הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.
Abstract
הדמית תא חי משמשת ללכידה זמנית זמן לשגות תמונות של קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין (AT R 1a) ותאים תאיים בכליה-293 עובריים אנושיים טרנספקציה (HEK) תאים בעקבות גירוי עם אנגיוטנסין II (אנג שנייה). תאי HEK הם transfected זמני עם ה- DNA פלסמיד המכיל AT R 1a מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP). ליזוזומים מזוהים עם פלורסנט לצבוע אדום. תמונות Live- תא נלכדות על מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר לאחר גירוי אנג השני ונותחו על ידי תוכנה בשלושה ממדים (3D, ווקסלים) לאורך זמן. Live- תא הדמיה מאפשרת חקירות סחר הקולט ונמנעה בלבול הקשורים קיבעון, ובפרט, האובדן או עקירת artefactual של קולטני קרום מתויג EGFP. לפיכך, כתאים בודדים מתבצעים מעקב לאורך זמן, לוקליזציה subcellular של קולטנים ניתן הדמיה ומדודה. התמונות חייבות להירכש sufficiently במהירות ללכוד תנועת שלפוחית מהירה. עם זאת, במהירויות הדמיה מהר, מספר הפוטונים שנאספו מצטמצם. הפשרות חייבות להתבצע גם בבחירת פרמטרי הדמיה כמו גודל voxel כדי לצבור מהירות הדמיה. יישומים משמעותיים של דימות תאים חיים הם ללמוד סחר חלבון, הגירה, שגשוג, מחזור התא, אפופטוזיס, autophagy ואינטראקציה בין חלבונים ודינמיקה, אם למנות רק כמה.
Introduction
המטרה הכללית היא להשיג ראיות כמותית בזמן ובמרחב של colocalization קולטן עם אברונים subcellular ספציפיים לאחר הטיפול עם אגוניסט לקולטן. לפיכך, המטרה המיידית כאן היא ללכוד תמונות confocal זמן לשגות של lysosomes ו הטרנסממברני פורש קולטן בתאי כליה עובריים אנושיים (HEK) בעקבות transfection וכדי מכן להרכיב ולנתח את הנתונים הדמיה 3D למדוד את המסירה של קולטן כמותית כדי lysosomes. חקירת הסחר סימולטני של קולטן הטרנסממברני עם lysosomes או אברונים אחרים בזמן אנדוציטוזה כאשר מופעל על ידי ליגנד רצפטור יכול לעזור לקבוע כיצד קולטן הטרנסממברני מוסדר בתנאים פיזיולוגיים pathophysiological.
R AT 1a המשוער הוא מושפל lysosomes לאחר טיפול עם אנג II במערכות תאים מודל, בעיקר HEK293 1 למרות שרוב receptors הם נקודות בעיקר endosomes מחזור multivesicular למחזור מאוחר קרום הפלזמה בעוד חלק הארי של ליגנד, אנג השנייה, נפגע ליזוזום 2, 3, 4, 5. לאחרונה, Li et al. הפגינו באמצעות תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) מיקרוסקופיה הדמיה החיים הקרינה (FLIM) טכניקות 1a AT colocalizes R (על סולם ~ 10 ננומטר) עם LAMP1, חלבון הממברנה ליזוזומלית מכאן שלפחות חלק הקולטן מיועד והשפילו על ידי lysosomes 6. מחברים אלו ציינו כי chloroquine ליזוזומלית מעכב חסומה העמותה R-LAMP1 1a אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים טוען כי השפעה של chloroquine היא לחסום היתוך של endosomes מאוחר או autophagosomes עם lysosomes. גישות עקיפות אחרות כדי לקבוע AT l 1a Rocalization ב lysosomes ניצלו bafilomycin, מעכב ליזוזומלית להסיק הימצאות R 1a ב lysosomes 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Live- תא הדמיה תמנע השפעות אפשריות של קיבעון על נפח תא, ואובדן / עמעום / חלוק מחדש של קולטן ה- GFP-chimeric. מחקרים קודמים יש לסמוך על תאים קבוע כדי לקבוע colocalization או שיתוף התרחשות של הקולטן עם lysosomes או באמצעות תאים חיים שכותרתו עם פונדקאיות מחייב לקולטן כגון 1 β-arrestin, 2, 3, 4, 5, 6. הדמיה של תא חי GPCRs האחר באמצעות confocal ספינינג דיסק או conf סריקת נקודת ליזרמיקרוסקופי ocal מצוידים גלאי Gaasp או HYD אפשרו לחוקרים לבחון את ההפנמה וסחר של קולטנים בתאים בודדים צלמו ערימות z ב 30 שניות במרווחים 9, 10. עם זאת, גם כאשר Z- ערימות תא חיים נאספות במהירות, ניתוח עלול להתרחש רק לאחר הבחירה של מטוס בודד בתוך כל ערימה, כלומר ב 2D 10. אמנם זה עשוי להיות מספיק ללימוד קולטן קינאז GPCR או טירוזין הפנים נדון, Rs 1a AT מצטבר שלפוחית משני גודל ומיקום לאורך זמן וכך הם מטבעם יותר קשים לדגום כראוי באמצעות פרוסה אחת נציג בכל נקודת זמן. כדי לקבוע את התוואי באופן יסודי של שכותרתו AT R 1a דרך התא וכדי לזהות כל תת-אוכלוסייה של השלפוחית השונה בהיקפו, עמדה, אנו פתחנו שיטת הדמית 3D וניתוח 3D כדי לעקוב אחר שינויים אלה להיות הפועל בשיתוף עם תיוג של תאים שונים תאיים כגון lysosomes.
חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה עבור דימות תאי חיים כדי להמחיש את התנועה ישירות של R 1a AT לתוך התא והעברתו תאי subcellular בעקבות גירוי אנג השני. תאי subcellular מתויגים עם מפלצות חלבון פלואורסצנטי או סמני ניאון אחרים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם גישה ראשונה למקם קולטנים אברונים subcellular עם רזולוציה מינימאלית של 200 ננומטר על מנת להשוות מוטציה לעומת קולטנים wild-type או כדי לזהות שינויים בעקבות טיפוליים תרופתי. הטכניקה נגישה שכן הוא יכול להתבצע על כל מיקרוסקופ confocal מצויד הדמית תא חי. הקלות היחסית של גישה זו עומדת בניגוד מומחיות מוגברת הציוד הדרוש כדי לבצע סריג / FLIM / טכניקות ברט אשר לזהות אינטראקציות מולקולריות 6,"Xref"> 11. מדידות אלה מגדירים אינטראקציות בין חלבונים ברזולוציה גבוהה (~ 10 ננומטר) ולוקליזציה בתוך אברונים subcellular הוא להסיק. טכניקות מתקדמות יותר אלה משמשות כדי לבצע מעקב להגדיר טוב יותר אינטראקציות מולקולריות של עניין, במקום חלוף קולטנים באמצעות תאי subcellular, והם ישירות להפגין אינטראקציות חלבון-חלבון בזמנים מסוימים ומקומות בתוך התא 11. FLIM, טכניקת סריג עצמאית של ריכוז acceptor, מתבצע לרוב על מדגמים קבועים מאז רכישת תמונה היא איטית יותר. לעומת זאת, סריג יחס מספק הדמיה מהירה colocalization ברזולוציה גבוהה של חלבונים אינטראקציה. החסרון של סריג יחס הוא הדמיה אשר מנצלת קרינת EPI widefield כדי לצבור מהירות הדמיה לכלול את התא כולו, וכתוצאה מכך ברזולוציה מופחתת וחדות של אברונים 12. העברת אנרגית תהודת פליטת אור (ברט) היא עודטכניקה מתקדמת כי יושם GPCRs למדוד את רכישת הקרבה מולקולרית לאורך זמן 11. בטכניקה זו fluorophore חלבון מחולקת מולקולרית וכל חצי צמוד לאחד שני חלבונים מדוברים. כאשר שני החלבונים מלווים במסר עניין אחד את השני, את החלקים של התג כימרי להרכיב מחדש לרכוש קרינה ואת הקרינה גדלה לכמת לאורך זמן.
כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה עבור דימות תאי חיים יחד עם כימות תמונה ללמוד סחר R 1a AT בתא על גירוי אנג שני והשינוי פוטנציאל במסיירת הפנים AT R 1a כדי lysosomes בעקבות גירוי אנג שני. השימוש האולטימטיבי עבור טכניקה זו היא לאפיין הבדלים בסחר קרום השוואת סוג בר קולטנים מוטציה. הבדלים אלה יסייעו לזהות את המנגנון (ים) שפעת שפעילויות פיסיולוגיות של R 1a AT leading כדי ויסות לחץ הדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניסויים ראשוניים שהוצגו כאן להמחיש כי על קורס זמן קצר למדי של 24 דקות, שום שינוי ניכר במסירת 1a AT R-GFP אל lysosomes התרחש. באופן כללי, משלוח של קולטנים הפנימו כדי lysosomes יכול להתרחש מוקדם ככל 15-20 דקות. ניסוי זה עולה בקנה אחד עם ההשערה כי חלק הארי של הפנים AT R 1a מיועד …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודת המחקר שהוצגה בכתב היד הזה נתמכה על ידי מענק R01 HL121456-01A1 קתרין זנדברג. עבודה זו נתמכה בנוסף לפי הזמינות של לייקה SP8 AOBS ב מיקרוסקופית והדמיה משותף משאבים (מצר) במרכז הרפואי של אוניברסיטת ג'ורג'טאון הממומן חלקית על ידי P30-CA051008 מן המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית של אמריקה. אנו בתודה להכיר סיוע הדמיה Leica SP8 ידי פיטר ג'ונסון, והשימוש של Zeiss LSM880 במעבדה של תומס Coate, החוג לביולוגיה באוניברסיטת ג'ורג'טאון עם סיוע הדמיה מסופק על ידי אלמה ארנולד של Carl Zeiss מיקרוסקופית LLC. התוכן בכתב היד הזה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Riferimenti
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
