Summary
Descreve-se um método para rotulagem de xenoenxertos estável derivado do doente (PDXs) com partículas lentivirais que expressam a proteína e repórteres de luciferase fluorescente verde. Este método permite acompanhar o crescimento de PDXs no sítio primário, bem como a detecção de metástases espontâneas e experimentais que utilizam em sistemas de imagem in vivo.
Introduction
O desenvolvimento de xenoenxertos de tumor derivadas de doentes (PDXs), onde as amostras de tumor cirurgicamente ressecado são enxertadas directamente em ratinhos imunocomprometidos, oferece várias vantagens em relação a modelos de xenoenxerto padrão de linha de célula, e representa um avanço importante na investigação do cancro 1,2. PDXs pode ser mantido e ampliado por passagens sucessivas com alteração mínima das características genéticas e biológicas do tumor cresceu na primeira passagem; e reflectir com maior precisão do que a heterogeneidade do tumor xenotransplantes derivados de linhas celulares de cancro humano 3-8. Estes modelos são agora amplamente utilizado como uma plataforma para personalizar cancro terapêutica 9,10, como uma plataforma pré-clínico no desenvolvimento de medicamentos 6,11 e como uma ferramenta experimental para o estudo da biologia do câncer 4,12.
A maioria dos PDXs são implantados e propagadas por via subcutânea, o que permite viabilizar medição do crescimento do tumor ao longo do tempo utilizando um compasso. Contudo, Doença metastática tem sido mais difíceis de modelar utilizando PDXs. Especificamente para o cancro da mama, xenotransplantes com capacidade metastática a diferentes órgãos foram descritas 3,5,13, mas a freqüência de divulgação espontânea para sítios metastáticos é extremamente baixo. Onde relatado, a identificação e quantificação de carga metastático confia no exame histológico laboriosa de órgãos-alvo post-mortem. linhas celulares de cancro que expressam bioluminescente (luciferase, Luc) ou fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) repórteres genes são comumente usados em modelos experimentais de metástases do cancro da mama para o cérebro, pulmão, ossos e fígado após intracardíaca, tail-veia, intrafemoral e injeção do baço 14-16. Embora estes modelos ignorar disseminação de tumores primários, eles são valiosos para estudar os mecanismos de tropismo do órgão e colonização metastático. No entanto, as células derivadas de tumores de pacientes primários e PDXs pode ter baixa transfecção ou taxas de transdução de using procedimentos padrão. Uma alternativa é estabelecer linhas celulares derivadas PDX-17 in vitro, que pode ser, em seguida, marcada utilizando protocolos de cultura de tecidos convencionais. Esta abordagem, no entanto, não é adequado para etiquetar a maioria dos PDXs, para a qual linha celular de derivação é difícil e pode alterar o fenótipo das células. Aqui é apresentado um protocolo para a transdução de células tumorais dissociadas com PDX-lentivirais adequados para imagiologia in vivo. Além disso, descrevemos a metástase experimental com injeção intracardíaca de células PDX luc-GFP rotulados dissociados em ratinhos imunocomprometidos.
Um protocolo de base para a transdução de Organóides PDX-dissociáveis por gene-repórter que expressa lentivírus foi anteriormente descrito 18. No protocolo corrente que descrevem métodos adicionais para enriquecer em células de tumores humanos e obter perto de 100% de eficiência de transdução, bem como o uso de PDXs marcados para a detecção de cancro da mama experimentalmetástases. Este protocolo pode ser adaptado para a marcação de vários tipos de cancro da PDXs com vários marcadores luminescentes e fluorescentes, bem como na modulação da expressão do gene (ou seja, shRNA knockdown de genes de interesse).
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Protocol
Todos os passos que requerem o uso de animais neste protocolo segue as diretrizes da Universidade do Colorado comitê de ética de pesquisa animal (IACUC).
1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura e outros reagentes
- Preparar 100 ml mammosphere meio contendo Meio de Dulbecco Modificado de Eagle Médium e Han F-12 (DMEM / F12) (1: 1), base de Fibroblastos Factor de Crescimento (bFGF, 20 ng / ml), factor de crescimento epidérmico (EGF, 10 ng / mL ), heparina (4 ug / ml), 1x B27, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 ug / ml). Tornar a mídia em condições estéreis e armazenar a 4 ° C por até 3 meses.
- Preparar tampão de enriquecimento epitelial (EEB) contendo PBS, pH 7,2, 0,5% Albumina de Soro Bovino (BSA), 2 mM de EDTA. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C por até 6 meses.
- Faça alíquotas de 5 ml em tampão de digestão de 15 ml estéreis tubos cónicos e armazenar a -20 ° C, durante meses. A noite antes da digestão tumor, tampão degelo digestão (5 ml por 500 mgtumor) em gelo, a 4 ° C. Adicionar mistura de antibiótico-antimicótico 1x antes da utilização.
- Autoclave (121 ° C durante 30 minutos), pelo menos, duas pinças, escalpelo e tesoura para dissecção de PDXs.
- Adicione 500 ml de tampão de lavagem contendo DMEM: F12 e 5% de Soro Fetal Bovino (FBS). Armazenar a 4 ° C durante meses. Alíquota de 10 ml por tumor no dia da dissecção tumor.
- Prepare um estoque de polibreno a 4 mg / mL com água estéril. Filtrar e alíquota de 1,5 ml em tubos de microcentrífuga contendo 100 ul de cada, armazenar a -20 ° C.
2. Geração de alto título de Lentivirus Partículas Carrying rastreável Markers
- Adquirir ou gerar partículas lentivirais elevado título portadores de um gene repórter (ie., GFP e Luc para acompanhamento in vivo do crescimento do tumor) 18,19.
NOTA: A título de lentivírus> 8 10 TU / ml (unidades de transdução por mililitro) é recomendado para a transdução de PDXs bem sucedida. O lentiviral partigos devem ser pseudotipado com glicoproteína G de um envelope a partir de vírus da estomatite vesicular (VSV-G), permitindo que a transdução de uma ampla variedade de células de mamíferos.
NOTA: O protocolo utilizado aqui para a geração e a titulação das partículas de lentivírus de título elevado está disponível ao www.kottonlab.com . Vectores utilizados neste protocolo são pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro e o duplo promotor fago-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Este vector foi gerado substituindo dsRed com o gene luciferase a jusante do promotor EF1aL no vector-fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP W, um presente tipo de Darrell Kotton, da Universidade de Boston.
3. Geração de xenoenxertos derivadas de doentes
- Gerar paciente derivado xenotransplantes (PDX) a partir de cancro da mama através da implantação de tumores mamários primários ou metastáticos na almofada de gordura mamária de ratos imunocomprometidos 3,4. Gerar tumores em um tamanho máximo recomendado de 1 cm de diâmetro como tumores maiores são likely para conter núcleos necróticos.
NOTA: Detalhado métodos de fixação e transplante xenotransplantes são descritos em DeRose et al 18.. Crescimento das estabelecidas-PDXs transplantáveis em tumores> 1 cm de diâmetro tem entre 4 e 24 semanas após a implantação em imunocomprometidos NOD / SCID / ILIIrg - / - (NSG), dependendo da taxa de crescimento do tumor intrínsecas. Embora este protocolo descreve a transdução de PDXs cancro da mama, pode ser usado para a transdução virai de qualquer tumor adequado para a curto prazo na passagem in vitro. A sensibilidade de PDXs a curto prazo (24-96 h) na sobrevivência in vitro é intrínseco a cada tumor e deve ser determinado experimentalmente.
4. Dissecção do tumor e a dissociação de células de tumor derivadas de PDX
- Euthanize camundongos portadores PDX usando inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical (siga as diretrizes institucionais de pesquisa animal comissão de ética). Submerge ratinhos em uma solução a 0,2% Chlorhexidine solução durante 1 min. Definir mouse em uma posição supina em cima de uma placa de dissecação, e usar pinos para fixar os membros superiores e inferiores estendidos para o conselho.
- Utilizando uma técnica asséptica, usar um bisturi para cortar a pele em torno do tumor. Puxar a pele com um conjunto de pinças e separá-lo do tumor utilizando um bisturi limpa até que o tumor está completamente exposta. Usando um jogo limpo de pinça e bisturi, remove o tumor e colocá-lo em 5 ml lavar media no gelo.
- Tome tumor dissecado em um armário BLS2 para processamento posterior. Remover o meio e lavar tumor com 10 ml de Salina Equilibrada de Hank de sódio modificado com 10 mM de Hepes (HBSS / HEPES), duas vezes.
- Largar o tumor em um 60 centímetros placa de cultura de tecidos pré-pesado estéril. Pesa-se o prato que contém o tumor para estimar a massa do tumor.
- Utilizando um bisturi, cortar o tumor em metade, em seguida, cortado um disco de 3 mm da metade e coloque-a num recipiente com 10% de formalina durante 24 h. Utilizar este tecido para verificar a heterogeneidade daamostra de tumor (PDX parental). Adicionar 200 mL de HBSS / Hepes (o suficiente para evitar o tecido seque) e pique o tumor permanece nos menores pedaços possíveis usando uma pinça e um bisturi limpo.
- Transferir o tumor fragmentado em um tubo de 50 ml estéril. Adicionar pelo menos 1 ml de tampão de digestão contendo 1x antimicótico-antibiótico por 100 mg de tumor.
NOTA: A adição de antibióticos / antimicóticos evita a contaminação de células tumorais in vitro. - Digest do tumor durante 3 horas a 30 ° C, com agitação a 125-200 rpm.
NOTA: O aumento da temperatura até 37 ° C aumenta a eficiência da digestão (células mais simples ao longo do tempo), mas isso é normalmente acompanhada por um aumento da morte celular. Para a maioria dos tumores, a digestão a 30 ° C durante 3 hr resultados em números suficientes de células dissociadas viáveis para prosseguir para o passo de marcação. - Parar a digestão adicionando 35 ml lavar media (DMEM / F12 com 5% de FBS). Filtrar através de um nylon de 70 mm malha em um limpos 50 ml ctubo onical para remover o tecido não digerido. Centrifugar a mídia filtrados contendo células digerida a 400 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Adicionar 10 ml de tampão de lavagem (DMEM: F12, FBS a 5%) para parar a lise. Passa células através de nylon de malha 40 uM para remover aglomerados. Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos e remover o sobrenadante, colocar no gelo.
- Ressuspender as células em 5 ml digerido tampão de lavagem e contar as células tanto viáveis e não viáveis utilizando exclusão com azul de tripano. Resumidamente, misturar 50 ul de células e 50 ul de azul de tripano e contagem de células com exclusão de tripano azul-usando um hemocitómetro.
Nota: O produto em bruto a digestão conterá células tumorais humanas derivadas da PDX, bem como as células estromais do rato (fibroblastos, células do sangue, etc.). células digeridas pode agora ser processada para rotulagem (passo 6), ou células de cancro humano podem ser enriquecidas utilizando um dos procedimentos descritosem 5 Ref.
5. Enriquecimento de células cancerosas epiteliais humanas
- Esgotar as células do rato do estroma usando uma linhagem kit depleção de células (Lin +) 20.
NOTA: Recomendado para tumores altamente vascularizadas e / ou tumores com elevado teor de estroma em que a expressão de EpCAM é desconhecida ou perdidos).- Levar até 10 7 células viáveis num tubo de polipropileno de 5 ml limpo, adicionar 2 ml EEB e centrifugar a 300 xg por 5 min. Pipeta off sobrenadante completamente.
- Sedimento de células ressuspender em 40 mL de EEB gelada por 10 7 células.
- Adicionam-se 10 ul de coquetel de biotina-anticorpo por 10 7 células, mistura-se pipetando suavemente e incuba-se a 4 ° C durante 10 min (cocktail contém anticorpos para células de ratinho Lin +).
- Adicionar 30 ul de EEB fria por 10 7 células, misture com cuidado pipetando.
- Adicionar 20 ul de microesferas anti-biotina por 10 7 células misture pipetando suave e incubar a 4 & #176; C durante 15 min.
- Lavar as células com 3 ml EEB frio, centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. pellet ressuspender em 500 mL de EEB e colocar no gelo.
- Colocar a coluna no campo magnético de um separador magnético. Lavar coluna com 0,5 ml de tampão de enriquecimento epitelial e permitir que a escorrer através. Não permita que a coluna para secar.
- Coloque um novo tubo de recolha de polipropileno sob a coluna. Lentamente, adicionar 500 ul contendo células marcadas através da coluna (Lin + rotulados células será retida na coluna magnética). Recolha de efluentes como uma fração com células não marcadas, o que representa a fração de células enriquecida linhagem negativa (tumor).
- Lavar a coluna 3 vezes com 500 mL de EBB e recolher o efluente no mesmo tubo como efluente da etapa 5.1.8. Mantenha efluentes, gelo e proceder à etapa de rotulagem (6).
- Opcional: Tome a coluna fora do campo magnético. Coloque um novo tubo de polipropileno por baixoe elui-se a fracção LIN + pela adição de 500 ul de EEB, três vezes e usando o êmbolo fornecida.
- Enriquecimento de células cancerosas epiteliais EpCAM + humanos (recomendado para os tumores conhecidos para expressar CD326 + e contêm alto teor estromal mouse).
- Levar até 10 7 células viáveis num tubo de polipropileno de 5 ml limpo, adicionar 2 ml EEB frio e centrifugar a 300 xg por 5 min. Pipeta off sobrenadante completamente.
- Sedimento de células ressuspender em 60 mL de EBB gelada por 10 7 células.
- Adicionar 20 ul de microesferas de EpCAM por 10 7 células, mistura-se pipetando suavemente e incuba-se a 4 ° C durante 30 min.
- Lavar as células com 3 ml EEB frio, centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender pellet em 500 mL de EEB e colocar no gelo.
- Coloque coluna no campo magnético de um mini-separador. Lavar coluna com 0,5 ml de EEB e permitir que a escorrer através. Não permitir que a coluna para secarFora.
- Coloque um novo tubo de recolha de polipropileno sob a coluna. Lentamente, adicionar 500 ul contendo células marcadas através da coluna (EpCAM + células marcadas será retida na coluna magnética). Recolha de efluentes como uma fração com células não marcados, representando as células do rato do estroma.
- Lavar a coluna 4 vezes com 500 ul de tampão de ME e recolher o efluente no mesmo tubo como efluente do passo 5.1.8.
- Aqui a coluna do lado de fora do campo magnético. Coloque um novo tubo de polipropileno por baixo e eluir o EpCAM + fração adicionando 500 mL de ME buffer, três vezes. Lave as células magneticamente marcadas empurrando firmemente o êmbolo na coluna. Recolhe efluente contendo a fracção de células de tumor de EpCAM + enriquecidas e manter em gelo. Prossiga para a etapa 6.
6. A transdução de células tumorais derivadas de PDX
- Centrífuga dissociada células tumorais em 300 gx 5 min e ressuspender em 2 ml mammosphere mediuma. Contagem de células viáveis utilizando a exclusão de azul de tripano como em 4.11.
- Preparar 10 ml de meio contendo 8 mammosphere ug / ml de polibreno (2 ul de estoque de polibreno por ml de meio).
- Determinar o volume necessário para 2 x 10 5 células tumorais viáveis. células centrifugar a 300 xg durante 5 min, e ressuspender sedimento em 2 ml de meio contendo polibreno. Placa 2 x 10 5 células tumorais viáveis por poço numa placa de cultura de 6 poços ultra-baixo de Aderência de Tecido.
NOTA: Este é um número ideal de células necessárias para a transdução com um vector lentiviral.
CUIDADO! Partículas lentivirais e todos os consumíveis usados com partículas lentivirais deve ser manuseado seguindo procedimentos institucionais para biohazards de DNA recombinante.
NOTA: transdução de Lentivirus de células da mama primários favorece fortemente as células mioepiteliais que pode resultar em má rotulagem de células luminais e selecção de sub-populações de células tumorais durante a rotulagem 21. <li> Incubar o vírus com 200 mU / ml de neuraminidase, a 37 ° C durante 1 h antes de transdução para aumentar a ligação de partículas virais a diferentes subpopulações de células primária e correcto para este potencial de polarização 21. - Adicionar partículas lentivirais a 10 MOI (2 x 10 6 TU para 2 x 10 5 células viáveis) se células dissociadas são PDX-empobrecido a partir de células de ratinho ou Lin + enriquecida em células EpCAM +. Adicionar partículas lentivirais a 30 MOI (6 x 10 6 TU para 2 x 10 5 células viáveis) se usando células PDX-dissociados não enriquecido.
NOTA: O aumento da MOI permite a transdução eficiente mesmo na presença de grandes quantidades de detritos e células mortas em extractos brutos. Manter um poço com células não marcadas para servir como um controlo para a viabilidade e a eficiência de transdução. - Agite para misturar vírus com as células. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante até 96 h. Adicionar 500 ul de meios frescos mammosphere 24 h após a transfecção. As células não ATTACh em placas, não aspirar mídia.
7. Avaliação da transdução de Eficiência e Re-implantação de células marcadas em ratinhos imunocomprometidos
- Monitorar a expressão do marcador de rastreabilidade (GFP) a cada 24 horas usando um microscópio de fluorescência a 10x de ampliação.
NOTA: a expressão da GFP pode ser observada tão cedo quanto 24 h após a infecção, mas na maioria dos PDXs expressão da GFP é claramente visível após 72 horas (Figura 1). - Estimativa da eficiência de transdução através da avaliação da percentagem de células GFP + para dentro do poço total.
Observação: Uma vez que as culturas continham células tumorais, células do estroma residuais, e as células mortas em vários graus, com poços de tão baixo como 10% de GFP + células podem ser implantadas num ratinho hospedeiro. - Transferir as células transduzidas de placas de 6 poços em um tubo de 15 ml. Adicionar 1 ml de meios mammosphere ao poço para coletar todas as células deixadas para trás. Coloque no gelo.
- Adicionar 10 ml de HBSS / HEPES a células transduzidas e Centrifuge a 300 xg durante 5 min, 4 ° C. aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 50 mL extrato da matriz basal (BME) em gelo.
NOTA: alíquotas BME deve ser descongelada em gelo, 1 - 2 horas antes da utilização. BME irá solidificar à temperatura ambiente; manter em gelo em todos os momentos. - Carregar células BME-incorporados dentro de uma seringa de 0,5 ml de insulina, manter em gelo, e trazer para a instalação de animais para reimplante em ratos NSG.
- Anestesiar feminina 4 - ratos NSG com 8 semanas, usando 5% de isoflurano / 95% de oxigênio durante 5 min, seguido de isoflurano a 2% / 98% de oxigênio ou de acordo com a ética em pesquisa com animais aprovados protocolo aprovado.
- Quando animais não responde a estímulos de dor (toe-pitada), limpar a zona da injecção com betadine seguido por toalhetes de etanol, e injectar os 50 ul de células no 4º mamária almofada de gordura. Fornecer ratos com analgesia para aliviar o desconforto de injeção conforme indicado no protocolo aprovado.
- Permitir que as células para formar tumores (2 - 12 semanas) e monitorar GFP e / oua actividade da luciferase utilizando um sistema sintonizável luz e / ou no sistema de imagem in vivo da luciferase (Figura 2).
NOTA: Siga as orientações para anestesia, analgesia, medições carga tumoral e critérios de eutanásia aprovado pela Institutional Animal comitê de ética em pesquisa.
8. Controle de Qualidade de PDXs rotuladas
- Determinar a eficiência de marcação por meio da avaliação da luciferase e a expressão da GFP em tumores marcados.
NOTA: Siga animais institucional comitê de ética aprovou os procedimentos para in vivo de imagem de bioluminescência (Figuras 2, 3).- Dissecar tumores de ratinhos sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 1,0-1,5 cm de diâmetro (ou antes de acordo com os protocolos aprovados, tal como descrito no 4). Dissecção deve ser realizada sob um sistema de luz ajustável (ou um sistema equivalente que permita avaliar fluorescência da GFP).
- A partir de cada tumor, o PE estimar qualitativamentercentage de GFP + tumor utilizando microscopia. Se menos de 100%, dissecar única parte GFP +. Dissecar um disco de 3 mm e fixar em formalina a 10% para inclusão em parafina e análise histológica, salvar um pequeno pedaço de RNA ou outras análises desejadas e salvar tanto do tumor quanto possível em cada 1,5 ml criotubos contendo 90% FBS / 10% DMSO para criopreservação.
- Peças re-implante de tumor marcado em novo destinatário NSG ratos 18 para expandir e usar em estudos metástases experimentais.
- Execute coloração imuno-histoquímica padrão de tecido embebido em parafina obtida a partir de tumores antes da transdução e a cada geração, posteriormente, para verificar se PDXs marcados permanecem histologicamente semelhantes aos PDXs originais.
NOTA: Os marcadores utilizados para controle de qualidade variam de acordo com cada PDXs. Para PDXs cancro da mama, a expressão do receptor de estrogénio, o receptor de progesterona, receptor do factor de crescimento epidérmico 2 (HER2), receptor do factor de crescimento epidérmico 1 (HER1 ou EGFR), PAn-citoqueratina (pan-CK) são recomendadas para triagem inicial.
9. Modelos Metástase experimental com PDXs rotuladas
- Seguindo os passos descritos na secção 4, dissociar as células tumorais a partir de um PDX rotulados. Se tumor é altamente vascularizado ou rica em estroma do mouse, execute o enriquecimento de células cancerosas como descrito em 4.5 ou 4.6.
- Contagem de células viáveis utilizando a exclusão de azul de tripano, e diluir 250.000 células em 100 ul de PBS (Ca 2+, Mg 2+ livre) por ratos. Manter as células no gelo. Para a injecção de vários ratinhos, ajustar os números em conformidade (e preparar um excesso de, pelo menos, uma injecção adicional para ter em conta os erros de pipetagem).
- Traga células no gelo ao animal sala de procedimento adequado e proceder à injecção intra-cardíaca acordo com o protocolo IACUC aprovado.
NOTA: Detalhado protocolos para injecção intra-cardíaca de células cancerosas foram descritos em outro 22,23. - Rastrear e quantificar metastáticoespalhar ao longo do tempo usando a imagem de bioluminescência. Visualizar metástases macroscópicas em diferentes órgãos usando a bioluminescência e / ou imagiologia de órgãos isolados GFP no momento da necropsia 24 (Figura 6).
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Representative Results
Este método descreve a transdução de células de cancro da mama PDX-dissociadas utilizando título elevado vectores lentivirais pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro e fago-EF1aL-luciferase-UBC-W-GFP. Estes vectores expressam um marcador fluorescente que permite estimar a eficiência da transdução in vitro, tão cedo quanto 24 h após a infecção (Figura 1a). Para a maioria das PDXs, expressão de GFP será atrasado até 72 h após a infecção (Figura 1b), neste momento a formação de agregados de células é geralmente observado. A transdução pode ser conseguida após enriquecimento para células de cancro humano (isto é, utilizando a depleção de células Lin +, Figura 1a) ou em bruto células PDX-dissociadas (Figura 1b). O enriquecimento de células epiteliais de tumor é recomendada para tumores altamente vascularizadas foram células do sangue de rato representar uma percentagem significativa do número total de células viáveis.
in vitro, células marcadas são recolhidas e suspensas em matriz extracelular e re-implantado em ratos NSG. Células tumorais marcadas regenerar tumores que podem ser rastreados usando a bioluminescência ou fluorescência (Figura 2). Eficiência de transdução deve ser avaliada a formação de tumores a seguir, e que irá variar dependendo da susceptibilidade de diferentes PDXs a transdução in vitro. A PDX marcado com sucesso estará perto de 100% de GFP + a primeira geração de pós-transdução (Figura 2B, C) e vai ficar na proximidade de 100% + GFP em passagens subsequentes (Figura 3). No entanto, alguns PDXs mostrará distribuição "irregular" de GFP + células (Figura 4), indicando uma sub-óptima na transdução in vitro. Nestes casos, os tumores podem ser dissecados sob um sistema de visualização de fluorescência para seleccionar áreas GFP + que pode ser re-implantadas para expansão da SubPop marcadomento, ou tumores podem ser dissociados e células GFP + podem ser isoladas usando FACS seguido por re-implantação em ratinhos NSG.
Uma vez que a dissociação e a transdução de PDX pode resultar na selecção de subpopulações de células dentro do tumor, os investigadores necessitam para verificar que os tumores marcados assemelham-se aos tumores parentais a partir dos quais eles foram obtidos. PDXs devem ser coradas por IHQ a cada geração para demonstrar que os marcadores críticos, tais EGFR, receptores hormonais (ou seja, receptor de estrogênio) e pan-citoqueratinas (PanCK, marcadores de células epiteliais) são conservados em PDXs rotulados. A Figura 5 mostra coloração para EGFR e panCK em um triplo cancro da mama negativo PDX (coloração receptor hormonal não é mostrado como esta PDX carece de estrogênio e receptor de progesterona).
PDXs marcado pode ser usado para controlar a propagação metastática espontâneas, bem como metastático experimentaldistribuídos por células semear directamente para a circulação. Metástases espontâneas de PDXs câncer de mama ocorrem com menos frequência, mas têm sido relatados por vários grupos 3,13,25. Modelos experimentais de metástases fornecer uma alternativa para estudar passos tropismo de órgãos e de órgãos-colonização na cascata metastática. Células dissociadas a partir de tumores marcados são injetados intracardial ea carga metastático é rastreado usando a imagem de bioluminescência. Como mostrado na Figura 6, um PDX transduzidas com o fago-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W injectado a 250.000 células / rato formaram metástases nos pulmões e fígado que foram facilmente identificadas com imagiologia de luciferase in vivo, e a expressão da GFP em órgãos ex vivo .
Figura 1:. Seguimento eficácia de transdução em células dissociadas PDX A) B PDX-dissociado) células PDX-dissociadas a partir de uma experiência separada, sem enriquecimento de células epiteliais, 72 hr após transdução com o fago-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Ambos os painéis mostram células vivas. BF: imagens de campo claro, barra representa 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Criação de PDXs marcados em camundongos células hospedeiras transduzidas com fago-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W durante 72 horas foram implantados na almofada de gordura mamária de um rato NSG feminino. O tumor foi deixada a crescer durante 14 semanas após a injecção. A) Luciferase actividade repórter é avaliada por imagiologia in vivo após injecção intraperitoneal de B) a expressão da GFP luciferina. pode ser observado através da pele intacta, utilizando um sistema de visualização de fluorescência. expressão C) GFP também deve ser verificada a dissecção para determinar a extensão de rotulagem do tumor. Este exemplo mostra tumor GFP expressando onipresente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Rotulado PDXs Reter rastreáveis Marcadores após várias passagens in vivo A PDX cancro da mama marcado com fago-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W é mostrado 3 passagens após a transdução.. expressão da GFP permanece em cerca de 100% no tumor passadas.54944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Exemplo de um PDXs com Eficiência Suboptimal Transdução. A) cancro da mama PDX marcado com fago-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W foi passado após uma transdução subóptima decorreu. Os tumores resultantes contêm populações mistas de células tumorais GFP GFP + e. O tumor esquerda não é adequado para a propagação. O tumor direito pode ser propagado por dissecar o GFP + regiões sob um sistema de visualização de fluorescência. B) Regiões de células GFP + em tumores mistos podem ser facilmente identificados sob luz fluorescente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Controle de Qualidade de PDX Características após a transdução e Passaging. A expressão de EGFR e pan-citoqueratina (PanCK) em tecido embebido parafina de um câncer de mama triplo negativo PDX F2-7 na passagem 2 (P2, antes da transdução), o tumor gerado imediatamente após transdução (P2-i0) e a seguinte passagem (P2-i1). Imagens 20X, Bares representa 100 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Usando PDXs Metástase experimental marcado. Um fago que expressam PDX-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W foi dissociado durante 3 h como descrito em 4, e 250.000 células nósre injetados no ventrículo cardíaco esquerdo de ratos NSG. A) o crescimento metastático pode ser rastreada em animais vivos usando imagens de luminescência. Carga metastática deste cancro da mama PDX pode ser observada em B) fígado e pulmões C) ex vivo utilizando imagiologia de órgãos dissecados sob um sistema de visualização de fluorescência. Bares representa aproximadamente 1 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As etapas críticas no âmbito do protocolo:
O uso de partículas lentivirais de título elevado (> 10 8 TU / ml) é um passo crítico no sucesso deste protocolo, como permite o controle cuidadoso da composição do meio durante a transdução in vitro. Embora vários métodos para a produção de partículas virais de título elevado têm sido bem descritos 18,19; este protocolo utiliza partículas lentivirais produzidos como descrito em detalhe www.kottonlab.com . Um método suave para a digestão e a dissociação dos tumores de células cancerígenas é crítica para a rotulagem bem sucedida e crescimento de tumores marcados. Estendendo o tempo de digestão para além de três horas ou aumentando a temperatura de digestão a 37 ° C aumenta o número de células dissociadas, mas diminui a viabilidade celular e o sucesso de rotulagem na maioria dos tumores.
Modificações e solução de problemas:
Este protocolo deve ser considerado dinâmico e exige uma adaptação para PDX único, com monitoramento cuidadoso em cada etapa. Embora este protocolo padrão funciona bem para a maioria dos tumores xenoenxertados, pequenas variações podem ser necessárias para optimizar a rotulagem das diferentes PDXs. Por exemplo, a quantidade e a composição do estroma e da matriz extracelular normalmente diferem entre PDXs, que podem afectar o tempo necessário para a dissociação e o rendimento de células tumorais obtidas depois. tumores grandes que se tornam necróticas e tumores altamente vascularizadas pode ser difícil rotular devido a detritos e células de sangue do rato excessivas. O uso de depleção de Lin + e enriquecimento EpCam + célula epitelial descrito neste protocolo melhora a eficiência de transdução em tais PDXs. No entanto, a expressão de células de EpCAM + varia mesmo em tumores de origem epitelial, assim, a sua expressão tem de ser verificada em cada PDX antes da sua utilização como método para o enriquecimento de células.
Limitações da técnica:
Transdução de células dissociadas e sua cultura in vitro temporária pode resultar na selecção de sub-populações de células, o que irá então dar origem a tumores marcados fundamentalmente diferente do PDXs parentais. A pré-incubação das partículas lentivirais com neuraminidase não é recomendado para aumentar a ligação de partículas virais para subpopulações de células 21 para transduzir difíceis, diminuindo, assim, a tendência de transdução que pode ser introduzida nesta etapa. Na nossa experiência, os tumores reconstituídos por células transduzidas são muito semelhantes às características das PDXs parentais não só histologicamente, mas também utilizando a análise de agrupamento hierárquico da expressão de ARNm (ARN seguintes, dados não mostrados). Controle de qualidade em termos de eficiência de marcação e fidelidade tumor deve ser realizada para cada PDX em cada passagem. Desde rotulagem PDX requer expansão do tumor in vivo e deriva tumor poderia ocorrer depois de repetidas passaging, transdução deve ser realizada o mais cedo possível passagem.
Significância da técnica:
Este protocolo descreve como PDXs câncer de mama pode ser fluorescente um bioluminescently marcado in vitro e re-implantado in vivo para o acompanhamento do crescimento do tumor ortotópico e metastático. Enquanto os estudos anteriores têm utilizado uma estratégia semelhante para rotular Organóides PDX-18 derivadas, o protocolo actual inclui variações na digestão do tumor e rotulagem que resultam numa elevada eficiência de transdução de várias PDXs.
As aplicações futuras ou direções Depois de dominar esta técnica:
A capacidade para expressar estavelmente os marcadores detectáveis (GFP, luciferase), e a sobre-expressar ou knockdown genes específicos (isto é, pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro pode ser utilizado para entregar shRNAs) permite o uso de PDXs para responder a questões fundamentais sobreo crescimento de tumores e metástases de um modo semelhante às linhas de células estabelecidas. Especificamente, este protocolo demonstra o uso de PDXs marcados em modelos de metástases experimentais para estudar passos órgão-colonização na cascata metastática. Metástases para diversos órgãos podem ser facilmente visualizados e quantificados utilizando a imagem de bioluminescência de animais vivos, e de expressão GFP usado para dissecções guiadas e visualizar metástases em órgãos extirpados. Isto representa uma ferramenta poderosa para facilitar o uso de PDXs para pesquisa metástase.
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Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Darrel Kotton na Universidade de Boston para fornecer o fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W vector e protocolos para a produção lentiviral título elevado usado nestes estudos. Este trabalho foi financiado pelo DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) e R01 CA140985 (CAS) concessão .NCI P30CA046934 Centro suportado in vivo de imagens e cultura de tecidos núcleos na Universidade do Colorado AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
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