% 60 sıcaklığını ayarlamak ve filamanın üzerinde pipet bend ısıtıcı etkinleştirin. (Yaklaşık 30 O) arzu edilen bir açı elde edilene kadar ısıtma devam edin. Açı görsel (Şekil 1E) kontrol edin.
Not: Pipet, genellikle enjeksiyon tabağın tabanına göre 60 ° bir açı ile yaklaşık mikroenjektör monte edilir. onun orta düzleminde embriyo doğru enjeksiyon için gerekli olan çanak tabanına paralel şekilde pipet ucu bükülür.
- yaklaşık 10 mikron uzaklıkta filamanın ve uzak ucu 5 mm geri yatay konuma pipet getirin. Yaklaşık% 60 sıcaklığını ayarlamak ve filamanın üzerinde pipet bend ısıtıcı etkinleştirin. (Yaklaşık 30 O) arzu edilen bir açı elde edilene kadar ısıtma devam edin. Açı görsel (Şekil 1E) kontrol edin.
- mikroenjektörler tamamen yağ ile yüklü olduğundan ve sistemde hiçbir hava kabarcığı olduğunu (mikroenjektör kabarcıklar enjeksiyon ince kontrol edilmesini önlemek) kontrol edin.
- mikromanipülatörler orta konumda olduğundan emin olun. Bu pipetler geniş bir hareket aralığı sağlayacak.
- Sol mikromanipülatör tutucuya yerleştirin tutma pipet ve sağ mikromanipulasyon tutucu içine enjeksiyon pipet yerleştirin.
- Yağ kılcallık tarafından pipetler girmek ve sistem mikroenjektör kontrollerini kullanarak pipet içinde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yağı düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için izin verin.
Not: iğne içinde yağ hiçbir hareket yoksa, bir yapışmasına neden olabilir. Bu durumda, yeni bir iğne kullanınız. - görüş mikroskop alanının merkezi haline pipetler getirmek için mikromanipülatör denetimlerini kullanın. 4X büyütme kullanarak, mikropipet uçları (doğru açıda p olduğunu kontrol edinçanak alt) için arallel.
Not: iğne Doğru kurulum başarılı bir enjeksiyon için ve sonuç tutarlılığı için anahtardır. - Üreticinin kalibrasyon kılavuzuna aşağıdaki lazer sistemi kalibre edin.
Enjeksiyon Dish 3. Hazırlama (Şekil 2)
- 100 mm petri kabı kapağının merkezine,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş ısıtıldı (37 ° C), SOF-HEPES (malzeme bölümünde ayrıntılı olarak bileşimin) içindeki bir 50 ul damla yerleştirin. solüsyonu 2 ul damla enjeksiyon damla yakın enjekte edilecek - 1 yerleştirin. embriyolar RT aşağıda soğumasını etmediğinden emin olun.
Not: Bu protokolde enjeksiyon siteyi görselleştirmek ve daha sonra takip edebilmek için enjekte çözüm Dekstran-Kırmızı boya katacak. - mineral yağ, yaklaşık 10 ml kullanılarak enjeksiyon plaka damla örtün.
- ters mikroskop aşamasında enjeksiyon çanak yerleştirin ve pip getirmekEnjeksiyon damla içine ettes. iğneler damla içindeki odak olup olmadığını kontrol edin. mikromanipülatör denetimlerini kullanarak gerektiği gibi kendi yüksekliğini ayarlayın.
- Enjeksiyon damla üst tarafında - (20 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 17) 30 zigot - Bir microdispenser kullanarak, yaklaşık 20 yükleyin. Enjeksiyon damla embriyo sayısı kişi bunları enjekte etme hızı tarafından belirlenmektedir, ki böylece, oda sıcaklığında enjeksiyon gerçekleştirin. 30 dakika içinde enjekte edilebilir olanlarına göre daha fazla embriyolar yüklemeyin.
- microdispenser içine embriyolar yüklemek için, tam pistonu bastırın ve embriyoları içeren çözelti içine ucu batırın. Dokunmatik embriyolar cam kapiller ucu (seferde bir) ile aldı ve yavaş yavaş piston böylece her embriyo kılcal girer serbest olması. tüm embriyolar toplanır veya microdispenser kapasitesi dolana kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Yüklenen embriyolar serbest tüm hacim co kadar pistonu hafifçe bastırmak içinembriyolar ntaining kılcal salınır.
4. Mikroenjeksiyon
- 4X objektif kullanarak, negatif basınç (emme) uygulanarak enjeksiyon pipetine enjekte edilecek çözelti yüklenir. 3 zigot - 2 enjekte etmek yeterli bir çözüm yükleyin. Sonra enjeksiyon damlasına kadar hareket ettirin.
- ucu bir zigot yakın alır bu yüzden enjeksiyon damla içinde holding pipet hareket ettirin. zigot 20X amaca tutma pipet ve değişime onarılır böylece tutma mikroenjektör ile negatif basınç (aspirat) uygulayın.
- zigot tutma pipet takıldıktan sonra, yavaşça ayırarak olmadan etrafında embriyo hareket enjekte pipet kullanarak kalitesini kontrol edin. Kaliteli zigot iki kutup bedenlere sahip (tek görülür bazen rağmen) ve homojen bir sitoplazma olmalıdır. Anormal zigot (Şekil 3A) enjekte etmeyin.
- Gerekirse, uygun bir enjeksiyon için embriyo yeniden konumlandırmakyer. İyi bir konumlama olan ZP ve PM arasında biraz boşluk var, bu yüzden PM lazer zarar almaz olacaktır.
- Enjeksiyon pipet yavaşça enjeksiyon yerinde zigot dokunarak embriyonun orta düzlemde konumlanmasına dikkat edin. Bu orta düzleminin üzerinde değil, iğne embriyo yerine ponksiyon dönmesini sağlamak eğiliminde olacaktır. gerektiği gibi enjeksiyon pipet yüksekliğini ayarlayın.
- Bir lazer (Şekil 3B) kullanılarak ZP bir delik sağlayın.
- lazer yazılım yer deliği (embriyo tutma pipet bağlı olduğu yere karşı tarafında) yapılacaktır ZP lazer retikül kullanılması. Yangın butonuna lazer kontrol penceresi tıklayın kullanma. Deliğin boyutu PM zarar vermeden geçmesi iğne ZP bir açılış oluşturmak için yeterince büyük olduğundan emin olun (Örnek: 0.662 msn Pulse genişliği / 6.9 mikron Delik boyutu).
- iğne geçirinve ZP delikten PM ile temas. İğne embriyo (Şekil 3C) içine yolu ¾ kadar ileri pipet itmeye devam edin.
- Bu tutarlı bir enjeksiyon hacmini kontrol etmek için kullanılacak şekilde, çözelti, yağ ara yüzeyinde menisküsün konumunu dikkate alınmalıdır.
- PM ve sitoplazma enjeksiyon iğnesi içine aspire edilen sonuçlanacaktır enjeksiyon pipet üzerinde negatif basınç (aspirat) uygulayın. iğne içine sitoplazma hareketi hızlandırır kadar veya enjeksiyon solüsyonu ile karıştırma sitoplazma içeriği görülebilir zaman devam ediyor. Bu PM (Şekil 3D) kırılma gösterecektir.
- çözüm yağı interfaz menisküs başlangıç noktasına geçmiş bir zigot çapı eşdeğer ilerlemiştir kadar pozitif basınç (enjekte) uygulayarak zigot sitoplazmaya solüsyonu ardından sitoplazmik içeriğin geri enjekte edilir.
Not: Bizim koşullarda, bu Repreyaratabilecek enjekte çözeltisi (Şekil 3E), yaklaşık 7 Pl. - Bir 4X amaca Değişim ve enjeksiyon damla alt tarafına enjekte embriyo / s taşıyın. tutma mikroenjektör pozitif basınç uygulayarak embriyo serbest bırakın. Enjekte / olmayan enjekte edilen embriyoların takip ve verimli çalışmanıza yardımcı olmak için üst tarafta olmayan enjekte edilen embriyolar ve damla alt tarafında enjekte olanları tutun.
5. Embriyo Kurtarma ve Enjeksiyon Sonuçları
- Önceden ısıtılmış SOF-HEPES ile yeni bir tabağına yaklaşık 200 ul 3 damla sağlayın. Bir microdispenser (yukarıda anlatıldığı gibi) kullanılarak enjekte embriyolar toplayın. 3 SOF-HEPES yoluyla damla taşıyarak enjekte embriyolar yıkayın.
- Mikroenjeksiyon sırasında parçalanmış embriyoların saymak ve atın.
İlki bütün ZP doldurun, şeffaf görünür beri bir parçalanmış zigot sağlam bir birinden rahatlıkla ayırt edilebilir ve genellikle sitoplazmik vardır: NotEmbriyonun dışarıya sızıntı içeriği. - İsteğe bağlı olarak, bir floresan mikroskop kullanılarak mikroenjeksiyon verimliliğini kontrol edin. UV ışığı maruziyeti sonraki gelişimini etkileyebilir embriyo hasarına neden olabileceğini unutmayın.
- 38.5 ° C 'de, mineral yağ altında 4 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) ile desteklenmiş, potasyum simpleks optimizasyonu ortamı 50 ul damlalar (KSOM) 25 enjekte edilen embriyoların Kültür gruplan, doyma noktasına kadar,% 5 havadaki CO2 ve nem.
- enjeksiyondan iki gün sonra,% 5 FBS ile kültür ortamı Ek.
- enjeksiyondan sonra blastosist (BL) oranlarını 7 gün kontrol edin. blastosist embriyolar / o damla kültür embriyo sayısının toplam sayısı olarak BL oranlarını hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lazer destekli sitoplazmik mikroenjeksiyon hayvancılık zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için güçlü ve güvenilir bir protokoldür. 3 önce ve enjeksiyon yanı sıra tekniğin genel hatlarıyla sonra zigot genel hatlarını göstermektedir. Dekstran, kırmızı püskürtme ve enjeksiyon verimliliği ve doğruluk izleme sitesi sağlamak için çözelti enjekte olarak kullanılır. Çözeltinin başarılı dağıtım boya homojen olarak sitoplazmada dağıtıldığı bir en son enjekte embriyo gösteren Şekil 4 'de gösterilmiştir. embriyoların% 100 sitoplazmalarında enjekte edilir, bu teknik kullanılarak.
Bu protokol büyükbaş ve küçükbaş zigotlardan minimal lizis fiyat bilgisi için göstermiştir. Sadece 15.6 ± 5 ve enjekte edilen embriyoların 5.8 ±% 3.9 mikroenjeksiyon sonucu sırasıyla sığır ve koyun, eritildi
Bu sonuçlar lazer yardımlı intrasitoplazmik enjeksiyon, normal blastosist gelişimi oranları enjeksiyon ve sonuçları sırasında en az hasara neden olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Genel Şeması Holding ve Enjeksiyon Pipetler to Make gösteriliyor. AB) Enjeksiyon pipet, CE) pipet tutarak. A) yavaşça istenen çapta (5 mikron) çekti pipet ile filaman dokunun. Isıtıcı kısaca etkinleştirin (o gösterdi aralık). O Filament ve, pipet pipet konumlandırma yaklaşık 0.5 cm uzakta onun ucundan pipet. B) Marka ve açı düz bir kesim üreten temas noktasında kıracak soğutma üzerine yapışır, böylece bu biraz pipet eriyecek yaklaşık 10 mikron uzaklıkta ısıtıcı filamandan. İstenilen açı elde edilinceye kadar). C ısıtma Devam işaretlemek için bir elmas uçlu kalem kullanın ve ona gelene kadar, ateş-lehçe dikey konumda istenilen çapta (180 mikron). D) tutma pipet ucu tutma pipet kesti istenen iç çapı (40 mikron). E) birkaç mikron uzaklıkta filamandan ve yaklaşık 0.5 cm uzakta onun ucundan yatay konumlandırma geri pipet getiren pipet üzerinde bir açı yapın ulaşır. Filament üzerinde pipet bend ısıtıcı etkinleştirin. İstenilen açı elde edilinceye kadar ısıtma devam edin. Iğne yapmak için nasıl daha fazla bilgi için 8,9,10 bakınız.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:.. Enjeksiyon Dish Genel Ayar pipetler, düzenlenmesi düşer ve embriyolar bu çizimde görüntülenen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Lazer destekli Eğer intrasitoplazmik enjeksiyon Protokol A), enjeksiyondan önce tutma pipet bağlanmış bir zigot genel bir diyagramdır. PB: Polar organları, ZP: zona pellucida, Cyt: Sitoplazma, PN: pronüklei, PM: Plazma membrane HP: tutma pipet, IP:. B) lazer kullanarak tutma pipet bağlı bir zigot ZP bir delik açın C) embriyonun zıt tarafına doğru enjeksiyon pipet tanıtın. Enjeksiyon pipet) Mikroenjeksiyon adımları BE . Menisküs (b) Son başlangıç noktası, bir zigot çapı ulaşana kadar) menisküs (A). D pozisyonunu doğrula enjeksiyon pipetine içinde sitoplazmik içerik aspire plazma membranını kırın. E) zigotik sitoplazmaya sitoplazmik içerik ve çözelti geri enjekte . Uzaklık ab enjekte çözüm. F) enjeksiyonundan sonra bir zigot genel diyagramı ~ 7 pl temsil eder. Enjekte çözüm homojen sitoplazma içine yayılır unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:.. Ile Dekstran-kırmızı bir Enjekte Embriyo A) enjekte zigot B Aydınlık alan görüntüsü) enjekte zigotun Floresan görüntü Temsilcisi Şekil bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. Veriler 4 sığır embriyolarının için çoğaltır temsil İki Farklı Türlerinde Zigot Mikroenjeksiyon sonrası parçalanır Embriyolar oranı ve 3 (103 enjekte zigot toplamı) küçükbaş embriyoların (173 enjekte zigot toplamı) için çoğaltır. Hata çubukları sem temsil görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.
. Şekil 6: Sığır ve Koyun Embriyolar Data Blastosist Oranları 4 enjekte 102 ve 156 kontrol embriyoların toplam sığır cinsi için çoğaltır ve 3 enjekte 163 ve 239 kontrol embriyoların toplam koyun türleri için çoğaltır temsil eder. Hata çubukları sem temsil bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
zigot Mikroenjeksiyon memeli embriyolarının içine çözümleri tanıtmak için köklü bir yöntemdir. türleri ve Deneyin amacı göre bazı farklılıklar ile, bu teknik genel olarak kullanılabilir. Biz bir künt uç mikropipet girişinde yardımcı olmak için bir lazer kullanarak intrasitoplazmik mikroenjeksiyon nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. (Örneğin sığır, koyun ve domuz gibi) bazı hayvan türlerinin zigot, embriyo içinde bir kez enjeksiyon pipet görselleştirme engelleyen, karanlık bir sitoplazma var. Ayrıca, plazma membranlar, çok elastik elde etmek zor (genellikle kemirgen türlerinin zigot enjekte etmek için kullanılır), bir eğimli çivili iğne ile kendi nüfuz yapma. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, plazma membranı ve embriyo sitoplazması içindeki çözeltisi salım kırılmasını sağlamak için zona pellucida ve sitoplazmik içerik daha sonra aspirasyon ile küt uç iğne geçişine imkan vermek için bir lazer kullanılabilir. Ayrıca, Injecti göreİğne girişinin ters sitesinde ng (yaklaşık 3/4 embriyo içinde) biz PN deplase ve böylece aspirasyon / enjeksiyon önlemek hedefliyoruz. Ayrıca, bu sayede düşük lizis oranları ile sonuçlanan kırık zar iyileşmek için temas daha fazla noktası sağlar.
mikromanipülatör içine ayarı iyi mikropipetler (özellikle enjekte pipet) üreten ve uygun bu teknikle iyi sonuçlar elde anahtarıdır. Enjeksiyon iğnesi sürece enjeksiyon solüsyonu iğne içinden yavaşça hareket ederken kullanılabilir. Bazen, sitoplazmik içerik ve hatta pronüklei içerik akışı düzensiz çalışmasına neden ve enjeksiyon zorlaştıran, iğne ucu içine takılıyor (bu da parçalama oranlarını artırıyor ve süreci geciktirir). Bu durumda enjeksiyon iğnesi değiştirilmesi bu protokol ile en iyi sonuçları elde etmek için gereklidir. Embriyolar inkübatör dışındaki süreyi çok önemlidirtutarlı sağkalım oranları elde etmek ve 30 dakika geçmemelidir. eğitim ve uygulama sonrası, operatörler genellikle dakikada 1-2 enjekte edilen embriyoların bir enjeksiyon hızı elde. Bu protokolün başarısı için bir diğer önemli nokta sürekli embriyo başına çözüm hacmi aynı miktarda enjekte edilmesidir. Bu kolay ve doğru bir çözelti, yağ arayüz menisküsün değiştirmesini gözlemleyerek kontrol edilir. Pipet çapı manipülasyonlar ile ucu, düzenli ve sabit bir çapa sahip olduğu tutarlıdır önemlidir. ucunda 5 uM İD pipetler ile, 7 - enjeksiyon hacmi 10 PL, bir zigot boyu eşdeğer püskürtülmesiyle elde edilir. Aşırı enjeksiyon genellikle embriyo lizis sonuçlanır.
Bu protokolü kullanarak, embriyoların% 100 tamamen yanlış perivitelline uzay enjeksiyonları (Şekil 4) kaçınarak, sitoplazmaya düzgün enjekte edilir. (Bu güvenilirliği arttırır ve tahlil uyarlık yapılıyorbağımsız olarak sonuçlar yana enjekte çözelti) sadece enjekte çözeltisi etkisi olup, enjeksiyon tutarsızlık kaynaklanmaktadır. Enjekte zigot Bazı nedeniyle genellikle enjeksiyon sırasında mekanik hasarlara parçalanmayabilir olacaktır. Enjeksiyondan sonra hayatta kalma bir olağan oranı% 75 11'dir. Bu yöntemi kullanarak, biz parçalanmış embriyolar (Şekil 5) minimal oranları elde edebiliyoruz. Ayrıca, blastosist gelişimi oranları enjeksiyon tekniği erken embriyo gelişimi üzerine herhangi bir zararlı etkileri olduğunu gösteren, sigara enjekte (kontrol) embriyolar (Şekil 6) karşılaştırılabilir. Bu protokolün verimliliği en son sığır zigotların 5 enjekte edilmesi için geleneksel bir sitoplazmik mikroenjeksiyon protokolü (lazer kullanılmadan bir eğimli kirpi cam iğne kullanılarak doğrudan sitoplazmik mikroenjeksiyon ZP de nüfuz) ile karşılaştırılmıştır. Sonuçlar parçalanmış embriyoların oranlarının anlamlı olarak yüksek ve doğrudan cytopl için blastosist oluşumu düşük fiyatla gösterdiasmic mikroenjeksiyon. Biz, lazer yardımlı sitoplazmik mikroenjeksiyon kullanarak bu protokol laboratuvarımızda hayvancılık türleri enjekte etmek için tercih edilen bir yaparken bu farklar iğne penetrasyon sırasında daha az mekanik hasar nedeniyle olduğuna inanıyorum.
Burada, in-vitro fertilizasyon ile elde edilen sığır ve küçükbaş embriyolar için veri sunmak değil, aynı zamanda benzer sonuçlar elde domuz embriyolar (veriler gösterilmemiştir) in-vivo ve in-vitro kullanarak protokolü test ettik. enjekte çözümüne bağlı olarak, bu protokol bir çok uygulama için kullanılabilir. Son zamanlarda, biz knock-out belirli genleri in vitro döllenmiş sığır embriyolarının bir CRISPR / Cas9 sistemi tanıtmak için kullanmış ve yüksek mutasyonları ile sıralı blastosist oranı bulundu: embriyoların% 50 (n = 6) bialelik mutasyonlar vardı % 33 (n = 4) monoallelik mutasyonlar vardı ve% 17 (n = 2), vahşi tip 5 idi. Bu protokol, çok güvenilir ve kullanılabilecekBirkaç tür ve sayısız uygulamaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 100 x 15 mm culture dish | Falcon | 351029 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used. |
| 35 mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10 mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCl2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
- McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
- Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
- Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
- Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
- Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
- Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
- Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
- Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
- Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).
