Abstract
De constructieve biologie en de synthetische biologie benadering van het creëren van kunstmatig leven hebben betrekking op de bottom-up assemblage van biologische of niet-biologische materialen. Dergelijke benaderingen hebben veel aandacht gekregen in het onderzoek op de grens tussen levende en niet-levende materie en zijn gebruikt om kunstmatige cellen te bouwen in de afgelopen twee decennia. In het bijzonder, Giant Vesicles (GVS) vaak gebruikt als kunstmatige celmembranen. In dit artikel beschrijven we de voorbereiding van de GVS inkapselen zeer verpakt microbolletjes als een model van cellen met zeer gecondenseerde biomoleculen. De GVS werden bereid door middel van een eenvoudige water-in-olie-emulsie centrifugatiemethode. Specifiek werd een homogenisator gebruikt om een waterige oplossing die het materiaal in te kapselen en een olie die opgelost fosfolipiden emulgeren en de verkregen emulsie werd voorzichtig op het oppervlak van een waterige oplossing gelaagd. Het gelaagde systeem werd vervolgens gecentrifugeerd to het genereren van het GVS. Deze krachtige methode werd gebruikt om materialen van kleine moleculen tot microbolletjes kapselen.
Introduction
De constructieve, of synthetische biologie aanpak is een fascinerende weg voor het verkennen van de grens tussen levende en niet-levende materie. Omdat de cel het minimum vereist apparaat voor het leven zoals we dat nog verscheidene onderzoekers hebben geprobeerd om kunstmatige cellen uit eenvoudige, goed begrepen chemische construct zodat verschijnselen die bij zo'n kunstmatige cellen worden onderzocht, met als uiteindelijk doel het ophelderen de oorsprong van het leven en het bestuderen van de basisfuncties van levende cellen 1, 2, 3. Vooral blaasjes 4, waarbij bolvormige microcompartments van amfifiele moleculen zijn en kunnen biologische moleculen zoals eiwitten 5, 6 en DNA 7, 8, 9 kapselen,lass = "xref"> 10, zijn vaak gebruikt als model van biologische membranen.
Vesicles kunnen worden gekwalificeerd als kleine (gedefinieerd als een diameter van <100 nm), groot (diameter <1 urn) of grote (diameter> 1 pm). Giant blaasjes (GVS) zijn uitgebreid bestudeerd, omdat ze zijn vergelijkbaar met levende cellen in grootte, vorm en structuur. Door de grootte van GVS kunnen morfologische veranderingen in GV membranen gemakkelijk worden waargenomen in real time onder een optische microscoop.
Verschillende werkwijzen voor het bereiden GvS gemeld 11, inclusief de werkwijze hydratatie 12, 13, de vries-dooi methode 14, de werkwijze electroformation 15, 16, en de werkwijze fluïdeapparaat 17, 18. Echter, inkapselen eiwitten en andere Macromolecules in GVS bij hoge concentraties door middel van deze methoden is moeilijk. In het bijzonder is het uiterst moeilijk om biologisch materiaal in voldoende hoeveelheid (20-30 vol%) inkapselen de drukke omgeving in de cellen 19, 20 nabootsen. Vormen GVS direct, Weitz en medewerkers werd een water-in-olie (w / o) emulsie centrifugatiemethode 21, 22. Deze werkwijze heeft vijf belangrijke kenmerken. Ten eerste omdat GVS bereid volgens deze werkwijze hebben een lage lamellarity 23, 24, het membraan zo dun dat ze gemakkelijk kunnen worden vervormd. GV membraan deformatie geïnduceerd door FtsZ (een bacteriële celdeling eiwit), tubuline, en andere macromoleculen is onderzocht 25, 26, 27, 28, en we waarnamen polyhe dron-achtige vervorming van GV membranen geïnduceerd door inkapseling van microsferen 29, 30. Ten tweede kan membraaneiwitten in de vesiculaire membraan door deze werkwijze ingevoegd zij het met moeite 31. Bijvoorbeeld, de Yomo groep gebruikt deze methode om de in vitro synthese en porievormende activiteit van het membraaneiwit α-hemolysine 32 bestuderen. Ten derde is het mogelijk om asymmetrische GVS waarbij de lipide bestanddelen van de binnenste en buitenste blaadjes zijn verschillende 22 genereren. Bijvoorbeeld Whittenton et al. gegenereerde asymmetrische GVS met kationische lipiden in het binnenste leaflet negatief geladen polynucleotiden kapselen en neutrale lipiden op de buitenste laag van toxiciteit en niet-specifieke cellulaire opname 33 verminderen. Ten vierde kan de concentratie en de volumefractie van stoffen in het GVS relatief hoogs = "xref"> 28, 34. Ten vijfde kunnen meerdere soorten materiaal worden ingekapseld 35. Bijvoorbeeld Nishimura et al. ingekapseld een in vitro transcriptie-translatie systeem in GVS en gebruikt het systeem om groen fluorescerend eiwit (GFP) kenbaar te maken binnen het GVS 36. Deze vijf eigenschappen maken w / o-emulsie centrifugeren een onmisbare methode voor het genereren van cel nabootsen GVS.
In eerder werk GVS gegenereerd door centrifugatie werden verzameld door middel van een injectiespuit met een lange 16 G roestvrijstalen naald met een aantal van de uiteindelijke waterige oplossing 22. In de handen van onervaren technici, kan dit inningsmethode gemakkelijk leiden tot verontreiniging van de GV enkele van de olie. In deze studie hebben we de w / o-emulsie centrifugatieprotocol ontwikkeld door Yomo groep 23, 37,waarbij neergeslagen GVS worden verzameld door een gat in de bodem van de centrifugebuis waarin ze bereid geopend. We bereidden GVS inkapselen 1,0 gm microsferen, die in omvang intracellulaire organellen. Het gebruik van microsferen liet ons toe om de concentratie te schatten door het berekenen van het volume fractie. Oprichting van een methode voor de bereiding van GVS in welke materialen dicht zijn verpakt is een belangrijke stap voor het creëren van kunstmatige cellen. Om het nut van onze protocol van verschillende soorten binnenkant materialen bevestigen hebben we aangetoond dat GFP en een kleine wateroplosbaar fluorescent molecuul (uranine) kan worden vastgelegd in het GVS.
Protocol
1. Bereiding van GVS door de W / O emulsie centrifugatiemethode
- Bereid een voorraadoplossing van 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC, 25 mM) en een voorraadoplossing van Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn glycero-3-fosfoethanolamine, triëthylammoniumzout (Texas Red DHPE, 0,20 mM) in chloroform en bewaar de voorraadoplossingen bij -20 ° C.
- Bereid een olieoplossing.
- Vorm een lipide film op het binnenoppervlak van een 5 ml glazen flesje door het verdampen van een mengsel van de DOPC voorraadoplossing (51,0 pl en Texas rood DHPE voorraadoplossing (19,2 ui) onder stromend stikstofgas.
- Incubeer de film onder verminderde druk gedurende de nacht en voeg 1,0 ml vloeibare paraffine (0,86-0,89 g / cm 3) aan het flesje. Wikkel de flacon in aluminiumfolie en incubeer het op 80 ° CO / N in rust. De eindconcentraties van DOPC en Texas rood DHPE zijn 1,3 en 3,8 x 10-3 mMRespectievelijk, en de DOPC: Texas rood DHPE molverhouding 100: 0,3.
- Bereid de binnenste waterige dispersie.
- In 1,5 ml microbuisjes deksel, meng 237,5 ul van een dispersie van 1,0 urn niet-fluorescerende microbolletjes (2,5 vol%) en 12,5 ui van een dispersie van 1,0 urn fluorescente microsferen (2,5 vol%); dit komt overeen met een 95: 5 (v / v) verhouding van niet-fluorescerende fluorescerende microbolletjes.
- Voeg 64 mg sucrose, gevolgd door 125 pl Tris-gebufferde oplossing (TBS, 1 M) en 875 pl gedeïoniseerd water. Het eindvolume fractie van microsferen is 0,5 vol% en de eindconcentraties Tris-HCl (pH 7,5) en sucrose zijn 0,1 en 0,15 M, respectievelijk.
- Vortex de microbuis gedurende 30 seconden en vervolgens ultrasone trillingen het voor 10 min.
- Bereid de buitenste waterige oplossing.
- Na bereiding van 10 ml Tris-gebufferde oplossing (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M glucose) in dezelfde werkwijze als inwendige waterige media plaats 1 ml van de oplossing in een 1,5 ml microbuisjes deksel. Vortex de microbuis gedurende 30 seconden en vervolgens ultrasone trillingen het voor 10 min.
- Bereid een w / o emulsie die microsferen.
- Meng 1 ml van de olie-oplossing (vloeibare paraffine bevattende DOPC en Texas rood DHPE) met 300 ul van de binnenste waterige oplossing in een 1,5 ml microbuisjes.
- Emulgeren de twee componenten in de microbuis met een mechanische homogenisator (een roerinrichting met schoepen die draaien met hoge snelheid) bedreven bij 10.000 rpm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Neerslaan van het GVS.
- Voorzichtig laag 300 pl van de w / o-emulsie op het bovenoppervlak van 1 ml van de buitenste waterige oplossing bij 4 ° C in een 1,5 ml microbuisjes deksel. Koel het microbuis gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verzamel de GVS.
- Onmiddellijk na het koelen van de microbuis,Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 30 min. Haal de neergeslagen GVS door het doorboren van de bodem van de microbuis met een punaise en verzamelen van een druppel in een gesteriliseerde microbuis van 1,5 ml.
- Verdun de neergeslagen GV druppeltje 10-100-voudig in volume met de buitenste waterige oplossing als de verkregen GVS worden verkregen in hoeveelheden die groot genoeg zijn om observatie bemoeilijken.
2. Microscopie Observation van GVS
- Bereid microscopie exemplaar.
- Plaats een hechtmiddel incubatiekamer in situ polymeraseketenreactie en hybridisatie (kamerafmeting 9 mm x 9 mm x 0,3 mm dik) bovenop een microscoop dekglaasje.
- Met behulp van een micropipet, aanbetaling van 25 ul van de verdunde neergeslagen GVS op het monster gebied en meteen plaats nog een dekking van glas (ongeveer 0,15 mm dik) op de top van de incubatie kamer.
- Record differentiële interferentie contrast microscopie beelden van de GVS.
- Neem microscopiebeelden van de vesicles met een microscoop (10X, 20X en 40X doelstellingen) met een 12V100WHAL-L halogeenlamp.
- Gedrag fluorescentiemicroscopie observaties.
- Plaats U-FBNA en U-FMCHE fluorescentie-mirror-eenheden in de microscoop. Monteer de units met 470-495 nm en 565-585 nm excitatie filters, respectievelijk, en met emissie-filters die 510-550 nm en 600-690 nm licht te zenden, respectievelijk.
Representative Results
De w / o-emulsie centrifugatiemethode fotografisch en schematisch weergegeven in figuur 1. De schematische afbeelding in figuur 1 blijkt dat de belangrijkste determinant van het succes van deze werkwijze is dat het soortelijk gewicht van de binnenste waterige oplossing groter is dan die van de buitenste waterige oplossing moet zijn, zodat het GVS neerslaat tijdens het centrifugeren. Daarnaast is de vorming van een lipide monolaag op de w / o-interface vereist dat het systeem gekoeld gedurende 10 minuten nadat de emulsie is gelaagd op de buitenste waterige oplossing. Omdat het GVS vorm van overdracht van emulsiedruppeltjes in de w / o-interface, moet de osmotische druk in de binnenste en buitenste waterige lagen dezelfde zijn. Als een controle experiment hebben we ook bereid GvS die geen microbolletjes met behulp van de werkwijze getoond in figuur 1 en stap 1,3, behalve dat de binnenste waterige oplossingbereid zonder microsferen.
Verzameling van het neergeslagen GVS na centrifugeren wordt getoond in figuur 2. Naast de semi fase bij de bodem van de microbuis, zagen we een witte, troebele tussenfase in de buitenste waterige oplossing (figuur 2a). Deze tussenfase was rijk aan combinaties van microsferen en olie, terwijl de onderste fase het GVS opgenomen. Dus na het doorboren van de bodem van de microbuis met een punaise (figuur 2b), verzameld we alleen de eerste druppel (figuur 2c), die enorme hoeveelheden GVS bevatte. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er niet meer dan twee druppels worden verzameld; bijkomende druppels kunnen combinaties van microsferen en lipiden, wat zal resulteren in een lagere dichtheid van GVS bevatten. De verkregen vesiculaire dispersie vaak bevatte ingekapselde materialen buiten het GVS, omdat de GVS often breuk tijdens het centrifugeren. Alleen GVS verkrijgen sorteren een sorteer- werkwijze zoals dialyse, gelfiltratie of fluorescentie geactiveerde cel worden gekozen vanwege de afmetingen van het inkapselende materiaal. Indien het voor het doel waarvoor het neergeslagen GVS worden gebruikt, kunnen zij worden verdund met de buitenste waterige oplossing. In sommige gevallen, de tussenfase uitgebreid tot de onderkant van de buis, wat suggereert dat vesicles die gevormd werden bij elkaar gehouden door de olie.
We verkregen differentiële interferentie microscopie en fluorescentie microscopie beelden van de GVS zonder microbolletjes (figuur 3a, 3b) en microsferen (figuur 3c -3 f). In overeenstemming met eerdere rapporten 23, 37, GVS met een lage lamellarity werden gevormd door ons protocol. Lipiden geconjugeerd met Texas Red DHPE, die rood FLUORES uitzendtcentie werd gebruikt, zodat de vorming van vesicles rechtstreeks door visualisatie van het dunne membraan kan worden bevestigd. Van de 160 GvS dat we verkregen, 55 microsferen ingekapseld en 105 leeg waren, waardoor een verhouding van inkapseling van 34%.
We bepaalden de volumefractie (φ, vol%) van microsferen in het GVS met behulp van de volgende werkwijze. Omdat elke GV bevat tientallen tot enkele honderden microsferen, het tellen van alle microsferen onder een optische microscoop is een uitdaging. Daarom gemengd we de niet-fluorescerende 1,0 urn microbolvormen met een kleine hoeveelheid fluorescerende microbolletjes, die met de hand onder de fluorescentiemicroscoop geteld. Het aantal (N) van ingekapselde microsferen werd berekend door het aantal (n) van handmatig getelde fluorescerende microbolletjes met 20 te vermenigvuldigen (gebaseerd op de oorspronkelijke 95: 5 [v / v] verhouding van niet-fluorescerende fluorescerende microbolletjes). De waarde van66; Vervolgens werd geschat op 100 Nv / V, waarbij v het volume van de microsferen en V het volume van de afzonderlijke GV. Merk op dat de schatting van N uit n ontstaat telfouten en deze fouten moet rekening worden gehouden bij de berekening φ. De waarde van φ werd geschat uit N, die rechtstreeks werd berekend als 20 n, en dit op zijn beurt geleid tot de waarschijnlijkheid dat cp nauwkeurig vertegenwoordigt de werkelijke waarde <50%. In feite, N fluctueert tot op zekere hoogte rond 20 n, dus we moeten beschouwen als 20 (n ± i), waarbij i is de fout in n. We schatten i zodat een kans van n ± i kon meer dan 50% verkregen op basis van een Poisson distributie. We schatten i, die op zijn beurt lieten berekenen 20 (n ± i) en waarden van66; dat opgenomen telfouten voor GvS met diameters van 10 en 15 urn (tabel 1). Volgens deze werkwijze werd de volumefractie van microsferen in het GV figuur 3c ongeveer 11 ± 3 vol% te zijn. De nauwkeurigheid van de berekende volumefractie was 10-30%.
Onze resultaten tonen aan dat we met succes ingekapseld 1 urn microbolvormen in GVS op een hoog volume fractie. We waren ook in staat om andere materialen in te kapselen in 100 mol% DOPC GVS met dezelfde buitenste waterige oplossing en hetzelfde protocol (Figuur 4). Specifiek GVS bevattende 0,1 gm microsferen werden bereid uit een Tris-gebufferde oplossing die 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M sucrose en 0,5 vol% fluorescerende microbolletjes met behulp van het protocol beschreven voor GVS bevattende 1,0 gm microsferen ( Figuur 4a). Naar aanleiding van het protocol beschreven above, DOPC GVS bevattende GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sucrose en 100 ug / ml GFP Figuur 4b) en GVS bevattende uranine (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sucrose, en 30 uM uranine Figuur 4c) werden ook bereid.
| n | N | φ (10-um diameter) | φ (15-um diameter) |
| 3 | 60 ± 20 | 6,0 ± 2,0 | 1,8 ± 0,6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8,0 ± 2,0 | 2.4 ± 0.6 |
| 5 | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3,0 ± 0,6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3.6 ± 1.2 |
| 10 | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5.9 ± 0,9 |
| 20 | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| 30 | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| een Fouten werden bepaald zoals beschreven in de tekst; n = aantal handmatig geteld microbolletjes; N = totaal aantal ingekapselde microsferen. | |||
Tabel 1: Aantallen en Volume Fracties (φ, vol%) van de microsferen een. een Fouten werden bepaald zoals beschreven in de tekst; n = aantal handmatig geteld microbolletjes; N = totaal aantal ingekapselde microsferen.
Figuur 1: Flow Ch kunst en schematische weergave van W / O-emulsie Centrifugeren Method. (A) Olie oplossing bestaande uit DOPC en Texas rood DHPE (100: 0,3 molaire verhouding) in vloeibare paraffine. (B) Binnen waterige dispersie bestaande uit sucrose en microbolletjes in Tris-HCl buffer. (C) Buitenste waterige oplossing bestaande uit glucose in Tris-HCl buffer. (D) Mengsel van 1 ml olie-oplossing en 300 pl inwendige waterige dispersie. (E) Emulgering met een homogenisator (10.000 rpm, 2 minuten). (F) De w / o-emulsie. (G) gelaagdheid van 300 ul van de emulsie 1 ml van de buitenste waterige oplossing. (H) Neergeslagen GvS net na centrifugeren. (I) Schematische weergave van het principe van de w / o-emulsie centrifugatiemethode. De zwarte pijl geeft de richting van de centrifugale versnelling..jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het doordringen van de Microtube. (A) neergeslagen GVS net na centrifugeren (ook afgebeeld in figuur 1h). De rode ellips geeft de druppel van de dispersie neergeslagen GV. (B) Piercing van de microbuisjes met een punaise. De pellet die de GVS werd verkregen door doorboren de microbuis bij de bodem met een punaise en druppeltjes verzamelen uit het gat. (C) Druppeltje van het geprecipiteerde GVS (aangegeven door de gele pijl) dispersie verdund met de buitenste waterige oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Microscopie Beelden van GVS. (A) differentiële interferentie contrast microscopie afbeelding van een GV zonder microbolletjes. De diameter van GV was ongeveer 10 urn. Schaal bar = 10 micrometer. (B) de fluorescentie microscopie beeld van een GV zonder microsferen. De rode fluorescentie werd uitgezonden door Texas Red DHPE. (C) microscopie verschilbeeld interferentiecontrast van een GV bevattende microbolletjes. (D) Fluorescentie microscopie beeld van 1,0 micrometer microsferen (YG carboxylaat microsferen) in een GV. Het aantal getelde fluorescerende microbolletjes (n) was 6. Wij schatten de fouten (i = 2) op basis van Poisson verdeling. Dan geschat we totaal aantal innerlijke microsferen (N = 20 (n ± i)) was 120 ± 40. Berekend werd dat deGV bevatte 1,0 urn microbolvormen in een volumefractie (φ = 100 Nv / V) van ongeveer 11 ± 3 vol%, waarbij v het volume van de microsferen en V het volume van het GVS. (E) Fluorescentie microscopie afbeelding van een GV membraan. De rode fluorescentie werd uitgezonden door Texas Red DHPE. (F) Samengevoegd beeld van de beelden in panelen d en e. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Differentieel Interferentie Contrast en fluorescentiemicroscopie Beelden van GVS met verschillende Encapsulated Materials. Differentiële interferentie contrast microscopie (bovenste) en fluorescentie microscopie (onder) afbeeldingenGVS bevattende (a) 0,1 urn microbolletjes, (b) GFP, en (c) uranine. Schaalbalken = 10 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het soortelijk gewicht van de binnenste waterige dispersiemedium en de buitenste waterige oplossing moet zorgvuldig worden gekozen. Voor de w / o-emulsie te precipiteren in de buitenste waterige oplossing tijdens het centrifugeren, moet de dichtheid van de binnenste waterige dispersiemedium groter dan die van de buitenste waterige oplossing. We hebben geprobeerd om GVS behulp binnenste en buitenste oplossingen zonder suiker bereiden, maar we geen GvS verkregen onder deze omstandigheden, omdat de binnenste waterige oplossing niet voldoende massa om de interferentie tussen de twee fasen oversteken hadden. Als er een grote osmotisch drukverschil tussen de twee oplossingen, GvS die neerslaan in de buitenste waterige oplossing kan krimpen of scheuren. Daarom moet de osmotische druk binnen en buiten de GVS gelijk zijn. Hiervoor gebruikten we sucrose als een opgeloste stof in de binnenste waterige dispersie en glucose als opgeloste stof in de buitenste waterige oplossing; beide suikers waren bij dezelfde concentratie. zowel zoutss = "xref"> 22 en suiker 23, 35, 38 zijn gebruikt voor dergelijke doeleinden, maar suiker wordt gewoonlijk toegepast omdat het minder toxisch en beter oplosbaar dan zout. Als echter te veel suiker wordt toegevoegd, de GVS in contact kan komen met de bodem van het dekglas en bezwijken komen. Er zijn verscheidene strategieën voor dit vermijden. Een strategie is het soortelijk gewicht tussen de binnenste en buitenste waterige oplossingen voor de GVS neerslaan onder milde omstandigheden verminderen; in het bijzonder kan de bovenstaande vloeistof van de dispersie neergeslagen GV worden uitgewisseld met een oplossing die identiek is aan de binnenste waterige oplossing de mogelijkheid van vesiculaire scheuren verminderen door hechting aan het dekglas als gevolg van het drijfvermogen. Een andere strategie is om beide dekglazen vooraf te bekleden met een dunne lipide film 29.
Een goede voorbereiding en incubatie van de emulsie wordenbelangrijk. We gebruikten vloeibare paraffine om de olie te bereiden. Minerale olie 26, 31, dodecaan 21, 33 en squalaan 33, 39 worden ook vaak gebruikt als oplosmiddel olie. Omdat deze materialen verschillen in dichtheid, viscositeit en oppervlaktespanning, verschillende aantallen blaasjes vormen, zelfs wanneer dezelfde centrifugeeromstandigheden gebruikt 33. Om de vesicles met de beoogde eigenschappen te verkrijgen, is het noodzakelijk om de soortelijke gewichten en viscositeiten van de binnenste en buitenste waterige oplossingen en de centrifugale acceleration.For bereiding van de oliefase te optimaliseren, moet incubatie plaatsvinden bij hoge temperatuur en in een droge milieu zoals een incubator of een dehydrator. In deze studie hebben we de vloeibare paraffine tot 80 ° C verwarmd om de lipide molecules.In toevoeging volledig op te lossen, moet de emulsiealleen bereid als nodig en moet onmiddellijk gecentrifugeerd omdat het onstabiel net nadat het is bereid en de w / o druppels gemakkelijk samensmelten met elkaar. De emulsie kan in grote hoeveelheden worden bereid door sonificatie, vortexen of tikken. Het gebruik van een homogenisator zorgt voor een snelle bereiding van grote hoeveelheden emulsie en gemakkelijker emulgeren in olie met een hoge viscositeit. Het is ook belangrijk dat de emulsie lagen op de buitenste waterige oplossing voorzichtig en snel en vervolgens gekoeld bij 4 ° C. De tijd tussen emulgering en centrifugeren verkorten, kan de olie-buitenste waterige oplosmiddelsysteem worden voorgekoeld alvorens de emulsie is gelaagd op, en het gehele systeem kan dan worden gecentrifugeerd immediately.If de witte troebeling sneller of langzamer dan normaal, de mechanische homogenisator moet grondig worden gespoeld om schoonmaakmiddelen te verwijderen. Bovendien, voor emulgeren, de olie oplossing, binnenste waterige oplossing en emulgator moet r zijneturned tot kamertemperatuur.
Juiste centrifugaalversnelling is ook belangrijk. Door centrifugeren bij 18.000 x g, konden we GVS bereiden met een inwendige materiaal ingekapseld in een hoge concentratie. Wanneer het inkapselen van verschillende materialen vereist, is het beter om de centrifugale versnelling verminderen. Zo werd een actine montagesysteem inkapselen zeven verbindingen bereikt door centrifugatie bij minder dan 350 g x 35. In gevallen waarin centrifugeren ongewenst is, kan GVS worden verkregen door de suikerconcentratie of door precipiteren van het emulsie onder invloed van zijn eigen gewicht 38, 40, 41.
De hierin gerapporteerde methode heeft twee belangrijke beperkingen. Een daarvan is dat oliemoleculen (paraffine, in dit geval) kan worden opgelost in het GV membraan, zoals door de Weit is opgemerktZ-groep 21. Wanneer insertie van een membraaneiwit in de GV membraan gewenst is, moet het effect van gelijktijdig bestaande olie- moleculen op het eiwit beschouwd. De andere beperking is de variatie van volumefractie. In deze studie hebben we schattingen zijn de fracties van microsferen in het GVS varieerde 4-30 vol%; de volumegehalten niet identiek aan de volumefractie van de binnenste waterige oplossing gebruikt voor GV bereiding. Hoewel we konden microsferen in het GVS kapselen in een volumefractie hoog genoeg voor microscopie observatie, is deze methode niet geschikt voor de bereiding van GVS met een gelijkmatige verdeling volumefractie. Vermeld is dat de verdeling van microsferen volumedelen verandert tijdens het centrifugeren 34.
De w / o-emulsie centrifugatiemethode wordt gewoonlijk gebruikt voor de vorming van GVS met ingekapselde materialen. Echter slechts weinig rapporten beschreven de preparatie van GVS inkapselen microschaal materialen 34, 42. Onlangs hebben moleculaire robots die een ingekapselde DNA-apparaat of een moleculair systeem zo ontworpen 43, 44. GVS met compartimenten zijn de eerste keuze voor dit soort toepassingen; Daarom kunnen technieken, zoals de onze, die kunnen worden gebruikt voor het inkapselen van magnetische microsferen en microsferen met verschillende oppervlakte functionalisering verwachting bruikbaar 44 zijn.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Tomoko Yamaguchi voor het tekenen van de schematische afbeelding in figuur 1. Deze studie werd ondersteund door de Okazaki ORION Project van de Okazaki Institute for Integrative Bioscience van theNational Institutes of Natuurwetenschappen (NINS); door de Astrobiologie Center Project (geen AB281010.) van NINS; door een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve Areas (Dynamische bestellen van biomoleculaire systemen voor de creatie van geïntegreerde functies) van de Japan Society voor de Bevordering van de Wetenschap (JSPS) (geen 25.102.008.); door een Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (KK, geen 15K17850.) uit JSPS; andby een Grant-in-Steun voor onderzoek Activity Start-Up (naar YN, nr. 15H06653) uit JSPS. Extra steun werd verleend door een subsidie van de Noguchi Institute, een subsidie van de Kao Stichting voor de Kunsten en Wetenschappen, en een subsidie van de Kurita Water en Milieu Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
References
- Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
- Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
- Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
- Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
- Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
- Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
- Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L.
- Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
- Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
- Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
- Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
- Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683 (2016).
- Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
- Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).
- Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
- Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).
