Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.
Abstract
Bildgebung lebender Zellen wird verwendet , um gleichzeitig Zeitrafferbilder von Angiotensin Typ 1a – Rezeptoren erfassen (AT 1a R) und intrazelluläre Kompartimente in transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK – Zellen) nach Stimulation mit Angiotensin II (Ang II). HEK – Zellen werden transient transfiziert mit Plasmid – DNA AT 1a R enthält , mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) markiert. Lysosomen sind mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff identifiziert. Live-cell Bilder werden auf einem Laser-Scanning-Mikroskop nach dem konfokalen Ang II Stimulation erfasst und analysiert durch Software in drei Dimensionen (3D, Voxel) über die Zeit. Bildgebung lebender Zellen ermöglicht Untersuchungen zur Rezeptor-und vermeidet verwechselt mit Fixierung verbunden sind, und insbesondere der Verlust oder artifizielle Verschiebung von EGFP-markierten Membranrezeptoren. Somit ist, wie einzelne Zellen über die Zeit verfolgt werden, kann die subzelluläre Lokalisierung von Rezeptoren abgebildet und gemessen werden. Die Bilder müssen sufficientl erworben werdeny schnell schnellen Vesikel Bewegung zu erfassen. Doch bei schnelleren Belichtungsgeschwindigkeit wird die Anzahl der Photonen gesammelt reduziert. Kompromisse müssen auch bei der Auswahl der Abbildungsparameter wie Voxelgröße um Abbildungs erfolgen Geschwindigkeit zu gewinnen. Bedeutende Anwendungen von Live-Cell-Imaging sind Proteintransport zu untersuchen, Migration, Proliferation, Zellzyklus, Apoptose, Autophagie und Protein-Protein-Wechselwirkung und Dynamik, um nur einige zu nennen.
Introduction
Das Gesamtziel ist mit einem Rezeptor-Agonisten mit spezifischen subzellulären Organellen nach der Behandlung quantitative Nachweis in Zeit und Raum von Rezeptor Kolokalisation zu erhalten. Hier ist also das unmittelbare Ziel ist Zeitraffer konfokale Bilder von Lysosomen und ein Transmembranrezeptor in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) nach der Transfektion und anschließend zusammenstellen und analysieren, um die Bilddaten in 3D zu erfassen, um quantitativ die Lieferung von Rezeptor messen Lysosomen. Die Untersuchung der gleichzeitigen Handel eines Transmembranrezeptor mit Lysosomen oder anderen Organellen während der Endozytose, wenn sie von Rezeptor-Ligand aktiviert kann helfen, festzustellen, wie die Transmembranrezeptor unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen reguliert wird.
AT 1a R wird angenommen , daß in Modellzellen – Systeme mit Ang II in Lysosomen nach der Behandlung abgebaut zu werden, in erster Linie HEK293 1 , obwohl die Mehrheit der receptors sind in multivesikulären Recycling Endosomen zur späteren Rückführung in die Plasmamembran , während die Masse des Liganden Ang II hauptsächlich lokalisiert, im Lysosom abgebaut wird 2, 3, 4, 5. In jüngerer Zeit, Li et al. mit Förster – Resonanzenergietransfer (FRET) und Fluorescence Lifetime Imaging – Mikroskopie (FLIM) Techniken gezeigt , dass AT 1a R kolokalisiert (auf ~ 10 nm – Skala) mit LAMP1, Protein eine lysosomale Membran darauf hindeutet , dass zumindest ein Teil des Rezeptors gerichtet ist und abgebaut von Lysosomen 6. Diese Autoren stellten fest , dass der lysosomalen Inhibitor Chloroquin AT 1a R-LAMP1 Assoziation blockiert , die mit früheren Berichten konsistent ist darauf hindeutet , dass eine Wirkung von Chloroquin ist die Fusion von späten Endosomen oder Autophagosomen mit Lysosomen zu blockieren. Andere indirekte Ansätze AT 1a R l zu bestimmen ,ocalization in Lysosomen wurden verwendet Bafilomycin, einen lysosomalen Inhibitor AT 1a R Anwesenheit in Lysosomen 3, 4, 5, 6, 7, 8 zu schließen.
Bildgebung lebender Zellen vermeidet mögliche Auswirkungen der Fixierung auf das Zellvolumen und Verlust / Dimmen / Umverteilung von GFP-chimären Rezeptors. Frühere Studien haben auf fixierten Zellen verlassen Kolokalisation oder Co-Auftreten des Rezeptors mit Lysosomen oder unter Verwendung von lebenden Zellen mit Rezeptorbindungs Surrogate wie β-Arrestin – 1, 2, 3, 4, 5, 6 markiert zu bestimmen. Abbildung lebender Zellen von anderen GPCRs mit Kreiselscheibenapplikators konfokalen oder Laserpunktabtastung confOcal Mikroskope mit GaAsP oder HYD Detektoren aktiviert Ermittler die Internalisierung und den Handel von Rezeptoren in einzelnen Zellen in z-Stacks bei 30 s Intervallen 9, 10 abgebildet zu beobachten. Jedoch selbst wenn Lebendzell z-Stapel schnell gesammelt werden, die Analyse nur innerhalb jedes Stapels nach der Auswahl einer einzigen Ebene auftritt, dh in 2D 10. Während dies für die Untersuchung der internalisierten GPCR oder Tyrosin – Kinase – Rezeptor in Frage ausreichend sein, akkumuliert die AT 1a Rs in Vesikeln , die Größe und die Position mit der Zeit ändern und somit von Natur aus schwieriger zu ausreichend zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung eines repräsentativen Einzelschicht abzutasten. Um gründlich die Strecke von der AT 1a R durch die Zelle markiert bestimmen und jede Subpopulation von Vesikeln in Größe und Position unterschiedlich zu erkennen, haben wir ein Verfahren zur 3D – Bildgebung und 3D – Analyse entwickelt , um diese Änderungen zu verfolgen und zu sein in Verbindung mit der Kennzeichnung von verschiedenen intrazellulären Kompartimenten, wie beispielsweise Lysosomen verwendet.
Die Ermittler können dieses Protokoll für Live-Cell – Imaging verwenden , um direkt die Bewegung der AT 1a R in die Zelle und ihre Übertragung auf subzellulärer Kompartimente folgende Ang II Stimulation zu visualisieren. Subzellulärer Kompartimente sind mit fluoreszierenden Protein-Chimären oder anderen fluoreszierenden Markern markiert. Dieses Protokoll kann auch als ein erster Ansatz verwendet werden Rezeptoren in subzellulären Organellen mit einer Auflösung von mindestens 200 nm, um zu lokalisieren, im Vergleich zu Wildtyp-Rezeptoren mutiert zu vergleichen oder Veränderungen nach pharmakologischen Behandlungen zu erkennen. Die Technik ist zugänglich, da es für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet auf jedem konfokalen Mikroskop durchgeführt werden kann. Die relative Leichtigkeit dieses Ansatzes im Gegensatz zu ihr Fachwissen und Ausrüstung zur Durchführung von FRET / FLIM / BRET Techniken benötigt , die 6 molekularen Wechselwirkungen erkennen,"xref"> 11. Diese Messungen definieren Protein-Protein-Wechselwirkungen mit hoher Auflösung (~ 10 nm) und Lokalisierung innerhalb subzellulärer Organellen geschlossen wird. Diese fortgeschrittenen Techniken werden verwendet , um zu verfolgen und weiter zu definieren molekularen Wechselwirkungen von Interesse, anstatt die Passage von Rezeptoren durch subzellulärer Kompartimente, und sie direkt von Protein-Protein – Interaktionen zu bestimmten Zeiten und Orte innerhalb der Zelle 11 zu demonstrieren. FLIM, eine FRET-Technik unabhängig von Akzeptorkonzentration, wird am häufigsten auf festen Proben durchgeführt, da die Bildaufnahme ist langsamer. Im Gegensatz dazu stellt Verhältnis FRET schnelle Bildgebung und hoher Auflösung Kolokalisation von interagierenden Proteinen. Der Nachteil Verhältnis FRET ist , dass Bildgebung Weitfeld- Epi-Fluoreszenz nutzt Bildgebungsgeschwindigkeit zu gewinnen und die gesamte Zelle zu schließen, was zu einer geringeren Auflösung und Kontrast von Organellen 12. Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) ist ein weitererfortgeschrittene Technik, die GPCRs angewendet wurde 11 die Erfassung molekularer Nähe über der Zeit zu messen. Bei dieser Technik ist ein Protein Fluorophor molekular geteilt und jede Hälfte auf einen von zwei Proteine in Frage verknüpft. Wenn die beiden Proteine von Interesse binden einander die Teile des chimären Tag wieder zusammenbauen Fluoreszenz und die erhöhte Fluoreszenz über die Zeit quantifiziert zu erwerben.
Hier präsentieren wir eine einfache Technik für Live-Cell – Imaging in Verbindung mit Bild Quantifizierung Handel von AT 1a R zu studieren in der Zelle auf Ang II Stimulation und der möglichen Änderung der Lieferung von internalisierten AT 1a R zu Lysosomen folgende Ang II – Stimulation. Die ultimative Anwendung für diese Technik ist es, Unterschiede in der Membranhandel Vergleich Wildtyp zu charakterisieren und mutierten Rezeptoren. Diese Unterschiede werden dazu beitragen , den Mechanismus (n) , die Auswirkungen physiologischen Aktivitäten von AT 1a R leadi zu identifizierenng der Regulierung des Blutdrucks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorversuche hier vorgestellten zeigt , dass über einen ziemlich kurzen zeitlichen Verlauf von 24 min, keine nennenswerte Veränderung der Lieferung von AT 1a R-GFP zu den Lysosomen aufgetreten. Im allgemeinen Lieferung von internalisierten Rezeptoren Lysosomen könnte bereits 15-20 Minuten auftreten. Dieses Experiment ist in Einklang mit der Hypothese , dass der Großteil der AT R 1a internalisierte zu groß, perinukleären Endosomen ausgerichtet ist. Hinweise darauf , dass zumindest einige AT <su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschungsarbeiten in diesem Manuskript präsentiert wurde von Grant R01 HL121456-01A1 Kathryn Sandberg unterstützt. Diese Arbeit wurde zusätzlich durch die Verfügbarkeit eines Leica SP8 AOBS in der Mikroskopie und Imaging Shared Resource (MISR) an der Georgetown University Medical Center unterstützt, die zum Teil von P30-CA051008 von den National Institutes of Health der Vereinigten Staaten von Amerika finanziert wird. Wir danken SP8 Imaging-Unterstützung Leica von Peter Johnson, und die Verwendung des Zeiss LSM880 im Labor von Thomas Coate, Institut für Biologie an der Georgetown University mit Hilfe Bildgebung durch Alma Arnold von Carl Zeiss Mikroskopie LLC zur Verfügung gestellt. Der Inhalt in diesem Manuskript ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Riferimenti
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