共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞におけるアンジオテンシン受容体1a型の人身売買のライブセルイメージングと3D解析
Summary
ここでは、アンジオテンシンII治療によって開始エンドサイトーシスの間に緑色蛍光タンパク質タグ付きアンジオテンシン1a型受容体を発現画像セルにプロトコルを提示します。この技術は、第二の蛍光マーカーで標識リソソームを含み、その後時間をかけて立体的に受容体とリソソームの共局在を分析するためのソフトウェアを利用します。
Abstract
生細胞イメージングを同時にアンギオテンシンII（アンギオテンシンII）による刺激後のトランスフェクトされたヒト胚性腎臓293（HEK）細胞においてアンジオテンシン1A型（1aが R AT）受容体及び細胞内区画のタイムラプス画像を捕捉するために使用されます。 HEK細胞を一過性増強緑色蛍光タンパク質（EGFP）でタグ付け1aが R AT含有するプラスミドDNAでトランスフェクトされます。リソソームは、赤色蛍光色素で識別されます。生細胞の画像は、アンギオテンシンII刺激後のレーザー走査型共焦点顕微鏡で捕捉され、経時的三次元（3D、ボクセル）のソフトウェアによって分析されます。ライブセルイメージングは、受容体輸送の調査を可能にし、固定に関連した交絡を回避し、特に、EGFPタグ付き膜受容体の損失や人為的な変位。個々のセルは、時間を通して追跡されるようにこのように、受容体の細胞内局在を撮像し、測定することができます。画像はsufficientlを取得する必要がありますyが急速に急速な小胞の動きをキャプチャします。しかし、高速撮像速度で、収集された光子の数が減少します。妥協はまた、撮像速度を得るためにボクセルサイズなどの撮影パラメータの選択を行わなければなりません。ライブセルイメージングの重要な用途は、タンパク質輸送、移動、増殖、細胞周期、アポトーシス、オートファジーおよびタンパク質 – タンパク質相互作用とダイナミクスを研究するために名前を付けることが、いくつかあります。
Introduction
全体的な目標は、受容体アゴニストで処理した後、特定の細胞内小器官で、時間と受容体の共局在の空間で定量的な証拠を得ることです。したがって、ここでの当面の目標は、タイムラプス共焦点リソソームの画像およびトランスフェクション後のヒト胚性腎細胞（HEK）における受容体の膜貫通を捕捉するために、続いて定量的に、受容体の送達を測定するために3次元の撮像データを集めて分析することですリソソーム。膜貫通型受容体は、生理学的および病態生理学的条件の下で規制されてどのように判断するのに役立つ受容体リガンドによって活性化されると、エンドサイトーシス中のリソソームまたは他の細胞小器官を有する膜貫通受容体の同時輸送を調査します。
図1aのRは、RECの大部分が1主HEK293、モデル細胞系でのAng IIで処理した後、リソソーム内で分解されると推定されますリガンド、アンギオテンシンIIの大部分はリソソーム2、3、4、5で分解され、一方eptorsは、主に原形質膜に後で再利用するための多リサイクルエンドソームに局在します。より最近では、Li ら。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）およびLAMP1で蛍光寿命イメージング顕微鏡（〜10ナノメートルスケール）（FLIM）技術AT 1aが Rの共局在化、受容体の少なくとも一部をを標的と分解されることを示唆しているリソソーム膜タンパク質を用いて実証リソソーム6によります。これらの著者は、リソソーム阻害剤クロロキンは、クロロキンの効果がリソソームと後期エンドソームまたはオートファゴソームの融合をブロックすることであることを示唆している以前の報告と一致している図1a R-LAMP1協会でブロックと指摘しました。他の間接的なアプローチは、 図1aの R Lに決定しますリソソームにおけるocalizationはリソソーム3（a）の Rの存在AT推論するバフィロマイシン、リソソーム阻害剤、4、5、6、7、8を利用しています。
ライブセルイメージングは、細胞体積、およびGFP-キメラ受容体の損失/調光/再分配上の固定の潜在的な影響を回避することができます。以前の研究は、共局在またはリソソームまたは例えば受容体結合代用物で標識された生細胞を用いた受容体の共起を決定するために、固定した細胞に依存してきたβアレスチン1、2、3、4、5、6。スピニングディスク共焦点またはレーザーポイント走査のconfの使用と他のGPCRのライブセルイメージングGaAsPまたはHYDの検出器を搭載したOCAL顕微鏡は、30秒間隔9、10でのzスタックで撮像された個々の細胞内の受容体の内在化および輸送を観察する研究者を可能にしました。生細胞のzスタックが急速に収集された場合でもしかし、分析は2Dのみ10で、すなわち各スタック内の単一平面の選択後に発生する可能性があります。これが問題の内在化GPCRまたはチロシンキナーゼ受容体を研究するために十分かもしれませんが、AT 1aのRsは時間をかけてサイズと位置を変更するため、本質的に十分に各時点での代表的な単一のスライスを使用して、サンプルがより困難である小胞に蓄積します。十分にこれらの変更を追跡することとなるように細胞を介し1aが Rで標識し、サイズおよび位置の異なる小胞の各亜集団を検出するために、我々は、3Dイメージングのための方法を考案した3次元解析の経路を決定します例えば、リソソームなど種々の細胞内区画の標識と組み合わせて使用します。
調べでは、直接細胞およびAng II刺激後の細胞内区画への転送にAT 1aが Rの動きを可視化するために生細胞イメージングのために、このプロトコルを使用することができます。細胞内コンパートメントは、蛍光タンパク質キメラまたは他の蛍光マーカーでタグ付けされています。このプロトコルはまた、野生型受容体に対する変異したまたは薬理学的治療を次の変化を検出するために比較するために、200nmの最小分解能と細胞内小器官における受容体を局在化するための最初のアプローチとして使用することができます。それは、生細胞イメージングのために備えたすべての共焦点顕微鏡上で実施することができるので、技術がアクセス可能です。このアプローチの相対的な容易さは、増加した専門知識と分子間相互作用6を検出FRET / FLIM / BRET技術を実行するために必要な機器とは対照的"外部参照"> 11。これらの測定は、高解像度（〜10 nm）におけるタンパク質 – タンパク質相互作用を定義し、細胞内小器官内局在が推測されます。これらのより高度な技術がフォローアップし、さらに細胞内区画を介して分子の関心の相互作用ではなく、受容体の通過を定義し、それらが直接セル11内の特定の時間と場所でのタンパク質-タンパク質相互作用を実証するために使用されています。画像取得が遅いためFLIM、アクセプタ濃度の独立したFRET技術は、最も頻繁に固定された試料に対して行われます。これとは対照的に、比FRETは、迅速なイメージングと相互作用するタンパク質の高解像度の共局在化を提供します。比FRETの欠点は、撮像画像形成速度を得るため、および低減された解像度及びオルガネラ12のコントラストが得られ、セル全体を含むように広視野落射蛍光を利用しています。生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）は、別であります時間11以上の分子の近接の取得を測定するためのGPCRに適用されている高度な技術。この技術において、タンパク質のフルオロフォアは、分子的に分割され、それぞれが半当該2つのタンパク質の一方に連結されました。ときに関心のバインドの2つのタンパク質が互いに、キメラのタグの部分は、蛍光と時間をかけて定量増加した蛍光を取得するために再組み立て。
ここでは、アンギオテンシンIIの刺激およびAng II刺激後リソソームに1aが R AT内在化の配信の電位変化時にセル内のAT 1aが Rの人身売買を研究するために、画像の定量化と相まって生細胞イメージングのための簡単な方法を提示します。この技術のための究極の使用は、野生型および変異受容体を比較する膜輸送の違いを特徴づけることです。これらの違いは、それがleadi AT 1aが Rの生理活性に影響を与えるメカニズムを同定するのに役立ちます血圧の調節にngの。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する予備実験は、24分のかなり短い時間経過にわたって、リソソームへのAT 1aのR-GFPの配信には明らかな変化が発生していないことを示しています。一般的に、リソソームへの内在化受容体の送達は、早くも15〜20分として発生する可能性があります。この実験は、 図1aの R AT内在化の大部分が大きい、核周囲エンドソームに標的化されるという仮説と一致しています…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿で提示の研究活動は、キャスリン・サンドバーグへの助成金R01 HL121456-01A1によってサポートされていました。この作品は、部分的に、米国の国立衛生研究所からP30-CA051008によって資金を供給されているジョージタウン大学メディカルセンターの顕微鏡およびイメージング共有リソース（MISR）でライカSP8 AOBSの利用による加算でサポートされていました。私たちは感謝ライカSP8イメージングピーター・ジョンソン案内、カールツァイス顕微鏡LLCのアルマ・アーノルドによって提供されるイメージング支援とジョージタウン大学のトーマスCoate、生物学科の研究室でツァイスLSM880の使用を認めます。この原稿の内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Riferimenti
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