Abstract
रचनात्मक जीव विज्ञान और कृत्रिम जीवन बनाने के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान दृष्टिकोण जैविक या nonbiological सामग्री के नीचे अप विधानसभा को शामिल करना। इस तरह के दृष्टिकोण जीवित और निर्जीव बात के बीच सीमा पर अनुसंधान के क्षेत्र में काफी ध्यान दिया है और पिछले दो दशकों में कृत्रिम कोशिकाओं के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है। विशेष रूप से, विशालकाय Vesicles (जीवीएस) अक्सर कृत्रिम कोशिका झिल्ली के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इस पत्र में, हम अत्यधिक सघन biomolecules युक्त कोशिकाओं की एक मॉडल के रूप में अत्यधिक पैक microspheres encapsulating जीवीएस की तैयारी का वर्णन है। जीवीएस एक साधारण पानी में तेल पायस centrifugation विधि के माध्यम से तैयार किए गए थे। विशेष रूप से, एक homogenizer एक जलीय और समाधान युक्त सामग्री समझाया जा करने के लिए एक तेल भंग फॉस्फोलिपिड युक्त पायसी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और जिसके परिणामस्वरूप पायस अन्य जलीय समाधान की सतह पर ध्यान स्तरित था। बहुस्तरीय प्रणाली तो centrifuged था टीओ जीवीएस उत्पन्न करते हैं। इस शक्तिशाली विधि छोटे अणुओं से microspheres को लेकर सामग्री encapsulate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
Introduction
रचनात्मक, या सिंथेटिक, जीव विज्ञान दृष्टिकोण रहने के बीच सीमा की खोज और बात निर्जीव के लिए एक आकर्षक अवसर है। क्योंकि सेल जीवन के लिए आवश्यक न्यूनतम इकाई है हम वर्तमान में इसे समझ, विभिन्न शोधकर्ताओं elucidating का अंतिम लक्ष्य के साथ, तो यह है कि घटना है कि इस तरह के कृत्रिम कोशिकाओं के भीतर होते अध्ययन किया जा सकता सरल, अच्छी तरह से समझ रसायनों से कृत्रिम कोशिकाओं का निर्माण करने का प्रयास किया जीवन की उत्पत्ति और जीवित कोशिकाओं 1, 2, 3 के मौलिक कार्य का अध्ययन किया। विशेष रूप से, vesicles 4, जो गोलाकार amphiphilic अणुओं से बना microcompartments कर रहे हैं और इस तरह के प्रोटीन 5, 6 और डीएनए 7, 8, 9 के रूप में जैविक अणुओं को समाहित किया जा सकता है,लड़की = "xref"> 10, अक्सर जैविक झिल्लियों के मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है।
पुटिकाओं में छोटे रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, बड़े (व्यास <1 माइक्रोन), या विशाल (व्यास> 1 माइक्रोन) (<100 एनएम के एक व्यास के रूप में परिभाषित)। विशालकाय पुटिकाओं (जीवीएस) बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है क्योंकि वे आकार, आकार, और संरचना में जीवित कोशिकाओं के समान हैं। जीवीएस के आकार के कारण, जीवी झिल्ली में रूपात्मक परिवर्तन आसानी से एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत वास्तविक समय में देखा जा सकता है।
जीवीएस तैयार करने के लिए कई तरीकों 11 सूचित किया गया है, हाइड्रेशन विधि 12, 13, फ्रीज पिघलना विधि 14, electroformation विधि 15, 16, और fluidic डिवाइस विधि 17, 18 सहित। हालांकि, encapsulating प्रोटीन और अन्य MACROMइन तरीकों के माध्यम से उच्च सांद्रता में जीवीएस में olecules मुश्किल है। विशेष रूप से, यह अत्यंत 19 कोशिकाओं, 20 के अंदर भीड़ भरे वातावरण की नकल करने के लिए पर्याप्त मात्रा (20-30 खंड%) में जैविक सामग्री encapsulate करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। फार्म करने के लिए तुरन्त जीवीएस, Weitz और सहकर्मियों एक पानी में तेल की स्थापना (डब्ल्यू / ओ) पायस centrifugation विधि 21, 22। इस विधि के पांच महत्वपूर्ण विशेषताएं है। सबसे पहले, क्योंकि इस विधि द्वारा तैयार जीवीएस कम lamellarity 23, 24 है, उनके झिल्ली इतनी पतली है कि वे आसानी से विकृत किया जा सकता है। जीवी झिल्ली विरूपण FtsZ (एक बैक्टीरिया कोशिका विभाजन प्रोटीन), tubulin, और अन्य अणुओं से प्रेरित 25 का अध्ययन किया गया, 26, 27, 28, और हम polyhe मनाया microspheres 29, 30 के encapsulation से प्रेरित जीवी झिल्ली के विरूपण dron की तरह। दूसरा, झिल्ली प्रोटीन कठिनाई 31 के साथ यद्यपि इस विधि द्वारा vesicular झिल्ली में डाला जा सकता है। उदाहरण के लिए, Yomo समूह इस विधि का इस्तेमाल इन विट्रो संश्लेषण और झिल्ली प्रोटीन α-hemolysin 32 के ताकना बनाने गतिविधि का अध्ययन करने के लिए। तीसरा, यह विषम जीवीएस जिसमें भीतरी और बाहरी पत्रक के लिपिड घटक अलग-अलग 22 हैं उत्पन्न करने के लिए संभव है। उदाहरण के लिए, Whittenton एट अल। भीतरी पत्रक नकारात्मक आरोप लगाया polynucleotides encapsulate करने में cationic लिपिड, साथ और बाहरी पत्रक पर तटस्थ लिपिड के साथ उत्पन्न विषम जीवीएस विषाक्तता और अविशिष्ट सेलुलर तेज 33 कम करने के लिए। चौथा, एकाग्रता और मात्रा जीवीएस अंदर पदार्थों के अंश का अपेक्षाकृत ज्यादा हो सकती हैएस = "xref"> 28, 34। पांचवां, सामग्री के कई प्रकार के 35 से समझाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Nishimura एट अल। जीवीएस में इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली समझाया और जीवीएस 36 के भीतर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए प्रणाली का इस्तेमाल किया। इन पांच सुविधाओं w / ओ पायस centrifugation सेल नकल उतार जीवीएस पैदा करने के लिए एक अनिवार्य विधि बनाते हैं।
पिछले काम में, centrifugation द्वारा उत्पन्न जीवीएस अंतिम जलीय घोल 22 के कुछ युक्त एक लंबे 16 जी स्टेनलेस स्टील सुई से लैस एक सिरिंज के माध्यम से एकत्र किए गए थे। अनुभवहीन तकनीशियनों के हाथों में, इस संग्रह विधि आसानी तेल में से कुछ के साथ जीवी के प्रदूषण में परिणाम सकता है। इस अध्ययन में, हम w / ओ पायस centrifugation Yomo समूह 23, 37 से विकसित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया,जिसमें उपजी जीवीएस एकत्र कर रहे हैं के माध्यम से एक छेद जिसमें वे तैयार कर रहे हैं अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल पर खोला गया। हम 1.0 माइक्रोन microspheres, जो intracellular अंगों के आकार में समान हैं encapsulating जीवीएस तैयार किया। microspheres का उपयोग हमें उनकी मात्रा अंश की गणना के द्वारा उनकी एकाग्रता अनुमान लगाने के लिए अनुमति दी। जीवीएस की तैयारी में जो सामग्री घनी पैक कर रहे हैं के लिए एक विधि की स्थापना कृत्रिम कोशिकाओं बनाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। भीतरी सामग्री के विभिन्न प्रकार के लिए हमारे प्रोटोकॉल की उपयोगिता इस बात की पुष्टि करने के लिए, हम भी दिखा दिया है कि GFP और एक छोटे से पानी में घुलनशील फ्लोरोसेंट अणु (uranine) जीवीएस में समझाया जा सकता है।
Protocol
डब्ल्यू / हे पायस केन्द्रापसारण विधि द्वारा जीवीएस की 1. तैयारी
- 1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine के एक शेयर समाधान (DOPC, 25 मिमी) और टेक्सास लाल 1,2-dihexadecanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine के एक शेयर समाधान, triethylammonium नमक (टेक्सास रेड तैयार DHPE, क्लोरोफॉर्म में 0.20 मिमी) और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान की दुकान।
- एक तेल समाधान तैयार है।
- DOPC शेयर समाधान (51.0 μl और टेक्सास लाल DHPE शेयर समाधान (19.2 μl) नाइट्रोजन गैस बहने के तहत का एक मिश्रण वाष्पन द्वारा एक 5 मिलीलीटर कांच की शीशी के अंदर सतह पर एक लिपिड फिल्म के रूप में।
- रात भर कम दबाव के तहत फिल्म सेते हैं और फिर (जी / 3 सेमी 0.86-0.89) शीशी तरल आयल के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में शीशी लपेटें और बाकी में 80 डिग्री सीओ / एन पर यह सेते हैं। 3 मिमी - DOPC और टेक्सास लाल DHPE के अंतिम सांद्रता 1.3 और 3.8 x 10 हैंक्रमशः, और DOPC: 0.3: टेक्सास लाल DHPE दाढ़ अनुपात 100 है।
- भीतरी जलीय फैलाव तैयार करें।
- एक 1.5 मिलीलीटर lidded microtube में, 1.0 माइक्रोन nonfluorescent microspheres (2.5 खंड%) और 1.0 माइक्रोन फ्लोरोसेंट microspheres (2.5 खंड%) के एक फैलाव की 12.5 μl का एक फैलाव के 237.5 μl मिश्रण; nonfluorescent के 5 (वी / वी) अनुपात फ्लोरोसेंट microspheres के लिए: यह एक 95 से मेल खाती है।
- Tris बफर समाधान के 125 μl (टीबीएस, 1 एम) और विआयनीकृत पानी की 875 μl द्वारा पीछा किया सुक्रोज के 64 मिलीग्राम जोड़ें। microspheres की अंतिम मात्रा अंश 0.5 खंड% है, और Tris एचसीएल (7.5 पीएच) और सुक्रोज के अंतिम सांद्रता में क्रमश: 0.1 और 0.15 मीटर कर रहे हैं।
- भंवर 30 सेकंड के लिए microtube और फिर 10 मिनट के लिए यह sonicate।
- बाहरी जलीय घोल तैयार करें।
- एक Tris बफर समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी के बाद (0.1 एम Tris एचसीएल [7.5 पीएच], 0.15 मीटर glucOSE) भीतरी जलीय मीडिया के रूप में एक ही प्रक्रिया में, समाधान के 1 मिलीलीटर lidded microtube एक 1.5 मिलीलीटर में जगह है। भंवर 30 सेकंड के लिए microtube और फिर 10 मिनट के लिए यह sonicate।
- ओ / ओ microspheres युक्त पायस तैयार करें।
- एक 1.5 मिलीलीटर microtube में भीतरी जलीय समाधान के 300 μl के साथ तेल समाधान (तरल पैराफिन युक्त DOPC और टेक्सास लाल DHPE) के 1 मिलीलीटर मिक्स।
- एक यांत्रिक homogenizer (ब्लेड कि उच्च गति पर बारी बारी से एक आंदोलनकारी) का उपयोग करके microtube में दो घटक पायसी आरटी पर 2 मिनट के लिए 10,000 rpm पर संचालित है।
- जीवीएस वेग।
- धीरे lidded microtube एक 1.5 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहरी जलीय समाधान के 1 मिलीलीटर की ऊपरी सतह पर w / ओ पायस के 300 μl परत। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए microtube टेंशन मत लो।
- जीवीएस लीजिए।
- इसके तत्काल बाद microtube द्रुतशीतन के बाद,पर 30 मिनट के लिए 18,000 एक्स जी यह अपकेंद्रित्र। एक नक़्शे की पिन के साथ microtube के नीचे भेदी और एक निष्फल 1.5 मिलीलीटर microtube में एक छोटी बूंद इकट्ठा करके उपजी जीवीएस प्राप्त करते हैं।
- पतला उपजी जीवी बाहरी जलीय समाधान के साथ मात्रा से 10-100 गुना छोटी बूंद यदि प्राप्त जीवीएस मात्रा काफी बड़े अवलोकन मुश्किल बनाने के लिए प्राप्त कर रहे हैं।
2. जीवीएस की माइक्रोस्कोपी अवलोकन
- माइक्रोस्कोपी नमूना तैयार करें।
- एक खुर्दबीन के कवर कांच के शीर्ष पर सीटू पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और संकरण (चैम्बर आकार 9 मिमी x 9 मिमी x 0.3 मिमी मोटी) में एक चिपकने वाला ऊष्मायन चैम्बर रखें।
- एक micropipette का प्रयोग, पतला की जमा 25 μl नमूना क्षेत्र पर जीवीएस उपजी और तुरंत एक और कवर ग्लास (लगभग 0.15 मिमी मोटी) ऊष्मायन कक्ष के शीर्ष पर जगह है।
- रिकार्ड अंतर हस्तक्षेप Contrasजीवीएस की टी माइक्रोस्कोपी छवियों।
- एक माइक्रोस्कोप (10X, 20X, 40X और उद्देश्यों) एक 12V100WHAL-एल हैलोजन लैंप के साथ सुसज्जित के साथ पुटिकाओं के रिकार्ड माइक्रोस्कोपी छवियों।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों का संचालन।
- माइक्रोस्कोप में यू-FBNA और यू-FMCHE प्रतिदीप्ति दर्पण इकाइयों डालें। 470-495 एनएम और 565-585 एनएम उत्तेजना फिल्टर, क्रमशः, और उत्सर्जन फिल्टर कि क्रमश: 510-550 एनएम और 600-690 एनएम प्रकाश संचारित, साथ साथ इकाइयों फिट बैठते हैं।
Representative Results
W / ओ पायस centrifugation विधि फ़ोटोग्राफ़ी की और रेखाचित्र के रूप में चित्रा 1 में सचित्र है। चित्रा 1 में योजनाबद्ध चित्र को पता चलता है कि इस विधि की सफलता का सबसे महत्वपूर्ण निर्धारक है कि आंतरिक जलीय समाधान के विशिष्ट गुरुत्व, बाहरी जलीय समाधान की तुलना में बड़ा होना चाहिए, ताकि जीवीएस centrifugation के दौरान वेग होगा है। इसके अलावा, w / ओ इंटरफेस में एक लिपिड monolayer के गठन की आवश्यकता है कि इस प्रणाली के 10 मिनट के लिए ठंडा होने के बाद पायस बाहरी जलीय समाधान पर स्तरित है। क्योंकि w / ओ इंटरफेस के पार पायस बूंदों के हस्तांतरण के द्वारा जीवीएस फार्म, भीतरी और बाहरी परतों में जलीय आसमाटिक दबाव के एक ही होना चाहिए। एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, हम भी तैयार जीवीएस प्रक्रिया के माध्यम से कोई microspheres युक्त चित्र 1 में दिखाया गया है और 1.3 चरण, सिवाय इसके कि भीतरी जलीय समाधान किया गयाmicrospheres के बिना तैयार किया।
Centrifugation के बाद उपजी जीवीएस का संग्रह चित्रा 2 में दिखाया गया है। Microtube के बहुत नीचे अर्द्धपारदर्शी चरण के अलावा, हम भी बाहरी जलीय घोल (चित्रा 2A) में एक सफेद, पंकिल मध्यवर्ती चरण मनाया। जबकि नीचे चरण जीवीएस निहित इस मध्यवर्ती चरण, microspheres और तेल एकत्रित में धनी था। इसलिए, एक नक़्शे की पिन (चित्रा 2 बी) के साथ microtube के नीचे भेदी के बाद, हम केवल पहली बूंद (चित्रा 2 सी), जो जीवीएस का भारी मात्रा में निहित एकत्र। यह सुनिश्चित करें कि कोई दो से अधिक बूँदें एकत्र कर रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है; किसी भी अतिरिक्त बूँदें microspheres और लिपिड के एकत्रित, जो जीवीएस का एक कम घनत्व में परिणाम होगा हो सकता है। प्राप्त vesicular फैलाव अक्सर जीवीएस के बाहर समझाया सामग्री निहित क्योंकि जीवीएस oftecentrifugation के दौरान n टूटना। केवल जीवीएस प्राप्त करने के लिए, इस तरह के डायलिसिस, जेल निस्पंदन, या प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल के रूप में एक छँटाई विधि छँटाई चुना जाना चाहिए, encapsulating सामग्री के आकार के कारण। तो जिस उद्देश्य के लिए उपजी जीवीएस इस्तेमाल हो रहे हैं के लिए आवश्यक हो, वे बाहरी जलीय समाधान के साथ पतला किया जा सकता। कुछ मामलों में, मध्यवर्ती चरण ट्यूब के नीचे करने के लिए बढ़ाया है, सुझाव है कि किसी भी पुटिकाओं कि गठन एक साथ तेल से आयोजित की गई।
हम microspheres बिना जीवीएस का अंतर हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों प्राप्त (चित्रा 3 ए, 3 बी) और microspheres के साथ (चित्रा -3 सी -3 एफ)। पिछली रिपोर्टों 23, 37 के अनुरूप, कम lamellarity साथ जीवीएस हमारे प्रोटोकॉल से गठन किया गया। टेक्सास रेड DHPE, जो लाल fluores का उत्सर्जन करता है के साथ संयुग्मित लिपिडcence है, ताकि पुटिका गठन सीधे पतली झिल्ली के दृश्य से इसकी पुष्टि की जा सकती है इस्तेमाल किया गया। 160 जीवीएस है कि हम प्राप्त की, 55 समझाया microspheres और 105 खाली थे, 34% के encapsulation का अनुपात दे रही है।
हम निम्न विधि के माध्यम से जीवीएस में microspheres की मात्रा अंश (φ, वॉल्यूम%) चुना गया। क्योंकि प्रत्येक जीवी कई सौ microspheres के लिए दर्जनों शामिल हैं, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सभी microspheres गिनती चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, हम फ्लोरोसेंट microspheres की एक छोटी राशि है, जो मैन्युअल प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे गिना रहे थे साथ nonfluorescent 1.0 माइक्रोन microspheres मिलाया। समझाया microspheres की कुल संख्या (एन) के 20 से मैन्युअल गिना फ्लोरोसेंट microspheres की संख्या (एन) से गुणा करके गणना की गई (मूल 95 के आधार पर: 5 [V / V] nonfluorescent के अनुपात फ्लोरोसेंट microspheres के लिए)। का मूल्य66; तो Nv 100 / वी, जहां वी microspheres की मात्रा है और वी व्यक्तिगत जीवी की मात्रा है, जैसा कि अनुमान लगाया गया था। नोट n से एन के उस अनुमान की गिनती त्रुटियों को जन्म देता है, और जब φ की गणना इन त्रुटियों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। Φ का मूल्य एन, जो सीधे 20 n के रूप में गणना की गई से अनुमान लगाया गया था, और बदले में यह संभावना है कि φ में हुई सही प्रतिनिधित्व सही मूल्य <50% है। वास्तव में, एन 20 एन के आसपास कुछ हद तक उतार चढ़ाव होता रहता है, तो हम 20 के रूप में विचार करने के लिए (एन मैं ±), जहाँ मैं n में त्रुटि है की जरूरत है। हम आदेश में कहा कि एन की संभावना ± मैं अधिक से अधिक 50% एक पॉसों वितरण के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है में मैं अनुमान है। हम मैं अनुमान है, जो बदले में हमें 20 गणना करने के लिए (एन मैं ±) और मूल्यों की अनुमति66; है कि 10 और 15 माइक्रोन (तालिका 1) के व्यास के साथ जीवीएस के लिए त्रुटियों की गिनती शामिल थे। इस प्रक्रिया के अनुसार, जीवी में microspheres चित्रा -3 सी में दिखाया गया है की मात्रा अंश 11 ± 3 खंड% होने का अनुमान लगाया गया था। गणना की मात्रा अंश का सटीक 10-30% थी।
हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि हम सफलतापूर्वक एक उच्च मात्रा अंश पर 1 माइक्रोन जीवीएस में microspheres समझाया। हम भी एक ही बाहरी जलीय समाधान और एक ही प्रोटोकॉल (चित्रा 4) का उपयोग कर 100 मोल% DOPC जीवीएस में अन्य सामग्री encapsulate करने में सक्षम थे। विशेष रूप से, 0.1 माइक्रोन microspheres युक्त जीवीएस एक Tris बफर समाधान 0.1 एम Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 0.15 मीटर सूक्रोज, और 0.5% खंड फ्लोरोसेंट microspheres 1.0 माइक्रोन microspheres युक्त जीवीएस के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से (जिसमें से तैयार किए गए चित्रा 4 क)। प्रोटोकॉल वर्णित abov के बादई, DOPC जीवीएस GFP (0.1 एम Tris एचसीएल [7.5 पीएच], 0.15 मीटर सुक्रोज, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल GFP, चित्रा 4 बी) युक्त और uranine युक्त जीवीएस (0.1 एम Tris एचसीएल [7.5 पीएच], 0.15 मीटर सूक्रोज, 30 माइक्रोन के uranine, चित्रा 4C) भी तैयार थे।
| n | एन | φ (10 माइक्रोन व्यास) | φ (15 माइक्रोन व्यास) |
| 3 | 60 ± 20 | 6.0 ± 2.0 | 1.8 ± 0.6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8.0 ± 2.0 | 2.4 ± 0.6 |
| 5 | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3.0 ± 0.6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3.6 ± 1.2 |
| 10 | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5।9 ± 0.9 |
| 20 | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| 30 | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| एक त्रुटियाँ पाठ में वर्णित के रूप में निर्धारित किया गया है; एन = मैन्युअल गिना microspheres की संख्या; एन = समझाया microspheres की कुल संख्या। | |||
तालिका 1: संख्या और मात्रा भिन्न (φ, वॉल्यूम%) microspheres एक की। एक त्रुटियाँ पाठ में वर्णित के रूप में निर्धारित किया गया है; एन = मैन्युअल गिना microspheres की संख्या; एन = समझाया microspheres की कुल संख्या।
चित्रा 1: प्रवाह चौधरी कला और डब्ल्यू / हे पायस केन्द्रापसारण विधि के योजनाबद्ध चित्रण। (क) DOPC और टेक्सास लाल DHPE से मिलकर तेल समाधान: तरल पैराफिन में (100 0.3 दाढ़ अनुपात)। (ख) इनर जलीय सुक्रोज और Tris एचसीएल बफर में microspheres से मिलकर फैलाव। (ग) बाहरी जलीय Tris एचसीएल बफर में ग्लूकोज से मिलकर समाधान। (घ) तेल समाधान के 1 मिलीलीटर और भीतरी जलीय फैलाव के 300 μl का मिश्रण। (ई) एक homogenizer (10,000 आरपीएम, 2 मिनट) के साथ Emulsification। (च) w / ओ पायस। (G) बाहरी जलीय समाधान के 1 मिलीलीटर पर पायस के 300 μl के layering। (ज) उपजी जीवीएस centrifugation बस के बाद। (I) w / ओ पायस centrifugation विधि के सिद्धांत के योजनाबद्ध चित्रण। काला तीर केन्द्रापसारक त्वरण की दिशा इंगित करता है।.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: microtube के भेदी। (क) उपजी जीवीएस सिर्फ centrifugation (चित्रा भी 1h में चित्रित) के बाद। लाल अंडाकार उपजी जीवी फैलाव की छोटी बूंद इंगित करता है। (ख) एक नक़्शे की पिन के साथ microtube के भेदी। गोली जीवीएस युक्त एक नक़्शे की पिन के साथ नीचे के निकट microtube भेदी और छेद से बूंदों को इकट्ठा करके प्राप्त हुई थी। (ग) उपजी जीवीएस फैलाव बाहरी जलीय समाधान के साथ पतला (पीले तीर द्वारा संकेत) की बूँद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: जीवीएस की माइक्रोस्कोपी छवियों। Microspheres के बिना एक जीवी (क) के अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि। जीवी के व्यास के बारे में 10 माइक्रोन था। स्केल बार 10 माइक्रोन =। (ख) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी microspheres के बिना एक जीवी की छवि। लाल प्रतिदीप्ति टेक्सास रेड DHPE द्वारा उत्सर्जित किया गया था। (ग) अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी एक जीवी microspheres युक्त की छवि। (घ) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 1.0 माइक्रोन microspheres (YG कार्बोक्सिलेट microspheres) एक जीवी अंदर की छवि। गिना फ्लोरोसेंट microspheres (एन) की संख्या 6. था हम त्रुटियों (i = 2) पॉसों वितरण के आधार पर अनुमान लगाया गया। तो फिर हम अनुमान भीतरी microspheres की कुल संख्या (एन = 20 (एन मैं ±)) 120 ± 40 था। यह गणना की गई है किजीवी लगभग 11 ± 3 खंड%, जहां वी microspheres की मात्रा है और वी जीवीएस की मात्रा है की एक मात्रा अंश (φ NV = 100 / वी) पर 1.0 माइक्रोन microspheres निहित। (ई) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक जीवी झिल्ली की छवि। लाल प्रतिदीप्ति टेक्सास रेड DHPE द्वारा उत्सर्जित किया गया था। (च) में पैनल डी और ई छवियों की छवि विलय कर दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विभिन्न समझाया सामग्री के साथ जीवीएस की छवियाँ। अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (ऊपर) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (नीचे) की छवियों(क) 0.1 माइक्रोन microspheres, (ख) GFP, और (ग) uranine युक्त जीवीएस। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
भीतरी जलीय फैलाव मध्यम और बाहरी जलीय समाधान के विशिष्ट gravities ध्यान से चुना जाना चाहिए। w / ओ पायस centrifugation के दौरान बाहरी जलीय घोल में वेग के लिए, आंतरिक जलीय फैलाव माध्यम के विशिष्ट गुरुत्व बाहरी जलीय समाधान की तुलना में बड़ा होना चाहिए। हम शक्कर के बिना भीतरी और बाहरी समाधान का उपयोग जीवीएस तैयार करने की कोशिश की है, लेकिन हम इन शर्तों के तहत कोई जीवीएस हुई, क्योंकि भीतरी जलीय घोल दो चरणों के बीच हस्तक्षेप को पार करने के लिए पर्याप्त बड़े पैमाने पर नहीं था। अगर वहाँ दो समाधान, जीवीएस कि बाहरी जलीय घोल हटना या टूटना सकता है में वेग के बीच एक बड़ा आसमाटिक दबाव अंतर है। इसलिए, अंदर और बाहर जीवीएस आसमाटिक दबाव बराबर होना चाहिए। इसे पूरा करने के लिए हम आंतरिक और बाहरी जलीय फैलाव जलीय घोल में एक घुला हुआ पदार्थ के रूप में ग्लूकोज में घुला हुआ पदार्थ के रूप में सुक्रोज इस्तेमाल किया; दोनों शर्करा ही एकाग्रता में थे। दोनों नमकएस एस = "xref"> 22 और चीनी 23, 35, 38 में इस तरह के उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन चीनी आमतौर पर कार्यरत है क्योंकि यह कम विषाक्त और नमक की तुलना में अधिक घुलनशील है। हालांकि, अगर बहुत ज्यादा चीनी जोड़ा जाता है, जीवीएस कवर कांच और पतन के नीचे के साथ संपर्क में आ सकता है। इस से बचने के लिए कई रणनीतियों रहे हैं। एक रणनीति के भीतरी और बाहरी जलीय समाधान इतना है कि जीवीएस हल्के शर्तों के तहत वेग के बीच विशिष्ट गुरुत्व अंतर को कम करने के लिए है; विशेष रूप से, उपजी जीवी फैलाव की सतह पर तैरनेवाला एक समाधान है कि भीतरी जलीय समाधान के लिए समान है उछाल का एक परिणाम के रूप में कांच कवर करने के लिए आसंजन द्वारा vesicular संबंध विच्छेद की संभावना को कम करने के साथ आदान-प्रदान किया जा सकता है। एक और रणनीति एक पतली लिपिड फिल्म 29 के साथ कवर चश्मे के दोनों precoat है।
समुचित तैयारी और पायस के ऊष्मायन रहे हैंजरूरी। हम तरल पैराफिन तेल का इस्तेमाल किया समाधान तैयार करने के लिए। खनिज तेल 26, 31, 21 dodecane, 33, और squalane 33, 39 में भी अक्सर विलायक तेल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। क्योंकि इन सामग्रियों विशिष्ट गुरुत्व, चिपचिपाहट और सतह तनाव में भिन्नता है, पुटिकाओं के विभिन्न संख्या भी जब एक ही centrifugation की स्थिति 33 उपयोग किया जाता है के रूप में। लक्ष्य गुणों के साथ पुटिकाओं प्राप्त करने के लिए, यह विशिष्ट gravities और भीतरी और बाहरी जलीय समाधान के viscosities के साथ ही तेल चरण के केन्द्रापसारक acceleration.For तैयारी अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है, ऊष्मायन उच्च तापमान पर और एक सूखी में होने चाहिए पर्यावरण एक मशीन या एक dehydrator के रूप में इस तरह के। इस अध्ययन में, हम 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया तरल पैराफिन पूरी तरह से लिपिड molecules.In अलावा भंग करने के लिए, पायस चाहिएकेवल जरूरत के रूप में और तुरंत centrifugation के अधीन किया जाना चाहिए क्योंकि यह अस्थिर है बस के बाद इसे तैयार किया जाता है और तैयार रहना w / ओ बूंदों आसानी से एक दूसरे से फ्यूज। पायस बड़ी मात्रा में sonication, vortexing, या दोहन द्वारा तैयार किया जा सकता है। हालांकि, एक homogenizer का उपयोग एक उच्च चिपचिपाहट के साथ तेल में पायस की बड़ी मात्रा का तेजी से तैयार करने और आसान emulsification के लिए अनुमति देता है। यह भी महत्वपूर्ण है कि पायस बाहरी जलीय समाधान पर धीरे से और तेजी से और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा स्तरित जा रहा है। emulsification और centrifugation के बीच समय कम करने के लिए, तेल-बाहरी जलीय समाधान प्रणाली से पहले पायस उस पर स्तरित है prechilled जा सकता है, और फिर पूरे सिस्टम immediately.If सफेद मैलापन प्रतीत होता है तेज या सामान्य से अधिक धीमी, यांत्रिक centrifuged किया जा सकता homogenizer अच्छी तरह से सफाई डिटर्जेंट दूर करने के लिए rinsed होना चाहिए। इसके अलावा, पायसीकरण से पहले, तेल समाधान, भीतरी जलीय घोल, और पायसीकारकों आर होना चाहिएकमरे के तापमान को eturned।
उचित केन्द्रापसारक त्वरण भी महत्वपूर्ण है। पर 18,000 एक्स जी centrifuging द्वारा, हम एक उच्च एकाग्रता में समझाया एक भी आंतरिक सामग्री के साथ जीवीएस तैयार करने में सक्षम थे। जब एकाधिक सामग्री के encapsulation की आवश्यकता है, यह केन्द्रापसारक त्वरण कम करने के लिए बेहतर है। उदाहरण के लिए, एक actin विधानसभा सात यौगिकों encapsulating प्रणाली कम से कम 350 x जी 35 पर centrifugation के साथ हासिल की थी। जिन मामलों में centrifugation अवांछनीय है, जीवीएस चीनी एकाग्रता का समायोजन करके या अपने स्वयं के बड़े पैमाने पर 38, 40, 41 के प्रभाव में पायस precipitating द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
विधि के साथ साथ सूचना के दो प्रमुख सीमाएँ हैं। एक यह है कि तेल (आयल, इस मामले में) जीवी झिल्ली में solubilized किया जा सकता है के रूप में अणुओं weit द्वारा बताया गया हैजेड समूह 21। जब जीवी झिल्ली में एक झिल्ली प्रोटीन की प्रविष्टि वांछित है, प्रोटीन पर सह मौजूदा तेल अणुओं के प्रभाव पर विचार किया जाना चाहिए। अन्य सीमा मात्रा अंश की भिन्नता है। इस अध्ययन में, हम अनुमान है कि जीवीएस में microspheres की मात्रा भिन्न 4-30 खंड% से लेकर; मात्रा भिन्न जीवी तैयारी के लिए इस्तेमाल भीतरी जलीय घोल की मात्रा अंश के समान नहीं थे। यद्यपि हम एक मात्रा अंश माइक्रोस्कोपी अवलोकन के लिए पर्याप्त उच्च पर जीवीएस में microspheres encapsulate करने में सक्षम थे, इस विधि में एक समान मात्रा अंश वितरण के साथ जीवीएस की तैयारी के लिए उपयुक्त नहीं है। यह बताया गया है कि microsphere मात्रा भिन्न का वितरण centrifugation 34 के दौरान परिवर्तन किया गया है।
w / ओ पायस centrifugation विधि सामान्यतः समझाया सामग्री युक्त जीवीएस के गठन के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, कुछ रिपोर्टों पी का वर्णन किया हैmicroscale सामग्री 34, 42 encapsulating जीवीएस की मरम्मत। हाल ही में, आणविक एक समझाया डीएनए डिवाइस या एक आणविक युक्ति युक्त रोबोट, 44 43 निर्माण किया गया है। डिब्बों के साथ जीवीएस आवेदनों की इन प्रकार के लिए पहली पसंद हैं; इसलिए, हमारे जैसे तकनीक, कि विविध सतह functionalization के साथ चुंबकीय microspheres और microspheres encapsulating के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उपयोगी 44 होने की उम्मीद की जा सकती।
Disclosures
लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।
Acknowledgments
हम यह आंकड़ा 1 में योजनाबद्ध छवि ड्राइंग के लिए भुनगा यामागुची धन्यवाद। इस अध्ययन में प्राकृतिक विज्ञान के theNational संस्थानों के एकीकृत बायोसाइंस के लिए Okazaki संस्थान के Okazaki ओरियन परियोजना (NINS) द्वारा समर्थित किया गया था; Astrobiology केंद्र परियोजना NINS की (। कोई AB281010) द्वारा; (। कोई 25102008) विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी की ओर से अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक रिसर्च (एकीकृत कार्य के निर्माण के लिए biomolecular सिस्टम के Dynamical आदेश देने) के लिए एक ग्रांट-इन-एड (JSPS) द्वारा; युवा वैज्ञानिकों के लिए एक ग्रांट-इन-एड (बी) के द्वारा (केके करने के लिए, 15K17850 नहीं।) JSPS से; andby एक ग्रांट-इन-एड अनुसंधान गतिविधियों शुरू के लिये (YN करने के लिए, नहीं। 15H06653) JSPS से। अतिरिक्त समर्थन नोगुची संस्थान, कला और विज्ञान के लिए काओ फाउंडेशन से अनुदान, और Kurita जल और पर्यावरण फाउंडेशन से अनुदान से अनुदान द्वारा प्रदान किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
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