Abstract
Den konstruktive biologi og syntetisk biologi tilnærming til å skape kunstig liv involvere bottom-up montering av biologiske eller ikke-biologiske materialer. Slike tilnærminger har fått stor oppmerksomhet i forskning på grensen mellom levende og nonliving saken og har blitt brukt til å konstruere kunstige celler i løpet av de siste to tiårene. Spesielt har Giant vesikler (Gvs) ofte blitt anvendt som kunstige cellemembraner. I denne artikkelen beskriver vi utarbeidelse av GVS innkapsle svært pakket sfærer som en modell av celler som inneholder kondenserte biomolekyler. De Gvs ble fremstilt ved hjelp av en enkel vann-i-olje-emulsjon sentrifugeringsmetoden. Nærmere bestemt ble en homogenisator brukt til å emulgere en vandig oppløsning inneholdende materialet som skal innkapsles og en olje som inneholder oppløste fosfolipider, og den resulterende emulsjon ble lagt forsiktig på overflaten av en annen vandig oppløsning. Den lagdelte Systemet ble deretter sentrifugert to generere GVS. Denne kraftige metoden ble brukt til å kapsle materialer fra små molekyler til mikrosfærer.
Introduction
Den konstruktive, eller syntetisk, biologi tilnærming er en fascinerende avenue for å utforske grensen mellom levende og ikke-levende materie. Fordi cellen er minimum enhet er nødvendig for liv slik vi forstår nå det, ulike forskere har forsøkt å konstruere kunstige celler fra enkle, godt forstått kjemikalier slik at fenomener som oppstår i slike kunstige celler kan studeres, med det endelige målet med å belyse livets opprinnelse og studere de grunnleggende funksjonene i levende celler 1, 2, 3. Spesielt blemmer 4, som er sfæriske microcompartments laget av amfifile molekyler og kan innkapsle biologiske molekyler, slik som proteiner, 5, 6 og DNA-7, 8, 9,lass = "xref"> 10, har ofte blitt brukt som modeller av biologiske membraner.
Vesiklene kan klassifiseres som små (definert som å ha en diameter på <100 nm), store (diameter <1 um), eller giant (diameter> 1 um). Giant vesikler (Gvs) er blitt studert i stor utstrekning, fordi de ligner på levende celler i størrelse, form og struktur. På grunn av størrelsen på Gvs kan morfologiske forandringer i GV membraner lett kan observeres i sann tid under et optisk mikroskop.
Flere fremgangsmåter for fremstilling av Gvs har blitt rapportert 11, inkludert det hydrering metode 12, 13, fryse-tine-metoden 14, den electroformation metode 15, 16, og den fluidiske enheten fremgangsmåten 17, 18. Imidlertid innkapslende proteiner og andre MACROMolecules i GVS ved høye konsentrasjoner ved hjelp av disse metodene er vanskelig. Spesielt er det ekstremt vanskelig å innkapsle biologisk materiale i tilstrekkelig mengde (20-30 vol%) for å etterligne den overfylt miljø inne i cellene 19, 20. For å danne Gvs umiddelbart, Weitz og medarbeidere etablert en vann-i-olje (w / o) emulsjon sentrifugeringsmetoden 21, 22. Denne metoden har fem viktige funksjoner. For det første fordi Gvs fremstilt ved denne metoden har lav lamellarity 23, 24, deres membraner er så tynne at de kan deformeres lett. GV membran deformasjon fremkalt av FtsZ (en bakteriecelledelingen protein), tubulin, og andre makromolekyler er blitt studert 25, 26, 27, 28, og vi har observert polyhe Dron lignende deformasjoner av GV membraner indusert ved innkapsling av mikrokuler 29, 30. For det andre, kan membranproteiner settes inn i vesikulær membranen ved denne fremgangsmåten, om enn med vanskeligheter 31. For eksempel, den Yomo gruppen brukt denne metoden til å studere in vitro syntese og pore-dannende aktivitet av membranprotein α-hemolysin 32. For det tredje er det mulig å generere asymmetriske Gvs hvori lipidkomponentene i de indre og ytre brosjyrer er forskjellige 22. For eksempel Whittenton et al. genererte asymmetriske GVS med kationiske lipider i indre pakningsvedlegget å kapsle negativt ladet polynukleotider, og med nøytrale lipider på den ytre pakningsvedlegget for å redusere toksisitet og uspesifikke cellulært opptak 33. For det fjerde kan konsentrasjonen og volumfraksjonen av stoffene inne i Gvs være relativt høys = "xref"> 28, 34. Femte, kan flere typer materialer som skal innkapsles 35. For eksempel, Nishimura et al. innkapslet en in vitro transkripsjon-translasjonssystem i Gvs og brukes i systemet for å gi uttrykk for grønt fluorescerende protein (GFP) i Gvs 36. Disse fem funksjonene gjør w / o emulsjon sentrifuge en uunnværlig metode for generering av celleligne GVS.
I tidligere arbeid, ble Gvs generert ved sentrifugering oppsamlet ved hjelp av en sprøyte utstyrt med en lang 16 G nål av rustfritt stål inneholdende noe av den endelige vandige oppløsning 22. I hendene på uerfarne teknikere, kan denne metode for å hente lett resultere i forurensning av GV med noe av oljen. I denne studien har vi brukt w / o emulsjon sentrifugering protokoll utviklet av Yomo gruppen 23, 37,hvori utfelte Gvs samles gjennom et hull åpnet i bunnen av sentrifugerøret i hvilket de er fremstilt. Vi forberedte GVS innkapsle 1,0 mikrometer mikrosfærer, som er omtrent samme størrelse som intracellulære organeller. Anvendelse av mikrokuler tillot oss å beregne konsentrasjonen ved beregning av deres volumfraksjon. Etablering av en metode for utarbeidelse av GVS hvor materialene er tettpakket er et viktig skritt for å skape kunstige celler. For å bekrefte nytten av vår protokoll for ulike typer indre materialer, vi også vist at GFP og et lite vannløselig fluorescerende molekyl (uranine) kunne innkapslet i GVS.
Protocol
1. Fremstilling av Gvs av W / O-emulsjon sentrifugeringsmetoden
- Forbered en stamløsning av 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfokolin (DOPC, 25 mm) og en stamløsning av Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine, trietvlammoniumsaltet (Texas Red DHPE, 0,20 mM) i kloroform og lagre stamløsninger ved -20 ° C.
- Forbered en oljeløsning.
- Dannelse av en lipid film på den indre overflate av en 5 ml glassampulle ved fordampning av en blanding av DOPC løsning (51,0 ul og Texas Rød DHPE stamløsning (19,2 mL) under strømmende nitrogengass.
- Inkuber filmen under redusert trykk over natten og deretter legge til 1,0 ml flytende parafin (0,86 til 0,89 g / cm 3) til flasken. Pakk hetteglasset inn i aluminiumsfolie og inkuber det ved 80 ° CO / N i ro. De endelige konsentrasjoner av DOPC og Texas Rød DHPE er 1,3 og 3,8 x 10 - 3 mM, Henholdsvis, og DOPC: er Texas Rødt DHPE molforhold 100: 0,3.
- Klargjør indre vandig dispersjon.
- I et 1,5 ml mikrorør lokk, blande 237,5 ul av en dispersjon av 1,0 um ikke-fluorescerende mikrosfærer (2,5 vol%) og 12,5 ul av en dispersjon av 1,0 um fluorescerende mikrosfærer (2,5 vol%); Dette tilsvarer en 95: 5 (v / v) forhold på ikke-fluorescerende til fluorescerende mikrosfærer.
- Legg 64 mg sukrose, etterfulgt av 125 ul Tris-bufret oppløsning (TBS, 1 M) og 875 pl deionisert vann. Den endelige volumfraksjon av mikrokuler er 0,5 vol%, og de endelige konsentrasjoner av Tris-HCl (pH 7,5) og sukrose er 0,1 og 0,15 M, respektivt.
- Vortex mikrorør i 30 sekunder og deretter sonikere det i 10 min.
- Klargjør den ytre vandig oppløsning.
- Etter fremstillingen av 10 ml av en Tris-bufret oppløsning (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M Glucose) i samme fremgangsmåte som indre vandige media, plasserer 1 ml av løsningen i et 1,5 ml lokkforsynte mikrorør. Vortex mikrorør i 30 sekunder og deretter sonikere det i 10 min.
- Forbered en w / o emulsjon som inneholder mikrosfærer.
- Bland 1 ml av oljeoppløsning (flytende parafin inneholdende DOPC og Texas Rød DHPE) med 300 ul av den indre vandige oppløsning i en 1,5 ml mikrorør.
- Emulgere de to komponenter i mikrorør ved hjelp av en mekanisk homogenisator (en agitator med blader som roterer ved høy hastighet) som opereres ved 10.000 rpm i 2 min ved RT.
- Fremskynde de GVS.
- Forsiktig lag 300 ul av w / o-emulsjonen på den øvre overflate av en ml av den ytre vandige oppløsningen ved 4 ° C i et 1,5 ml lokkforsynte mikrorør. Chill mikrorør i 10 minutter ved 4 ° C.
- Samle GVS.
- Umiddelbart etter avkjøling av mikrorør,sentrifuger det ved 18.000 x g i 30 min. Skaff utfelte GVS ved piercing bunnen av microtube med en tegnestift og samle en dråpe i et sterilisert 1,5 ml mikrorør.
- Fortynn utfelt GV dråpe 10-100 ganger etter volum med den ytre vandig løsning hvis de oppnådde GVS oppnås i mengder som er store nok til å gjøre observasjon vanskelig.
2. Mikros Observasjon av GVS
- Forbered mikros prøven.
- Plassere et klebemiddel inkubasjon skammer for in situ-polymerase kjedereaksjon og hybridisering (kammeret størrelse 9 mm x 9 mm x 0.3 mm tykk) på toppen av et mikroskop dekkglass.
- Ved hjelp av en mikropipette, innskudd 25 ul av den fortynnede utfelt Gvs på prøveområdet og straks sette et nytt dekkglass (ca. 0,15 mm tykt) på toppen av inkubasjonen kammeret.
- Rekord differensial forstyrrelser Contrast mikroskopi bilder av GVS.
- Record mikroskopi bilder av vesikler med et mikroskop (10X, 20X og 40X mål) er utstyrt med en 12V100WHAL-L halogenlampe.
- Gjennomføre fluorescens mikros observasjoner.
- Sett U-FBNA og U-FMCHE fluorescens speil heter i mikroskop. Monter enheter med 470-495 nm og 565-585 nm eksitasjon filtre, henholdsvis, og med emisjonsfiltre som sender 510-550 nm og 600-690 nm lys, henholdsvis.
Representative Results
W / o-emulsjon sentrifugeringsmetoden er vist fotografisk og skjematisk i figur 1. Det skjematiske bilde i figur 1 viser at det viktigste bestemmende faktor for suksess for denne metoden er at den spesifikke vekt av den indre vandige oppløsning må være større enn den for den ytre vandige løsning, slik at Gvs vil utfelles under sentrifugeringen. I tillegg er dannelsen av en lipid monolag på w / o grensesnittet krever at systemet kjøles i 10 minutter etter at emulsjonen er lagdelt på den ytre vandige oppløsning. Fordi Gvs form ved overføring av emulsjonsdråpene tvers av w / o-grensesnittet, må de osmotiske trykk i de indre og ytre vandige sjikt være de samme. Som et kontrolleksperiment, vi også fremstilt Gvs som ikke inneholder mikrokuler ved hjelp av fremgangsmåten vist i figur 1 og trinn 1.3, bortsett fra at den indre vandige oppløsningen varforberedt uten sfærer.
Samling av de utfelte Gvs etter sentrifugering er vist i figur 2. I tillegg til at den semitransparente fase på bunnen av mikrorør, vi også observert en hvit, uklar mellomfase i den ytre vandige oppløsning (figur 2a). Dette mellomfase var rik på samlinger av mikrokuler og olje, mens den nedre fase inneholdt Gvs. Derfor, etter piercing bunnen av mikrorør med en stift (figur 2b), oppsamlet vi bare den første dråpe (figur 2c), som inneholdt store mengder Gvs. Det er viktig å sørge for at ikke mer enn to dråper er samlet; Ytterligere dråper kan inneholde aggregater av mikrokuler og lipider, som vil resultere i en lavere tetthet av Gvs. Den oppnådde vesikulær dispersjon inneholdt ofte innkapslet materialer utenfor GVS fordi GVS Often brudd under sentrifugering. For å oppnå bare Gvs, en sorteringsmetode slik som dialyse, gelfiltrering, eller fluorescens-aktivert cellesortering bør velges på grunn av størrelsen på innkapslingsmaterialer. Hvis det er nødvendig for det formål som de utfelte Gvs skal brukes, kan de fortynnes med den ytre vandige oppløsning. I noen tilfeller utvidet mellomfasen til bunnen av røret, noe som tyder på at eventuelle vesikler som ble dannet ble holdt sammen av oljen.
Vi fikk differensialinterferensmikroskopi og fluorescens mikroskopi bilder av GVS uten sfærer (figur 3a, 3b) og med mikrosfærer (figur 3c -3 f). I samsvar med tidligere rapporter 23, 37, ble GVS med lav lamellarity formet av vår protokoll. Lipider konjugert med Texas Red DHPE, som avgir rødt Fluorescerendecence, ble brukt, slik at vesikkeldannelse kan være direkte bekreftes ved visualisering av den tynne membran. Av de 160 GVS at vi oppnådde, 55 innkapslede mikrokuler og 105 var tom, noe som gir et forhold på innkapsling av 34%.
Vi bestemmes volumfraksjonen (φ, vol%) av mikrokuler i Gvs ved hjelp av den følgende metode. Fordi hver GV inneholder dusinvis til flere hundre mikrosfærer, telle alle sfærer under en optisk mikroskop er utfordrende. Derfor blandet vi de ikke-fluorescerende 1,0 mikrometer mikrosfærer med en liten mengde av fluorescerende mikrokuler, som er manuelt tellet under den fluorescens mikroskop. Det totale antall (N) av innkapslede mikrokuler ble beregnet ved å multiplisere antall (n) av manuelt telles fluorescerende mikrosfærer med 20 (basert på den opprinnelige 95: 5 [v / v]-forhold på ikke-fluorescerende til fluorescerende mikrokuler). Verdien av66; Deretter ble estimert som Nv 100 / V, hvor v er volumet av mikrokulene, og V er volumet av den enkelte GV. Merk at estimering av N fra n gir opphav til tellefeil, og disse feilene må tas hensyn til ved beregning φ. Verdien av φ ble estimert fra N, som direkte ble beregnet som 20 n, og dette i sin tur resulterte i sannsynligheten for at fy nøyaktig representerer den sanne verdien er <50%. Faktisk, N svinger til dels rundt 20 n, så vi må vurdere det som 20 (n ± i), hvor jeg er feilen i n. Vi beregnet jeg, for at en sannsynlighet av n ± jeg kan være mer enn 50% oppnås på basis av en Poisson-fordeling. Vi beregnet i, som i sin tur tillater oss å beregne 20 (n ± i) og verdiene av66; som følger tellefeil for Gvs med diametre på 10 og 15 um (tabell 1). I henhold til denne fremgangsmåten, ble volumfraksjonen av mikrokuler i GV er vist på figur 3c estimert til å være 11 ± 3 vol%. Nøyaktigheten av den beregnede volumfraksjon var 10-30%.
Våre resultater tyder på at vi med hell innkapsles 1 mikrometer mikrosfærer i Gvs ved en høy volumfraksjon. Vi var også i stand til å kapsle inn andre materialer til 100 mol-% DOPC Gvs ved hjelp av samme ytre vandige oppløsning og den samme protokoll (figur 4). Nærmere bestemt ble Gvs inneholdende 0,1 um mikrokuler fremstilt fra en Tris-bufret oppløsning inneholdende 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M sukrose, og 0,5 vol% fluorescerende mikrosfærer ved hjelp av den protokoll som er beskrevet for Gvs inneholdende 1,0-mikrometer mikrosfærer ( Figur 4a). Etter protokollen beskrevet above, DOPC Gvs inneholdende GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sukrose, og 100 mikrogram / ml GFP, figur 4b) og Gvs inneholdende uranine (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sukrose, og 30 uM uranine, figur 4c) ble også fremstilt.
| n | N | φ (10 um diameter) | φ (15 um diameter) |
| 3 | 60 ± 20 | 6,0 ± 2,0 | 1.8 ± 0.6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8,0 ± 2,0 | 2.4 ± 0.6 |
| 5 | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3.0 ± 0.6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3.6 ± 1.2 |
| 10 | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5.9 ± 0,9 |
| 20 | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| 30 | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| en feil ble bestemt som beskrevet i teksten; n = antall manuelt telles sfærer; N = totalt antall innkapslede mikrosfærer. | |||
Tabell 1: Tall og volumfraksjonene (φ, vol%) av mikrosfære en. en feil ble bestemt som beskrevet i teksten; n = antall manuelt telles sfærer; N = totalt antall innkapslede mikrosfærer.
Figur 1: Flyt Ch kunst og skjematisk fremstilling av W / O emulsjon sentrifugeringsmetoden. (A) Olje oppløsning bestående av DOPC og Texas Rød DHPE (100: 0,3 molforhold) i flytende paraffin. (B) Indre vandig dispersjon bestående av sukrose og mikrosfærer i Tris-HCl-buffer. (C) Ytre vandig oppløsning bestående av glukose i Tris-HCl-buffer. (D) Blanding av 1 ml av oljeoppløsning og 300 ul av indre vandig dispersjon. (E) emulgering med en homogenisator (10000 rpm, 2 min). (F) w / o-emulsjon. (G) Lagdeling av 300 ul av emulsjonen på 1 ml av den ytre vandige oppløsning. (H) Utfelt Gvs like etter sentrifugering. (I) Skjematisk fremstilling av prinsippet for v / o-emulsjon sentrifugeringsmetoden. Den svarte pilen indikerer retningen av sentrifugal akselerasjon..jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Piercing av Micro. (A) Utfelt Gvs like etter sentrifugering (også avbildet på figur 1 H). Den røde ellipse indikerer dråpe av det utfelte GV dispersjon. (B) Piercing av microtube med en tegnestift. Pelleten inneholdende Gvs ble oppnådd ved å gjennombore microtube nær bunnen med en stift og samle dråper fra hullet. (C) Droplet av de utfelte GVS (indikert av den gule pilen) spredning fortynnet med den ytre vandig oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mikros Bilder av GVS. (A) Differential interferenskontrastmikroskopi bilde av en GV uten mikrokuler. Diameteren på GV var 10 um. Scale bar = 10 mikrometer. (B) Fluorescensmikroskopi bilde av en GV uten mikrokuler. Den røde fluorescens ble sluppet ut av Texas Red DHPE. (C) differensiell interferenskontrastmikroskopi bilde av en GV inneholdende mikrokuler. (D) Fluorescensmikroskopi bilde på 1,0 mikrometer mikrosfærer (YG karboksylat-mikrosfærer) inne i en GV. Antallet telles fluorescerende mikrokuler (n) var 6. Vi estimert feil (i = 2) basert på Poisson-fordelingen. Deretter beregnet vi antall indre sfærer (N = 20 (n ± i)) var 120 ± 40. Det ble beregnet atGV inneholdt 1,0 mikrometer mikrosfærer ved en volumfraksjon (φ = Nv 100 / V) på ca. 11 ± 3 vol%, hvor v er volumet av mikrokulene, og V er volumet av Gvs. (E) Fluorescensmikroskopi bilde av en GV membran. Den røde fluorescens ble sluppet ut av Texas Red DHPE. (F) Sammenslåtte bilde av bildene i panelene d og e. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Differential interferens kontrast og Fluorescensmikroskopi Bilder av GVS med ulike Encapsulated materialer. Differential interferens kontrast mikroskopi (øverst) og fluorescens mikroskopi (nederst) bilder avGvs inneholdende (a) 0,1 mikrometer mikrosfærer, (b) GFP, og (c) uranine. Skala barer = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Egenvektene til den indre vandige dispersjonsmediet og den ytre vandige oppløsningen må velges nøye. For v / o-emulsjon for å felle ut i det ytre vandige oppløsning under sentrifugering, må den spesifikke vekt av den indre vandige dispersjon medium være større enn den til den ytre vandige oppløsning. Vi har forsøkt å fremstille Gvs ved hjelp av indre og ytre løsninger uten sukker, men vi oppnådd ingen Gvs under disse betingelser, fordi den indre vandige løsningen ikke har nok masse til å krysse interferens mellom de to faser. Hvis det er en stor osmotisk trykkforskjell mellom de to oppløsningene, Gvs som utfelles i den ytre vandige oppløsningen kan krympe eller brudd. Derfor må det osmotiske trykket i og utenfor GVS være like. For å oppnå dette, brukes vi sukrose som et oppløst stoff i den indre vandige dispersjon og glukose som et oppløst stoff i den ytre vandige oppløsningen; både sukker var ved samme konsentrasjon. både saltss = "xref"> 22 og sukker 23, 35, 38 har vært brukt for slike formål, men sukker anvendes vanligvis fordi det er mindre toksiske og mer oppløselig enn salt. Imidlertid, hvis for mye sukker blir tilsatt, kan Gvs komme i kontakt med undersiden av dekkglass og kollaps. Det er flere strategier for å unngå dette. En strategi er å redusere den spesifikke vekt forskjellen mellom de indre og ytre vandige oppløsninger, slik at Gvs utfelles under milde betingelser; spesielt kan supernatanten av det utfelte GV dispersjonen utveksles med en oppløsning som er identisk til den indre vandige oppløsningen for å redusere muligheten for brudd vesikulært ved adhesjon til glasset som følge av oppdrift. En annen strategi er å forbelegget begge dekkglass med en tynn lipid film 29.
Riktig fremstilling og inkubering av emulsjonenviktig. Vi brukte flytende parafin for å fremstille oljeoppløsning. Mineralolje 26, 31, dodekan 21, 33, og squalan 33, er 39 også ofte brukt som oppløsningsmiddeloljer. Fordi disse materialene varierer i spesifikk vekt, viskositet og overflatespenning, forskjellig antall vesikler dannes selv når de samme sentrifugeringsbetingelser er benyttet 33. For å oppnå vesiklene med target-egenskaper, er det viktig å optimalisere egenvekt og viskositet av de indre og ytre vandige oppløsninger, så vel som den sentrifugale acceleration.For fremstilling av oljefasen, må forekomme inkubering ved høy temperatur og i en tørr miljø slik som en inkubator eller en dehydrator. I denne studien vi oppvarmet flytende parafin til 80 ° C for fullstendig å oppløse lipidet molecules.In Videre bør emulsjonenfremstilles bare etter behov og bør umiddelbart underkastet sentrifugering fordi det er ustabilt like etter at den er fremstilt og v / o-dråpene lett smelter sammen til hverandre. Emulsjonen kan fremstilles i store mengder ved sonikering, vortexblanding, eller tapping. Men ved hjelp av en homogenisator muliggjør hurtig fremstilling av store mengder av emulsjon og enklere emulgering i olje med høy viskositet. Det er også viktig at emulsjonen legges lagvis på den ytre vandige oppløsningen forsiktig og hurtig, og deretter avkjølt ved 4 ° C. For å forkorte tiden mellom emulgering og sentrifugering, kan den olje ytre vandig oppløsning system bli forhåndsavkjølt før emulsjonen er lagdelt på den, og hele systemet kan deretter sentrifugeres immediately.If den hvite uklarhet vises raskere eller langsommere enn vanlig, mekanisk homogenisator må skylles for å fjerne vaskemidler. I tillegg, før emulgering, må oljeoppløsning, indre vandig oppløsning, og emulgator være returned til romtemperatur.
Riktig sentrifugalakselerasjonen er også viktig. Ved sentrifugering ved 18 000 x g, var vi i stand til å forberede GVS med et enkelt interiør materiale innkapslet i en høy konsentrasjon. Når innkapslingen av flere materialer som er nødvendig, er det bedre å redusere sentrifugalakselerasjonen. For eksempel ble et actin monteringssystem innkapsling av syv forbindelser som oppnås med sentrifugering på mindre enn 350 x g 35. I tilfeller hvor sentrifugering er uønsket, kan Gvs oppnås ved justering av sukkerkonsentrasjonen, eller ved utfelling av emulsjonen under påvirkning av sin egen masse 38, 40, 41.
Den metode som er rapportert heri har to viktige begrensninger. Den ene er at oljemolekylene (parafin, i dette tilfellet) kan bli oppløst i GV membranen, slik det er blitt påpekt av Weitz gruppe 21. Ved innsetting av et membranprotein inn i GV membranen er ønsket, må effekten av ko-eksisterende oljemolekylene på proteinet bli vurdert. Den andre begrensningen er variasjonen av volumfraksjon. I denne studien, beregnet vi at volumandelene av mikrokuler i den Gvs varierte 4-30 vol%; volumandelene var ikke identiske med volumfraksjonen av den indre vandige oppløsning som anvendes for fremstilling GV. Selv om vi var i stand til å innkapsle mikrokuler i Gvs ved en volumfraksjon høy nok for mikroskopi observasjon, er denne metoden ikke egner seg for fremstilling av Gvs med en ensartet volumfraksjon fordeling. Det har blitt rapportert at fordelingen av mikrokulevolumfraksjoner endres under sentrifugeringen 34.
W / o-emulsjon sentrifugeringsmetoden er vanligvis brukes for dannelsen av Gvs inneholdende innkapslede materialer. Imidlertid har noen rapporter beskrev poppreisning fra GVS innkapsle mikroskala materialer 34, 42. Nylig har molekyl roboter som inneholder et innkapslet DNA-enhet eller en molekylær enhet er bygget 43, 44. GVS med avdelinger er førstevalget for slike programmer; derfor kan teknikker, for eksempel vårt, som kan brukes for innkapsling av magnetiske mikrokuler og mikrokuler med forskjellige overflatefunksjonalisering kan forventes å være anvendbare 44.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Tomoko Yamaguchi for tegning skjematisk bilde i figur 1. Denne studien ble støttet av Okazaki ORION prosjekt Okazaki Institute for Integrative Biovitenskap av theNational Institutes of Natural Sciences (nins); ved astrobiologi Senter Project (ingen AB281010.) av Nins; av en Grant-in-Aid for Scientific Research på innovative områder (Dynamisk bestilling av biomolekylære systemer for etablering av integrerte funksjoner) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP) (ingen 25102008.); av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (til KK, ingen 15K17850.) fra JSP; Andby en Grant-in-Aid for forskningsvirksomhet på Start-Up (for å YN, nei. 15H06653) fra JSP. Ekstra støtte ble gitt av en bevilgning fra Noguchi Institute, et stipend fra Kao Foundation for Arts and Sciences, og et stipend fra Kurita Vann og miljø Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
References
- Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
- Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
- Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
- Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
- Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
- Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
- Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L.
- Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
- Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
- Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
- Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
- Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683 (2016).
- Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
- Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).
- Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
- Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).
