Qui vi presentiamo un protocollo per celle di immagine che esprimono fluorescenti tipo angiotensina recettori 1a proteina-tag verde durante endocitosi avviate dal trattamento angiotensina II. Questa tecnica comprende lisosomi etichettatura con un secondo marcatore fluorescente, e quindi utilizzando software per analizzare la co-localizzazione di recettori e lisosomi in tre dimensioni nel tempo.
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Articolo metodologico
Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell'angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Live-cell imaging è usata per acquisire contemporaneamente time-lapse immagini di recettori di tipo angiotensina 1a (AT 1a R) e compartimenti intracellulari in cellule embrionali umane del rene trasfettate-293 (HEK) dopo stimolazione con angiotensina II (Ang II). Cellule HEK sono transitoriamente trasfettate con il DNA plasmide contenente AT 1a R contrassegnate con maggiore proteina fluorescente verde (EGFP). Lisosomi sono identificati con un colorante fluorescente rosso. Le immagini in diretta delle cellule vengono catturati su una scansione laser microscopio confocale dopo stimolazione Ang II e analizzati dal software in tre dimensioni (3D, voxel) nel corso del tempo. live-cell imaging consente indagini traffico recettore ed evita confonde associati con fissaggio, in particolare, la perdita o spostamento artefatti di recettori di membrana EGFP-tag. Così, come singole cellule sono tracciati nel tempo, la localizzazione subcellulare dei recettori può essere ripreso e misurato. Le immagini devono essere acquisite sufficiently rapidamente per catturare il movimento delle vescicole rapida. Tuttavia, a velocità di imaging più veloce, il numero di fotoni raccolti è ridotta. Compromessi devono essere effettuate anche nella selezione dei parametri di imaging come la dimensione voxel per ottenere velocità di esposizione. applicazioni significative di live-cell imaging sono di studiare il traffico di proteine, la migrazione, la proliferazione, ciclo cellulare, apoptosi, l'interazione autofagia e proteina-proteina e dinamiche, per citarne solo alcuni.
Introduzione
L'obiettivo generale è quello di ottenere dati quantitativi nel tempo e nello spazio dei recettori colocalizzazione con specifici organelli subcellulari dopo il trattamento con un agonista del recettore. Così, l'obiettivo immediato è quello di catturare time-lapse immagini confocale di lisosomi e un transmembrana spanning recettore in cellule renali embrionali umane (HEK) dopo trasfezione e da montare successivamente e analizzare i dati di imaging in 3D per misurare quantitativamente la consegna del recettore lisosomi. Indagare il traffico simultaneo di un recettore transmembrana con i lisosomi o altri organelli durante endocitosi quando attivato dal recettor....
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Protocollo
Giorno uno
1. cellulare Semina
- Preparare completa di Dulbecco modificato (DMEM). Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml di L-glutammina a 450 ml di DMEM per ottenere 500 ml di DMEM completo addizionato con siero fetale bovino (10%), penicillina / streptomicina (1%) e L-glutammina (1%).
- umane embrionali renali (HEK), le cellule di semi, numero passaggio 6-11 a 50.000 / bene in un sistema di 8 coprioggetti ben camerata in DMEM completo.
- Mantenere il vetrino a camera a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 24 h.
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Risultati
In questo insieme rappresentativo di esperimenti, cellule HEK sono state trasfettate con il recettore dell'angiotensina di tipo 1a (AT 1a R-GFP) costruire (E1,2,3-AT 1a R) clonato nel plasmide pEGFP-N2 13. Time-lapse immagini di HEK sono stati acquisiti e giocato come un film (Vedi Cellulare Imaging 1 e imaging cellulare dal vivo 2 film). I filmati e le immagini fisse mostrano che dopo stimolazione ligand.......
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Discussione
Esperimenti preliminari qui presentati mostrano che nel corso di un piuttosto breve corso di tempo di 24 min, senza modificare sensibilmente la consegna di AT 1a R-GFP ai lisosomi si è verificato. In generale, la consegna dei recettori internalizzati ai lisosomi potrebbe verificarsi già 15-20 min. Questo esperimento è coerente con l'ipotesi che la maggior parte del interiorizzato a 1A R si rivolge a grandi, endosomi perinucleari. La prova che almeno alcuni AT 1a R arriva in lisosomi .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Il lavoro di ricerca presentato in questo manoscritto è stato sostenuto dalla concessione R01 HL121456-01A1 a Kathryn Sandberg. Questo lavoro è stato sostenuto in aggiunta dalla disponibilità di una Leica SP8 AOBS in microscopia e di imaging di risorse condivise (MISR) presso la Georgetown University Medical Center, che è parzialmente finanziato da P30-CA051008 dal National Institutes of Health degli Stati Uniti d'America. Noi riconosciamo con gratitudine Leica assistenza di imaging SP8 da Peter Johnson, e l'uso della Zeiss LSM880 nel laboratorio di Thomas Coate, Dipartimento di Biologia presso la Georgetown University con l'assistenza di imaging fornita ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Angiotensina II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | caldo in 37 ° grado C bagnomaria prima dell'uso |
| Penicillina Streptomicina (Pen Streptomic) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Rene embrionale umano (HEK)-293 cellule | Collezione di colture di tipo americano (ATCC) | CRL-1573 | Passaggio numero 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II camerato 1.5 Sistema tedesco Coverglass | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store a 4 ° C |
| Opti-MEM, Siero Ridotto Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima |
| dell'uso Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| LysoTracker Red DND-99 | sonde molecolari -ThermoFisher Scientific | L7528 | Conservare aliquote al buio a -20 ° C . |
| 6.3 Software di analisi delle immagini | PerkinElmer | Moduli di visualizzazione e quantificazione | Per l'analisi 3D delle immagini di stack di immagini |
| Leica SP8 AOBS Microscopio | confocale a scansione laser | Leica Microsystems | Per la raccolta |
| di immagini Zeiss LSM 880 | Microscopio confocale a scansione laser | Carl Zeiss Per la raccolta di | immagini |
Riferimenti
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K.
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Ristampe e permessi
