活细胞成像和血管紧张素的三维分析受体1a型贩运转染人胚肾细胞使用共聚焦显微镜
Summary
在这里，我们提出了一个协议，以表达绿色荧光蛋白标记的血管紧张素1a型内吞过程中血管紧张素Ⅱ开始治疗受体细胞图像。这种技术包括用第二荧光标记物标记的溶酶体，然后利用软件随时间来分析受体和溶酶体的共定位在三维空间中。
Abstract
活细胞成像是用于同时捕获在转染人胚胎肾293（HEK）细胞在用血管紧张素II（ANG II）的刺激血管紧张素1a型受体（在1A R）和胞内隔室的时间推移的图像。 HEK细胞中瞬时与含有具有标记增强型绿色荧光蛋白（EGFP）1A耐药质粒DNA转。溶酶体标识用红色荧光染料。活细胞图像捕获对血管紧张素II刺激后激光扫描共聚焦显微镜和三维（3D，体素），随着时间的推移通过软件进行分析。活细胞成像使调查受体贩运和避免了与固定相关的困惑，特别是，绿色荧光蛋白标记的膜受体的损失或人工的位移。因此，作为单独的细胞通过时间跟踪，受体的亚细胞定位可以被成像和测量。图片必须获得sufficientlŸ迅速捕捉快速运动的囊泡。然而，以更快的成像速度，收集光子的数目被减小。妥协还必须在成像参数，如体素尺寸的选择，以获得成像速度进行。活细胞成像显著应用对蛋白质运输，迁移，增殖，细胞周期，细胞凋亡，自噬和蛋白质 – 蛋白质相互作用和动态，学习到仅举几例。
Introduction
总体目标是为了获得定量证据在时间和与具体的亚细胞器的受体共定位的空间与受体激动剂治疗后。因此，这里的当前的目标是捕获溶酶体时间推移共焦图象和一个跨膜在人胚肾细胞转染和随后收集和分析在三维成像数据定量测量到输送受体受体（HEK）溶酶体。通过受体配体激活可以帮助确定跨膜受体是如何生理和病理条件下的监管调查时与溶酶体或其他细胞器跨膜受体的内吞作用的过程中同时进行贩卖。
在1A R被假定在溶酶体中被降解以下与血管紧张素II治疗细胞模型系统，主要HEK293 1虽然大多数的RECeptors被主要定位在多泡循环核内体购买回收到质膜而配体，血管紧张素II，大头是在溶酶体2，3，4，5劣化。最近，Li 等。使用荧光共振能量转移（FRET）和荧光寿命成像显微术（FLIM）技术显示，在1Ař共定位（在〜10纳米尺度）与LAMP1，溶酶体膜蛋白表明至少一些受体靶向于与劣化被溶酶体6。这些作者指出，溶酶体抑制剂氯喹阻止在1A的R-LAMP1关联这与以前的报告表明氯喹的效果是阻止晚期内涵体或自噬体与溶酶体融合一致。其他间接的方法来确定在1A中R 1ocalization在溶酶体已经利用巴弗洛霉素，溶酶体抑制剂来推断AT在溶酶体3，4，5，6，7，8 1a中 R存在。
活细胞成像避免了细胞体积，和GFP-嵌合受体的损失/调光/再分配上固定的潜在影响。在固定的细胞先前的研究已经依靠确定共定位或受体与溶酶体或使用标记的受体结合替代物如活细胞共现β-arrestin的1，2，3，4，5，6。使用旋转盘共聚焦或激光点扫描的conf其他GPCR的活细胞成像配备的GaAsP或路政署探测器OCAL显微镜使研究者观察到在30秒的时间间隔9，10 Z-栈成像单个细胞受体的内化和贩运。但是，即使当活细胞的z堆栈迅速收集，可能每个堆叠， 即在2D 10内的单一平面的选择之后才发生分析。虽然这可能在问题研究内化的GPCR或酪氨酸激酶受体是足够的，则在1A卢比积聚在该改变的大小和位置随着时间的推移，因此在本质上更难以用一个代表性的单个片在每个时间点能充分检验囊泡。彻底确定所述标记的AT 1A R至细胞并检测囊泡在尺寸和位置不同的各亚群的途径，我们已经设计出用于3D成像和三维分析方法来跟踪这些变化，并为在与各种细胞内隔室的标记一起使用，如溶酶体。
调查人员可以使用该协议为活细胞成像可视化直接在1A R的运动进入细胞和它下面的血管紧张素Ⅱ刺激转移到细胞内车厢。亚细胞标记有荧光蛋白嵌合体或其他荧光标记。该协议也可以用来作为第一种方法本地化与200nm的最小分辨率亚细胞器的受体以比较突变与野生型受体或检测以下药物治疗的变化。该技术是可访问的，因为它可以在配备用于活细胞成像的任何共聚焦显微镜下进行。相对容易这种方法具有增加的专业知识，并进行其检测分子间的相互作用6 FRET / FLIM / BRET技术所需的设备形成对比，“外部参照”> 11。这些测量确定在高分辨率（〜10纳米）和亚细胞器内的定位推断蛋白 – 蛋白相互作用。这些更先进的技术用于跟进并进一步定义感兴趣分子间的相互作用，而不是受体通过亚细胞区室的通道，和它们直接证明了电池11内的特定的时间和地点的蛋白质-蛋白质相互作用。 FLIM，FRET一个独立的技术受主浓度的，是在固定的样品，因为图像采集速度慢最常进行的。相比之下，比FRET提供快速成像和蛋白质相互作用的高分辨率共存。比率的FRET的缺点是，成像利用宽视场落射荧光来获得成像速度和包括整个细胞，导致降低的分辨率和细胞器12的对比度。生物发光共振能量转移（BRET）是另一个已经应用到的GPCR来测量采集分子接近的随时间11先进技术。在这种技术中的蛋白荧光团分子分开并每一半连接到所讨论的两种蛋白质之一。当利益绑定的两种蛋白互相嵌合标签的零件重新组装获得的荧光随着时间的推移定量增加荧光。
在这里，我们提出了结合图像定量研究在1A的R贩运在血管紧张素Ⅱ刺激和交付的内化在1A R以下列血管紧张素Ⅱ刺激溶酶体的电位变化的细胞活细胞成像一个简单的技术。这种技术的最终用途是表征膜贩运野生比较型和突变受体的差异。这些差异将有助于确定该机制（S）的影响，在1A – [R leadi的生理活动ng到调节血压。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的初步实验表明，在24分钟相当短的时间过程，在交付在1A R-GFP到溶酶体没有明显的变化发生了。一般来说，最早可能在15-20分钟出现交货内在受体溶酶体。这个实验是用的内化在1A R的大部分是针对大，核周内涵体的假设是一致的。证据表明，至少一些在1Ař到达溶酶体由Li 等人证实。 ，谁相比在血管紧张素II治疗后5分钟和30分钟的细胞，并发现与在<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在这个手稿中提出的研究工作得到了补助R01 HL121456-01A1凯瑟琳桑德伯格支持。这项工作除了由徕卡SP8的AOB在乔治敦大学医学中心的显微镜和影像共享资源（MISR），这部分是由来自美利坚合众国国立卫生研究院P30-CA051008资助的可用性得到了支持。我们非常感谢彼得·约翰逊徕卡SP8成像援助，并在乔治敦大学的托马斯Coate生物系实验室使用蔡司LSM880与由卡尔蔡司显微镜LLC阿尔玛·阿诺德提供成像支持。在此稿件内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Riferimenti
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