Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal
Summary
Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes de células que expresan receptores de proteína verde fluorescente con etiquetas de tipo 1a angiotensina durante la endocitosis iniciados por el tratamiento de la angiotensina II. Esta técnica incluye los lisosomas de etiquetado con un segundo marcador fluorescente, y luego utilizando software para analizar la co-localización de receptor y lisosoma en tres dimensiones con el tiempo.
Abstract
Imágenes de células vivas se utiliza para capturar simultáneamente imágenes con lapso de tiempo de los receptores de angiotensina de tipo 1a (AT 1a R) y los compartimentos intracelulares en células embrionarias humanas transfectadas de riñón 293 (HEK) después de la estimulación con angiotensina II (Ang II). Células HEK se transfectaron transitoriamente con ADN de plásmido que contiene a 1 A R etiquetado con la proteína verde fluorescente (EGFP). Los lisosomas se identifican con un colorante fluorescente rojo. imágenes de células vivas son capturados en un microscopio confocal de barrido con láser después de la estimulación Ang II y se analizaron por software en tres dimensiones (3D, voxels) con el tiempo. imágenes de células vivas permite investigaciones sobre el tráfico del receptor y evita confusiones asociados a la fijación, y, en particular, la pérdida o el desplazamiento artefactual de los receptores de membrana EGFP-etiquetados. Por lo tanto, como células individuales se realiza un seguimiento a través del tiempo, la localización subcelular de los receptores se pueden obtener imágenes y medido. Las imágenes deben ser adquiridos sufficiently rápidamente para capturar el movimiento de vesículas rápida. Sin embargo, a velocidades de formación de imágenes más rápidas, se reduce el número de fotones recogidos. Los compromisos también se deben hacer en la selección de parámetros de imagen como el tamaño de vóxel con el fin de ganar velocidad de formación de imágenes. aplicaciones significativas de imágenes de células vivas son estudiar el tráfico de proteínas, migración, proliferación, ciclo celular, apoptosis, autofagia y la interacción proteína-proteína y la dinámica, por nombrar sólo unos pocos.
Introduction
El objetivo general es obtener evidencia cuantitativa en tiempo y espacio de la colocalización del receptor con orgánulos subcelulares específicos después del tratamiento con un agonista del receptor. Por lo tanto, el objetivo inmediato aquí es capturar de lapso de tiempo imágenes confocales de lisosomas y un transmembrana del receptor en células de riñón embrionario humano (HEK) después de la transfección y de montar y analizar posteriormente los datos de imágenes en 3D para medir cuantitativamente la entrega de receptor a lisosomas. Investigando el tráfico simultáneo de un receptor transmembrana con los lisosomas u otros orgánulos durante la endocitosis cuando son activados por ligando del receptor puede ayudar a determinar cómo el receptor transmembrana está regulado bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.
AT 1a R se presume que está degradado en lisosomas después del tratamiento con Ang II en los sistemas de células modelo, principalmente HEK293 1 aunque la mayoría de receptors se localizan principalmente en los endosomas de reciclaje multivesiculares de reciclado más tarde a la membrana plasmática, mientras que la mayor parte del ligando, Ang II, se degrada en el lisosoma 2, 3, 4, 5. Más recientemente, Li et al. demostrado usando transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y la fluorescencia de imágenes de microscopía de por vida (FLIM) técnicas que colocalizes AT 1a R (en ~ 10 nm escala) con LAMP1, una proteína de membrana lisosomal lo que sugiere que al menos parte del receptor se dirige a y degradado por lisosomas 6. Estos autores observaron que la cloroquina inhibidor lisosomal bloqueado en 1a asociación R-LAMP1 que es consistente con informes previos que sugieren que un efecto de la cloroquina es bloquear la fusión de endosomas tardíos o autofagosomas con lisosomas. Otros enfoques indirectos para determinar en 1a R localization en los lisosomas han utilizado bafilomicina, un inhibidor lisosomal para inferir AT 1a presencia R en los lisosomas 3, 4, 5, 6, 7, 8.
imágenes de células vivas evita posibles efectos de la fijación en el volumen celular, y la pérdida / atenuación / redistribución de los receptores-GFP quimérico. Estudios previos se han basado en células fijadas para determinar la colocalización o co-ocurrencia del receptor con los lisosomas o el uso de células vivas marcadas con sustitutos de unión a receptores tales como β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. imágenes de células vivas de otros GPCRs utilizando confocal de disco giratorio o láser conf punto de exploraciónmicroscopios vecinales equipados con detectores de Gaasp o HYD permitido a los investigadores observar la internalización y el tráfico de receptores en las células individuales fotografiados en z-pilas en intervalos de 30 segundos 9, 10. Sin embargo, incluso cuando las células vivas z-pilas se recogen rápidamente, análisis sólo puede ocurrir después de la selección de un solo plano dentro de cada pila, es decir, en 2D 10. Si bien esto puede ser suficiente para el estudio del GPCR o de la tirosina quinasa del receptor interiorizado de que se trate, las R 1a AT acumula en vesículas que cambian de tamaño y la posición en el tiempo y por lo tanto son inherentemente más difíciles de muestrear adecuadamente usando una rebanada solo representante en cada momento. Para determinar a fondo la ruta del marcado en 1a R a través de la célula y para detectar cada una subpoblación de vesículas que difieren en tamaño y posición, hemos ideado un método para obtener imágenes en 3D y análisis 3D para realizar un seguimiento de estos cambios y para ser se utiliza junto con el etiquetado de diferentes compartimentos intracelulares tales como lisosomas.
Los investigadores pueden utilizar este protocolo para imágenes de células vivas para visualizar directamente el movimiento de AT 1a R en la célula y su transferencia a compartimentos subcelulares después de la estimulación de Ang II. compartimentos subcelulares etiquetados con quimeras de proteínas fluorescentes u otros marcadores fluorescentes. Este protocolo también se puede usar como una primera aproximación para localizar receptores en orgánulos subcelulares con una resolución mínima de 200 nm a fin de comparar mutado en comparación con los receptores de tipo salvaje o para detectar cambios siguientes tratamientos farmacológicos. La técnica es accesible ya que puede llevarse a cabo en cualquier microscopio confocal equipado para imágenes de células vivas. La facilidad relativa de este enfoque contrasta con el aumento de la experiencia y el equipo necesario para llevar a cabo técnicas de FRET Flim / / BRET que detectan interacciones moleculares 6,"xref"> 11. Estas mediciones definen interacciones proteína-proteína en alta resolución (~ 10 nm) y la localización dentro de orgánulos subcelulares se infiere. Estas técnicas más avanzadas se utilizan para el seguimiento y definir con más precisión las interacciones moleculares de interés, en lugar de la aprobación de los receptores a través de los compartimentos subcelulares, y demuestran directamente las interacciones proteína-proteína en momentos y lugares específicos dentro de la célula 11. Flim, una técnica FRET aceptor independiente de la concentración, se realiza con mayor frecuencia en las muestras fijadas desde la adquisición de imágenes es más lenta. Por el contrario, la relación de FRET proporciona una imagen rápida y colocalización de alta resolución de las proteínas que interactúan. La desventaja de la relación de FRET es que las imágenes de campo amplio utiliza epi-fluorescencia para ganar velocidad de formación de imágenes y para incluir toda la célula, lo que resulta en una reducción de la resolución y el contraste de orgánulos 12. la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) es otrotécnica avanzada que se ha aplicado a GPCR para medir la adquisición de proximidad molecular con el tiempo 11. En esta técnica un fluoróforo proteína se divide molecularmente y cada media vinculada a una de las dos proteínas en cuestión. Cuando las dos proteínas de interés se unen entre sí, las partes de la etiqueta quimérico volver a montar para adquirir la fluorescencia y el aumento de la fluorescencia cuantificada con el tiempo.
A continuación, presentamos una técnica sencilla para imágenes de células vivas junto con la cuantificación de imagen para estudiar el tráfico de AT 1a R en la célula tras la estimulación de Ang II y el cambio potencial en la entrega de internalizado a 1 A R a los lisosomas después de la estimulación de Ang II. El uso final para esta técnica es caracterizar las diferencias en el tráfico de membrana comparativa de tipo salvaje y los receptores mutados. Estas diferencias le ayudará a identificar el mecanismo (s) que afectan las actividades fisiológicas de AT 1a R leading a regulación de la presión arterial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los experimentos preliminares presentados aquí ilustran que durante un transcurso de tiempo bastante corto de 24 min, no se produjo ningún cambio apreciable en la entrega de AT 1a R-GFP a los lisosomas. En general, la entrega de los receptores internalizados a los lisosomas podría ocurrir tan pronto como 15-20 min. Este experimento es consistente con la hipótesis de que la mayor parte de la internalizado AT 1a R está dirigido a los endosomas grandes, perinuclear. La evidencia de que al menos a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo de investigación presentado en este manuscrito fue apoyada por conceder R01 HL121456-01A1 a Kathryn Sandberg. Este trabajo fue apoyado además por la disponibilidad de una Leica SP8 AOBS en el Microscopía e Imagen recurso compartido (MISR) en Georgetown University Medical Center, en parte financiado por P30-CA051008 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de América. Agradecemos la ayuda de imágenes Leica SP8 por Peter Johnson, y el uso de la Zeiss LSM880 en el laboratorio de Thomas Coate, Departamento de Biología de la Universidad de Georgetown, con la ayuda de imágenes proporcionada por Alma Arnold de Carl Zeiss Microscopía LLC. El contenido de este manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Riferimenti
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
